Intermedin预处理对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的相关修复基因的作用

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I n t e r m e d i n预处理对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的相关修复基因的

影响

【本项目系国家自然科学基金（30971380）和山西省科技攻关项目

（20080311061-6）资助】

摘 要

垂体中叶素Intermedin（IMD）是2004年发现的降钙素相关肽（CGRP）超家族成员，是重要的内源性心血管、肾脏保护因子，在肾脏有很高的分泌，可增加肾血流、尿量，降低肾血管阻力，但其对肾脏的保护机制尚不清楚。本研究采用基因转染的方法使肾组织局部高表达IMD，观察IMD预处理对肾脏I R I修复再生过程中相关修复基因的表达的影响，探讨IMD对肾脏I R I修复过程的影响及机制。

目的探讨Intermedin(IMD)预处理对大鼠肾脏缺血再灌注损伤（IRI）修复再生过程中Vimentin等相关修复基因的影响。

方法健康雄性Wistar大鼠144只，随机分为假手术组、I R I组、转染空质粒组和转染I M D组。动物右肾切除后，用超声微泡技术将质粒转染入左肾，一周后制作肾脏I R I模型。分别于再灌注1d、2d、3d、4d、7d和14d留取肾组织标本。RT-PCR法检测肾组织Pax-2、ZO-1、Ncam、Wt-1和Vimentin的mRNA表达变化；Western blotting法分析Pax-2、Wt-1和Vimentin蛋白表达变化；ELISIA法检测ZO-1、Ncam的蛋白表达变化。

结果（1）IRI组大鼠Pax-2 、Zo-1、Ncam 、Wt-1和Vimentin在IRI后1d到3d 明显表达增加，与假手术组相比具有显著的统计学差异（P<0.01）。4d后基本恢复（P>0.05）。（2）转染IMD组，在IRI后1d到4d的Pax-2 、Zo-1、Ncam 、Wt-1和Vimentin表达均显著高于同时间点其它3组，与其它3组分别比较均有统计学意义（P<0.01）。（3）IRI组、转染空质粒组和转染IMD组三组上述基因的7d、14d表达和正常组相比差异无统计学意义（P>0.05）；IRI组和转空质粒组4d的表达较正常组增高，但无统计学意义（P>0.05）。（4）IRI组和转染空质粒组之间的差异均无统计学意义（P>0.05）。（5）运用RT-PCR检测上述指标的mRNA表达变化与运用western法或者ELISA法检测的蛋白表达变化趋势一致。

结论IMD预处理可通过增加肾脏组织修复基因Pax-2 、Zo-1、Ncam 、Wt-1和Vimentin的表达，从而对肾组织的修复和再生起到重要作用。

关键词再灌注损伤；Intermedin；Pax-2；Zo-1；Ncam；Wt-1；Vimentin

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山西医科大学硕士学位论文Effects of Intermedin pretreatment to repairing genes of rat with injured kidney by ischemia-reperfusion

Abstract

Objective To investigate effects of Intermedin (IMD) pretreatment to repairing genes such as Vimentin of the rats with injured kidneys by ischemia reperfusion injury (IRI) during the repair and regeneration process.

Method A total of 144 healthy male Wistar rats were randomly divided into 4 gourps:control group,IRI group,empty plasmid group (EP)and IMD group. After resection of right kidneys of the rats, plasmid was transfected into the left kidneys by using ultrasonic microbubble technology. After one week, we programmed the renal IRI models. We kept the samples of renal tissues after 1d, 2d, 3d, 4d, 7d and14d of reperfusion respectively, then we detected the changes of mRNA expression of the Pax-2, ZO-1, Ncam, Wt-1 and Vimentin of renal tissues by RT-PCR; analysised the changes of protein expression of Pax-2, Wt-1 and Vimentin by Western blotting and measured the changes of protein expression of ZO-1 and Ncam by ELISIA.

Results (1) Compared with the expression of protein in control group, the expression of Pax-2, Zo-1, Ncam, Wt-1 and Vimentin of the rats in IRI group increased significantly in 1d to 3d(P<0.01). After 4d, the kidney of the rats in IRI group returned to the normal level (P> 0.05).

