FlowJo 中文实用手册

FlowJo中文实用手册

（软件版本：FlowJo7.6.5 2012/06/20 更新）

第一章 FlowJo简介......................................................................................................................................1\t\r ?

一、FlowJo对电脑配置的要求...............................................................................................................1\t\r ?二、FlowJo的安装过程(Windows).........................................................................................................1\t\r ?三、FlowJo的工作台...............................................................................................................................5\t\r ?第二章 FlowJo分析单标样本......................................................................................................................6\t\r ?

一、由原始数据生成单参数直方图的过程...........................................................................................6\t\r ?二、图形的输出和保存.........................................................................................................................10\t\r ?第三章 FlowJo分析多色标记样本............................................................................................................13\t\r ?

一、由原始数据生成二维点图的过程.................................................................................................13\t\r ?二、二维点图的设门原则.....................................................................................................................16\t\r ?三、多色标记分析说明.........................................................................................................................16\t\r ?第四章 FlowJo软件荧光补偿....................................................................................................................18\t\r ?

一、用FlowJo做荧光补偿并进行数据分析的步骤..............................................................................18\t\r ?二、FlowJo荧光补偿的具体步骤.........................................................................................................18\t\r ?三、双指数转换.....................................................................................................................................24\t\r ?第五章 FlowJo的批处理功能....................................................................................................................27\t\r ?

一、设门分析的批处理.........................................................................................................................27\t\r ?二、表格分析的批处理.........................................................................................................................32\t\r ?三、图形分析的批处理.........................................................................................................................35\t\r ?第六章 FlowJo分析细胞凋亡样本............................................................................................................43\t\r ?

一、细胞凋亡概述.................................................................................................................................43\t\r ?二、FlowJo分析凋亡数据的过程.........................................................................................................44\t\r ?三、凋亡数据结果分析.........................................................................................................................45\t\r ?

I\t\r ?

FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 support@flowjochina.com 400-680-5527

第七章 FlowJo软件分析细胞周期样本....................................................................................................47\t\r ?

一、细胞周期分析概述.........................................................................................................................47\t\r ?二、FlowJo分析细胞周期数据的过程.................................................................................................48\t\r ?三、细胞周期拟合的调整方法和步骤.................................................................................................51\t\r ?四、细胞周期结果分析.........................................................................................................................53\t\r ?

FlowJo中文实用手册II\t\r ?

杭州艾米绿生物科技有限公司 support@flowjochina.com 400-680-5527

FlowJo中文实用手册III\t\r ?

杭州艾米绿生物科技有限公司 support@flowjochina.com 400-680-5527

第一章 FlowJo简介

FlowJo是美国斯坦福大学Leonard Herzenberg（FACS机器的发明者）实验室在90年代研发的一款流式数据分析软件。FlowJo由于功能强大，简单易用，已经被领域内的科学家、实验室广泛引用；同时FlowJo也是各高影响力核心期刊引用最多的流式数据分析软件。

一、FlowJo对电脑配置的要求

1. PC电脑：

操作系统：Windows XP，Vista，Windows7 内存：512MB及以上

网络连接：使用试用序列号及联网序列号必需要有网络连接； 加密狗无需网络 2. 苹果电脑：

操作系统：OSX10.3或者更高版本 内存：512MB及以上

网络连接：使用试用序列号及联网序列号必需要有网络连接加； 密狗无需网络

二、FlowJo的安装过程(Windows)

? 请到我们的网站上下载最新版本：

http://www.flowjochina.com/content/download 1\t\r ?

FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 support@flowjochina.com 400-680-5527

在此，我们下载V7.6.5 为例

http://www.flowjochina.com/sites/default/files/7.6.5_X32.exe 将文件下载到桌面之后，就可以看到FlowJo安装程序图标。

? 双击FlowJo安装程序 ? 屏幕上出现解压进程窗口：

? 解压完成后出现安装窗口：

? 选择“NEXT”

2\t\r ?

FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 support@flowjochina.com 400-680-5527

1) X轴选择SSC（侧向散射，侧向散射的含义：它对细胞膜、细胞质和核膜的折射更为敏感，其散射强度几乎与细胞内颗粒结构的质量成近似直线关系，也就是说，细胞内颗粒结构越复杂，质量越大，其SSC越大；反之则越小）

2) Y轴选择FSC（前向散射，前向散射的含义：该值的大小与细胞的直径近似直线关系，也就说，对于不同的细胞，细胞越大，其FSC就越大；反之则越小） 3) 然后选择设门工具（矩形门

、椭圆门

、多边形门

、自动门

）中任意一个，在二维点图中选中淋巴细胞。

如下图所示: 图中用圆圈所选中区域为淋巴细胞

8\t\r ?

FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 support@flowjochina.com 400-680-5527

? 在图形窗口中双击选中的淋巴细胞，生成新的图形窗口。

1) 在X轴选择Cy5PE:CD4，Y轴选择Histogram， 2) 选择设门工具（区域门图中设门。

a. 双分门设门如下图所示：

、双分门

）中任意一个，在单参数直方

左边区域为CD4阴性细胞，右边区域为CD4阳性细胞

9\t\r ?

FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 support@flowjochina.com 400-680-5527

b. 区域门设门如下图所示：

左边区域为CD4阴性细胞，右边区域为CD阳性细胞

二、图形的输出和保存\t\r ?

a. 在单参数图上点击鼠标右键选择复制图片，可以把图片粘贴到

WORD或PPT中。

b. 在图形分析窗口菜单栏中选择“文件”并单击，选择下拉菜单中的“另

存为”，选择保存位置、重新命名文件名以及保存的文件类型（SVG、PNG、EMF、JPG）。

10\t\r ?

FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 support@flowjochina.com 400-680-5527

c. 在FlowJo工作台单击打开布局编辑器。

d. 在样本空间中，把淋巴细胞的节点拖入到布局编辑器中。

淋巴细胞节点如下图所示：

布局编辑器显示的单参数直方图如下图所示：

11\t\r ?

FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 support@flowjochina.com 400-680-5527

e. 在布局编辑器中点击保存按钮，在弹出的对话框中选择保存的

路径，更改保存的图片名称以及图片格式。 备注：

① 可以在图片名称后面直接输入需要保存的格式，比如命名并保存为：data001.JPG。可以保存的图片格式有：JPG, PNG, GIF, EMF, SVG, PDF。

② FlowJo默认的图片格式为PNG格式 f. 更改布局编辑器输出的默认图片格式的步骤：

① 到工作台的菜单栏中点击“编辑”菜单，在下拉列表中选择“偏好设置”，在偏好设置对话框中选择“文件格式”

② 点击在布局编辑器项目下拉按钮，选择需要的图片格式：

12\t\r ?

FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 support@flowjochina.com 400-680-5527

第三章 FlowJo分析多色标记样本

多色标记样本，包含双标记、三标记及以上的样本。多色标记样本分析的原则是把多色标记简化为单标记或双标记。多色标记样本在采集或数据处理过程中需要做荧光补偿。在FlowJo中的数据显示方式是二维点图。二维点图能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系，横坐标和纵坐标分别代表与细胞有关的两个独立参数，平面上的每一个点表示具有相应坐标值的细胞。一般来说可以由一个二维点图得到两个一维直方图，但是由于多个细胞具有相同二维坐标现象的存在，所以二维点图的信息量要大于两个一维直方图的信息量。二维点图在设十字门之后被分成四个区域，实验目的不同，各个区域所代表的含义不同。本手册提供参考的是三标记样本的分析步骤。只要灵活掌握分析技巧，根据实验需求学会把多色分析简化，这样就可以做到事半功倍的效果。

一、由原始数据生成二维点图的过程

原始数据：为FlowJo演示数据，选择3-color-experiment文件夹中的931115-B02-Sample01.FCS进行分析演示。

1. 打开软件，将“3-color-experiment”文件夹拖入FlowJo工作台。

2. 在样本空间中双击“931115-B02-Sample01.FCS”样本，出现图形窗口，显示为二维点图。X轴选择FSC，Y轴选择SSC。然后选择多边形设门工具在二维点图中选中淋巴细胞。如下图所示：

13\t\r ?

FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 support@flowjochina.com 400-680-5527

，

3. 双击淋巴细胞门，出现图形窗口，X轴选择Fluor::CD3，Y轴选择FSC。使用矩形设门工具

选中CD3阳性细胞，设门并命名为T细胞

14\t\r ?

FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 support@flowjochina.com 400-680-5527

4. 双击T细胞门，出现图形窗口，在X轴选择Cy5PE::CD4，Y轴选择PhyEry::CD8，使用十字门工具

设门，如下图所示：

Q1：CD8单阳性细胞，为CD8+ T细胞 Q2：双阳性细胞

Q3：CD4单阳性细胞，为CD4+ T细胞 Q4：双阴性细胞

四分门更改门位置的方法：

单击四分门“十字”的交点选中这个四分门，如下图所示。拖动鼠标将四分门移到目标位置。

15\t\r ?

FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 support@flowjochina.com 400-680-5527

二、二维点图的设门原则

二维点图常用四分门来设门，四分门设门要根据阴性对照界定阴性区。根据细胞分群的趋势，四分门的界定线可设在阴性、阳性细胞的分群处。

三、多色标记分析说明

多色样本分析在实验中具有重要的地位，很多用户对多色分析感觉无从下手。其实，流式分析中结果的显示一般都是一维和二维的。因此，在流式分析中无论是几色标记的样本，只要把多色的分析简化为单标记和双标记的分析，问题就会迎刃而解。

16\t\r ?

FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 support@flowjochina.com 400-680-5527

比如：检测TREG需要标记CD4/CD25/FOXP3，可以用SSC vs. CD4的二维点图，把CD4+的细胞圈出来。然后用CD25 vs. FOXP3的二维点图，把CD25+/FOXP3+的细胞表示出来。这样就可以把CD4+/CD25+/FOXP3+的TREG细胞辨别出来。上面的实例就是把三标记的样本转化为两个二维的点图进行分析。

FlowJo中文实用手册 17\t\r ?

杭州艾米绿生物科技有限公司 support@flowjochina.com 400-680-5527

第四章 FlowJo软件荧光补偿

在做多色流式实验的时候，荧光补偿是必需进行的步骤。FlowJo可以根据荧光补偿单染对照管的数据生成补偿矩阵，并可以对补偿矩阵进行调整。

一、用FlowJo做荧光补偿并进行数据分析的步骤

1. 在补偿编辑器中导入单染管的数据并生成荧光补偿矩阵 2. 将补偿矩阵应用到组，对组里面的所有数据进行荧光补偿 3. 对补偿过的参数轴启用双指数转换功能

二、FlowJo荧光补偿的具体步骤

如果荧光补偿单染对照的数据很好，阴性细胞群和阳性细胞群的分群很明显，只需要将单染管的数据导入FlowJo的补偿编辑器里，FlowJo能自动设门，界定出阴性细胞群和阳性细胞群，并计算出荧光补偿矩阵。操作非常简单，下面的4个步骤便可完成荧光补偿： 视频教程可以在线观看：

http://www.video.flowjochina.com/v75 Compensation_conv.html 1. 将数据拖入FlowJo工作台。

演示数据为：3 color comp数据，为三色实验的数据。Cy5PE comp.fcs, FITC

comp.fcs, PE comp.fcs为单染对照管数据；3-COLOR.FCS为样本数据，同时染了Cy5PE, FITC, PE

18\t\r ?

FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 support@flowjochina.com 400-680-5527

2. 到工作台菜单栏的“窗口”栏选择“打开补偿编辑器”，打开后如下图所示。点

击单染管对应的Sample列，在弹出的下拉列表中选择对应的单染管数据。比如在下图的例子中，在Flour单染管中导入FITC comp.fcs

19\t\r ?

FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 support@flowjochina.com 400-680-5527

3. 按照步骤2中的方法，在3个单染管中都导入对应的数据之后，FlowJo能自动

进行设门，界定出阳性细胞群和阴性细胞群，并计算出荧光补偿矩阵。如下图所示：

4. 将补偿矩阵应用到所有样本进行荧光补偿：在工作台的组空间中选中需要进

行荧光补偿的组，到补偿编辑器的菜单栏中选择“补偿 > 添加到组”，

对该组的所有数据进行荧光补偿，补偿过的数据前面带有所示：

20\t\r ?

FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 support@flowjochina.com 400-680-5527

标志，如下图

如果某个单染管的数据不是很理想(poor control )，FlowJo不能自动界定出阴性细胞群和阳性细胞群，比如下面的实例： 操作步骤：

1. 按照上面的步骤1,2,3操作之后，如果出现一些设门的意外情况的话，如此组

数据中：FlowJo没能自动界定出PE单染管的阴性细胞群和阳性细胞群。

21\t\r ?

FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 support@flowjochina.com 400-680-5527

1) 2)

单击选中工作台样本空间中PE单染管下的cw_Size节点，将其删除 右键单击补偿编辑器中的单染管出，点击“Clear”，将错误添加进去的单染管数据清除，如下图所示：

2. 将错误界定的细胞群以及错误添加到补偿编辑器的数据清除之后，我们需要

自己手动设门，界定出单染管的阴性细胞群和阳性细胞群，并手动将其添加到补偿编辑器。按以下步骤操作： 1)

在工作台样本空间中双击PE单染管，在FSC/SSC点图中，界定出目标细胞群（淋巴细胞）

22\t\r ?

FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 support@flowjochina.com 400-680-5527

2) 双击淋巴细胞群，打开图形窗口，X轴选择PhyEry::aCD8，Y轴选择Histogram ，选择区域门工具，界定出PE阳性和PE阴性细胞群，如下图所示：

备注：

a. 在设门的时候，选择区域门工具，阴性门和阳性门尽量设在细胞群分布的中心区域

b. 如果单染管的直方图没有明显的双峰，在设门的时候，阴性门和阳性门之间的距离应尽可能远一些

3) 将工作台样本空间的“PE-”节点拖到补偿编辑器里PE单染管的阴性孔，“PE+”节点拖到阳性孔里

23\t\r ?

FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 support@flowjochina.com 400-680-5527

3. 当所有单染管的数据都被添加到补偿编辑器后，FlowJo自动计算出补偿矩阵。

在工作台组空间中选择3-color comp组，然后到补偿编辑器的菜单栏中选择“补偿 > 添加到组”，对该组的所有样本进行荧光补偿。

三、双指数转换

补偿过的数据，由于减去了荧光溢漏值，会产生“0”和“负值”。如果使用Log轴（只能显示正值），“0”和“负值”会被压在坐标轴上。这时，我们需要采用“Logical”参数轴来显示。在FlowJo中，可以通过双指数转换功能实现。继续使用上一步骤产生的工作台，操作步骤如下（演示数据为3-color comp组中的3-COLOR.FCS）：

1. 在3-COLOR数据中设淋巴细胞门，双击淋巴细胞门，在打开的图形窗口中X轴选择CD3，Y轴选择CD8，会发现有细胞压在坐标轴上，如下图所示：图中gate1的范围很小，但却显示里面的细胞比例达到了35.1%，表明有很多细胞压在坐标轴上。

24\t\r ?

FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 support@flowjochina.com 400-680-5527

2. 在X轴和Y轴点击坐标轴边上的T按钮指数转换”，如下图所示：

，在弹出的下拉列表中选择“用双

3. 如果启用双指数转换之后，发现还有细胞压在坐标轴上，点击T按钮，选择“Change transform values”，打开设置转化值对话框。通过将“附加负十位”的值变大，或者将“宽度基底”的值变小，能将压在坐标轴上的细胞显示出来。

25\t\r ?

FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 support@flowjochina.com 400-680-5527

比如上面的例子中，将X轴的“宽度基底”值从“-10”调为“-30”，使压轴的细胞完全显示出来，如下图所示：

备注：

a. 双指数转换只是更改了数据呈现的方式，不会对数据本身做任何更改。 b. 任何FCS3.0数据都可以在FlowJo上做双指数转换，如果是FCS2.0的数据的话，如果不在机器上进行补偿操作，而是在FlowJo里补偿的话，也可以进行双指数转换。

26\t\r ?

FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 support@flowjochina.com 400-680-5527

第五章 FlowJo的批处理功能

演示数据：Titration Data，一个抗体滴定实验的数据，CD8单染。Sample 1为对照组，Sample 2 ~ Sample 8所加的抗体浓度按照2倍的梯度递减。

一、设门分析的批处理

1. 设门

在工作台中 双击阴性对照的数据Sample 1，用自动门工具设淋巴细胞门，

27\t\r ?

FlowJo中文实用手册 杭州艾米绿生物科技有限公司 support@flowjochina.com 400-680-5527

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/anl7.html