(2) In IMD group, the expression of Pax-2, Zo-1, Ncam, Wt-1 and Vimentin were significantly higher than that in the other 3 groups (P <0.01) at the same time after IRI 1d to 4d. (3) It has no statistic meaning to compare the genes mentioned above in IRI group, EP group, IMD group with control group respectively(P> 0.05). It has no statistic meaning either to analysis the different expression between IRI group and EP group, though the expressions of the genes in IRI group and EP group increased compared with control group after 4d. (4) It has no statistic meaning to analysis the difference between IRI group and EP group (P> 0.05). (5) Changes of mRNA expression of genes mentioned above by RT-PCR are consistent with changes of protein expression by Western blotting or ELISIA.

Conclusions IMD pretreatment plays an important role in increasing the expression of repair related genes such as Pax-2, Zo-1, Ncam, Wt-1 and Vimentin during the process of repair and regeneration after renal ischemia reperfusion injury.

key words Reperfusion injury; Intermedin; Pax-2; Zo-1; Ncam; Wt-1; Vimentin

II

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主要缩略词表

缩写英文中文

ADM adrenomedullin 肾上腺髓质素

ARF acute renal failure 急性肾衰竭

AKI acute kidney injury 急性肾损伤

CGRP calcitanin gene-related peptide 降钙素基因相关肽

IMD intermedin 中介素

IRI ischemia/reperfusion injury 缺血再灌注损伤

ROS reactive oxygen species 活性氧族

VEGF vascular endothelial growth factor 血管内皮生长因子

MAPKS mitogen-activated kinase 丝裂原活化蛋白激酶

Ncam neural cell adhesion molecule 神经细胞粘附因子

WT-1 Wilm’s tumor gene-1 肾母细胞瘤基因-1

ZO-1 zone occludens-1 紧密连接蛋白-1

JNK Jun N- terminal kinase c-Jun氨基端激酶

ERK extracellular signal-regulated kinase 细胞外信号调节激酶

TGF-β1 transforming growth factor-beta1 转化生长因子-β1

RAAS renin-angiotensin-aldosterone system 肾素-血管紧张素-醛固酮系统CRLR calcitonin receptor-like receptor 降钙素受体样受体

RAMP receptor activity modifying protein 受体活性修饰蛋白

MCs Mesangial cell 系膜细胞

III

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学位论文独创性声明

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歉。

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论文作者签名：日期：年月日

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前 言

急性肾衰竭（acute renal failure, ARF）是一组以肾小球滤过率迅速下降为特征的临床较常见的重、危、急症，在重症监护病房（ICU）发生率为 3.4%~4.9%，且死亡率高达60.0%~70.7%[1]；普通人群发病率为2,000-3,000/106人/年（0.2-0.3%）[2]，且呈逐年上升的趋势。引起ARF的病因中，肾前性氮质血症和缺血性急性肾小管坏死约占75%，包括心血管疾病、脓毒症、创伤、休克、外科手术、脱水和器官移植等[3]。近些年来，尽管血液净化技术有了迅速的发展，但ARF的发生率和死亡率仍居高不下，存活的患者仍有很大一部分需要肾脏替代治疗维持生命[4]，部分ARF患者不经及时救治转为慢性肾衰竭。因此，对缺血性ARF的防治备受关注。

肾脏缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury, IRI）导致缺血性ARF，其发生机制复杂，涉及自由基、钙超载、活性氧代谢产物积聚、能量代谢障碍、内皮功能紊乱、炎症损伤、细胞坏死和凋亡等多种病理生理过程[5]。近年来研究相继发现了一些内源性小分子活性多肽，它们能够不同程度地清除自由基、改善能量代谢、保护内皮功能、改善微循环、抑制细胞坏死和凋亡等，从而减轻肾脏IRI[6]。其中，降钙素基因相关肽（calcitanin gene-related peptide，CGRP）超家族成员肾上腺髓质素（adrenomedullin, ADM）尤其受到关注。研究表明，它能有效减轻肾脏IRI，是重要的内源性保护物质[7,8]。ADM在体内分布广泛，作用于全身血管，舒张局部血管，降低血压，并可在多个系统发挥不同的生理作用。在肾脏，ADM可舒张肾血管、增加肾血流量(renal blood flow, RBF)、提高肾小球滤过率(glomerular filtration rate, GFR)，促进钠盐分泌，增加尿量。肾脏ADM由肾小球系膜细胞(Mesangial cell, MCs)产生，可通过环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)/蛋白激酶A(protein kinase, PKA)信号转导途径，抑制MCs增殖、促进调亡、抑制活性氧代谢；通过一氧化氮(nitric oxide, NO)途径介导抑制内皮细胞凋亡；在肾脏IRI时通过调节各种血管活性物质的比例，保护内皮功能，降低血管张力，增加血流灌注，改善肾脏功能[7,8]。

Intermedin(IMD)是2004年发现的CGRP超家族成员，其在结构和功能上与同家族的肾上腺髓质素(ADM)有许多相似性，又称为ADM2。IMD在肾脏表达和分泌较高，主要在皮质和髓质小管细胞，广泛分布于近端小管、远端小管和集合管，可增加肾血流量、尿量，降低肾血管阻力[9,10]。本研究组前期的研究表明，IMD可通过cAMP/PKA途径增加cAMP 水平，抑制NADPH氧化酶活性，减少ROS产生，同时上调SOD，减轻细胞氧化损伤，参与氧化与抗氧化平衡的调节，作为重要的内源性抗氧化物质实现其细胞保护作用[11]。但其对肾脏IRI修复的作用及机制国内外尚未见报道。在IRI诱导的肾损伤中，肾脏发生过程中的发育基因被再次激活，相应的蛋白质重新表达[12]。这些蛋白包括：间充质蛋白，如：Ncam、Wt-1及Vimentin等[13-15]；上皮细胞蛋白，如：Pax-2、ZO-1等[16,17]。这些基因在肾脏发生过程中大量表达，在正常人肾组织中通常表达量很少，但是在小管重建和再生过程中再次表达[17]，使得肾小管上皮细胞再生取代受损的上皮细胞，恢复肾小管的完整性。它们表达的增加说明其对损伤肾脏起到了修复的作用。有研究表明，ADM对一些修复基

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因（如VEGF、Zo-1等）的表达具有促进作用[18,19]，由此推测与ADM结构和功能非常相似的CGRP家族成员IMD也可以通过对相关修复基因表达的调控来促进肾小管上皮细胞的恢复和再生。

我们的实验通过建立IMD在肾脏局部高表达然后制作IRI模型，观察intermedin（IMD）预处理对大鼠肾脏IRI修复再生过程中相关修复基因的表达，揭示IMD对肾脏IRI的修复具有促进作用。为缺血性ARF的防治提供新的思路。

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参考文献

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材料与方法

1.材料

1.1实验动物

健康雄性Wistar大鼠144只，体重200-220g，购自山西医科大学动物中心。常规条件适应性喂养一周，自由进食和饮水，实验前禁食12h。

1.2 主要仪器、试剂

1.2.1主要仪器

MDF-U32V低温冰箱日本SANYO公司202-Q台式干燥箱北京市永光明医疗仪器厂Wellscan MK3酶标仪芬兰雷勃仪器厂DYY-11型电泳仪北京市六一仪器厂MVS-1漩涡混合器北京金北德工贸有限公司ZD-420A电热恒温三用水箱上海伊欧斯实业有限公司BS210电子分析天平德国塞多利斯公司PCR仪BIO-RAD公司尤尼柯UV-2802S紫外可见分光光度计杭州库仑科技有限公司UVP凝胶图像扫描仪BIO-RAD公司721分光光度计上海第三分析仪器厂普通离心机安新县白洋离心机厂BR16型高速冷冻离心机安新县白洋离心机厂TGL-16B高速台式离心机上海安亭科学仪器厂JY92-IID超声波细胞粉碎机宁波海曙科生超声有限公司超声治疗仪沈阳新圳医用电子仪器公司WP800TL23-K3微波炉格兰仕

液氮容器乐山市东亚机电工贸有限公司1.2.2主要实验用品

无创血管夹上海医疗器械有限公司1.2.3主要试剂

水合氯醛天津市光复精细化工试剂有限公司甲醛成都市科龙化工试剂公司DEPC水大连宝生物有限公司DNA Marker I 大连宝生物有限公司DNA上样缓冲液（6X）上海碧云天生物技术有限公司总RNA抽提试剂美国Invitrogen公司PCR引物美国Invitrogen公司

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RT-PCR试剂盒大连宝生物有限公司凯基全蛋白提取试剂盒凯基生物科技发展有限公司小鼠抗大鼠Wt-1多克隆抗体Santa Cruz Biotechnology,Inc 小鼠抗大鼠Vimentin多克隆抗体Santa Cruz Biotechnology,Inc 小鼠抗大鼠Pax-2多克隆抗体Santa Cruz Biotechnology,Inc 辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗Santa Cruz Biotechnology,Inc 硝酸纤维素膜北京索莱宝科技有限公司溴酚兰Sigma,U.S.A 甘油Sigma,U.S.A Tris Base 上海生物工程有限公司,中国丙烯酰胺上海生物工程有限公司,中国甲叉双丙烯酰胺上海生物工程有限公司,中国过硫酸胺上海生物工程有限公司,中国TEMED 上海生物工程有限公司,中国丽春红上海生物工程有限公司,中国IMD真核表达质粒武汉晶赛生物工程技术有限公司pcDNA3.1/myc-his B质粒武汉晶赛生物工程技术有限公司注射用六氟化硫微泡上海博莱科信谊药业有限责任公司1.2.4主要试剂配置

（1）PCR相关溶液配制

1）75%乙醇：无水乙醇和DEPC水按3:1的比例配制，抽提RNA时现配，-20℃保存备用。2）5×TBE缓冲液

Tris碱54g

硼酸27.5g

0.5M EDTA（pH=8.0）20ml

双蒸水定容至1000ml

使用前稀释10倍至0.5×

3）1‰DEPC水

DEPC 100ul

去离子水100ml

高压灭菌，室温放置备用。

4）10% EDTA-Na2

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EDTA-Na210g

双蒸水80ml

水浴加热至溶解

1mol/L NaOH调节pH值至8.0，定容至100ml。

5）10mg/ml溴化乙锭

溴化乙锭0.2g

水20ml

混匀后4℃避光保存。

（2）Western blotting相关溶液配制

1）考马斯亮蓝G-250（测蛋白用）

考马斯亮蓝G-250 100mg

95%乙醇50ml

85%磷酸100ml

2）10%过硫酸胺

过硫酸胺0.1g

去离子水 1.0 ml

4℃保存一周，也可一次称量多份过硫酸铵，装在EP管内，用时加入1.0 ml ddH2O即可。3） 1.0mmol Tris·CL（PH 8.8）

Tris 12.114g

去离子水（浓盐酸调PH后定容）至100 ml

4） 1.5 mmol /LTris·CL（PH 6.8）

Tris 36.342g

去离子水（浓盐酸调PH后定容）至200 ml

5）30%丙烯酰胺

丙烯酰胺29g

N,N-亚甲双丙烯酰胺1g

温热去离子水分别溶解

去离子水定容至100ml

滤纸过滤，贮于棕色试剂瓶中，4℃，保存数月。

6）电泳缓冲液（PH值8.3左右）

Tris-Base 3g

甘氨酸14.4g

SDS 1g

蒸馏水定容至1000ml

也可制成10×的贮液，室温下长期保存。

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7）转移缓冲液

Tris-Base 3g

甘氨酸14.4g

甲醇200ml

蒸馏水定容至1000ml

也可制成10×的贮液，室温下长期保存。注意贮液中甲醇应在用时现加。

8）考马斯亮蓝染液

考马斯亮蓝R-250 1.0g

甲醇450ml

冰醋酸100ml

9）考马斯亮蓝脱色液

甲醇100ml

冰醋酸100ml

蒸馏水800ml

10）10×丽春红染液

丽春红S 2g

三氯乙酸30g

磺基水杨酸30g

蒸馏水定容至100ml

使用时将其稀释10倍。

11）TBS缓冲液：

1mol/L Tris.Hcl(PH7.5) 10ml

Nacl 8.8g

蒸馏水定容至1000ml

12）TBST缓冲液：

20%Tween20 1.65ml

TBS 700 ml

混匀后即可使用，现用现配。

13）10％SDS：

SDS 10g

蒸馏水100 ml

50℃水浴溶解，室温保存。

14）20％Tween20：

Tween20 20 ml

蒸馏水100 ml

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混匀后，4℃，保存。

15）还原型2×SDS上样缓冲液：

1mol/L Tris·HCl（pH6.8）5ml

甘油10ml

10%SDS 20ml

溴酚蓝0.1g

混匀后取上述混合液12ml,加入1 mol/LDTT 3ml，分装，－20℃保存。

16）封闭液：

脱脂奶粉5g

TBST 100ml

溶解后4℃保存。使用时恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。最好现用现配。2实验方法

2.1 实验分组

健康雄性Wistar大鼠144只，质量200~220g，随机分为假手术组、IRI组、转空质粒组、转IMD组。

2.2 模型制作

10%水合氯醛（0.3ml/100g）腹腔注射麻醉，切除右肾，平衡10分钟，游离腹主动脉、左肾动静脉，同时取超声微泡造影剂（声诺维）1只，加生理盐水调节微泡混悬液浓度至45μg/ml，加入浓度为1μg/μl的IMD真核表达质粒/空质粒，轻柔混匀，夹闭肾静脉，肾动脉注射含质粒的超声造影剂（0.4ml，含IMD约50μg），肾脏变为白色，表明药物注射入肾脏，将探头置于肾组织局部，用超声治疗仪（频率为0.95MHz，声强1.8W/cm2）连续照射，总时间3min。用明胶海绵压迫止血，肾脏由白色变为鲜红色，表明肾脏恢复血供。成功转染1周后，腹腔麻醉，背部正中切口，钝性分离筋膜，用无创动脉夹夹闭左侧肾动脉，肾脏由鲜红色立刻变为苍白色，夹闭45min后恢复灌注，肾脏由暗红色逐渐变为鲜红色，缝合背部切口。分别于再灌注1d、2d、3d、4d、7d和14d留取肾组织标本。

假手术组只切除右肾，游离腹主动脉、左肾动静脉，关腹。

IRI组切除右肾后，游离腹主动脉、左肾动静脉，关腹。1周后制作IRI模型。

2.3 标本采集

肾组织标本：统一取左侧肾脏上极、下极分别以铝箔纸包裹，置于液氮中。上极用于Western Blotting检测Pax-2 、Wt-1和Vimentin 蛋白质变化，ELISA法检测Zo-1、Ncam蛋白质表达变化；下极用于RT-PCR检测以上指标mRNA变化。

2.4.半定量RT-PCR法检测肾组织P a x-2、Z o-1、N c a m、W t-1和V i m e n t i n mRNA表达变化

2.4.1样品前处理

为降低RNA降解的可能性，摘取肾脏组织，迅速放入液氮中备用。从液氮中取出样

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品，迅速称重约50mg。

2.4.2肾脏组织总R N A提取

采用RNA Plus抽提总RNA，具体操作步骤如下：

①将大鼠肾脏从液氮中取出，电子天平称取约50mg，置于研钵中研磨，同时加入1ml TRNzol-A+，研磨后收集入EP管，室温静置5min，4℃ 12000rpm4℃离心5min，弃液。

②按200 μl氯仿/ ml TRNzol-A+加入氯仿，振荡混匀15 s，室温放置3 min；

③4 ℃12 000 rpm离心15 min；

④吸取上层水相，按0.5 ml异丙醇/ml TRNzol-A+加入异丙醇，混匀，室温放置20-30 min；

⑤4 ℃12 000 rpm离心10 min，弃上清，RNA沉于管底；

⑥按1 ml 75%乙醇/ml TRNzol-A+加入75%乙醇，温和振荡EP管，悬浮洗涤沉淀；

⑦4 ℃ 5 000 rpm离心3 min，尽量弃上清，室温晾干或真空干燥5-10 min（RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解）。

⑧20 μl TE buffer 充分溶解RNA样品，其A260/A280值>1.8认为RNA纯度符合要求；

⑨测定OD260，按1个OD260值相当于40 μg/ml RNA计算RNA浓度：

总RNA浓度＝OD260值×40 μg/ml×稀释倍数（一般稀释100倍）

注：总RNA沉淀可以保存在75%乙醇中，2-8 ℃保存一周，-20 ℃冻存一年。

2.4.3 PCR引物设计

根据Gene Bank中大鼠Pax-2、Zo-1、Ncam、Wt-1和Vimentin的cDNA序列和PCR 引物设计原则，利用计算机引物设计软件“Premier Primer 5”、“Oligo 6”进行引物设计和评价(引物序列见表1)。

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表1：引物序列及扩增片段长度

基因

引物序列

产物长度（bp ）

退火温度 （℃）

上游5’-AAAGGA TGGGGAACCCATAG-3’ Ncam

下游5’-TAGGTGATTTTGGGCTTTGC-3’

195

59.7

上游5’-CGGTGAGAAGAGGAAACGAG-3’ Pax-2

下游5’-GCTTGGAAGACA TCGGGATA-3’

246

58.7

上游5’-AGA TCGATGTGGACGTTTCC-3’ Vimentin

下游5’-CACCTGTCTCCGGTATTCGT-3’

206

58.1

上游5’- GCCTTCACCTTGCACTTCTC-3’ Wt-1

下游5’-GACCGTGCTGTATCCTTGGT-3’

186

58.7

上游5’-TGCTCCAGCAGGTCCTAAGT-3’ Zo-1

下游5’-TGGTAGCTGAGGGCAGAACT-3’

191

60.0

上游5’-CCCTTCATTGACCTCAACTACA TGC-3’ GAPDH

下游5’-CCCTTCATTGACCTCAACTACA TGC-3’

318

57.8

2.4.4 两步法RT-PCR 及半定量 2.4.4.1第一步：RT 反应

⑴ 反应体系 (20μl) 5×Primescript TM Buffer

4 Primescript TM RT Enzyme Mix 1 1 Oligo dT Primer (50 μM) 1 Random 6 mers (100 μM) 1 RNase Free dH 2O 8 Total RNA 5

⑵ 反应条件 37℃ 15min

85℃ 5s 4℃

5min

2.4.4.1第二步：PCR 反应

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⑴ 反应体系 (20μl) TaKaRa Taq (5 U/μl) 0.2 110×PCR Buffer (Mg 2+ Plus) 2 Mgcl 2(25mM)*1

1.2 dNTP Mixture (各

2.5 mM) 1.6 模板DNA （λDNA ）*2 2 引物1（20μM ） 0.4 引物2（20μM ） 0.4 灭菌蒸馏水 12.2

⑵ 反应条件 94℃ 3min 94℃

30s 退火温度X （见表1） 30s 30个循环

72℃ 1min 72℃ 5min 4℃

5min

2.4.5琼脂糖凝胶电泳与半定量分析

所有目的基因PCR 产物行2.0%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色；UVP 凝胶图像扫描系统对扩增产物电泳条带进行密度扫描，以大鼠GAPDH 为内参照，mRNA 的相对表达量以目的基因与相应GAPDH 的光密度值比值表示。

2.5 W e s t e r n b l o t t i n g 检测肾组织P a x -2、W t -1和V i m e n t i n 蛋白表达变化 2.5.1 肾组织蛋白提取

⑴ 凯基全蛋白提取试剂盒组份

Lysis Buffer 100ml 磷酸酶抑制剂 500μl 蛋白酶抑制剂 100μl PMSF(100mM) 1000μl

⑵ 蛋白提取步骤

① 在每ml 冷Lysis Buffer 加入5μl 磷酸酶抑制剂，1μl 蛋白酶抑制剂和5μl 100mM PMSF ，混匀，冰上保存数分钟待用；

② 每100mg 固体组织置于塑料试管中，加入1ml 冷Lysis Buffer ，超声波细胞粉碎器上匀浆15次，注意低温操作；

③ 取组织匀浆液转移到1.5ml 预冷的离心管，10000rpm ，4℃离心5min ；

④ 取上清液转移至新的预冷的离心管中，即为全蛋白提取物，蛋白定量（Bradford 法、BCA 法）；

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⑤分装保存于-70℃，避免反复冻融。

2.5.2 Bradford法测定蛋白浓度

⑴ 绘制标准曲线（见表2）

表2 Bradford法测定蛋白浓度标准曲线加样表

编号BSA(1mg/ml) 生理盐水考马斯亮蓝G-250 浓度(mg/ml)

1 60μl 0μl 3ml 1

2 48μl 12μl 3ml 0.8

3 36μl 24μl 3ml 0.6

4 24μl 36μl 3ml 0.4

5 12μl 48μl 3ml 0.2

6 6μl 54μl 3ml 0.1

7 0μl 60μl 3ml 0

以7号管调0，波长595nm，分光光度计测定各管OD值；用Excel软件绘制标准曲线，得出方程Y=？X 以及R2值（？为自动得出的方程系数）；OD值应落在0.06-0.3905之间，R2≥0.9线性关系较好。

⑵ 样品测定（见表3）

表3 Bradford法测定蛋白浓度加样表

样品样品量生理盐水考马斯亮蓝G-250

A 1.5μl 58.5μl 3ml

B 1.5μl 58.5μl 3ml

C 1.5μl 58.5μl 3ml

仍以上述7号管调0，波长595nm，分光光度计测定各样品管OD值，将所得值代入上述方程中，便得出稀释样品的蛋白浓度，乘以稀释倍数40即是样品蛋白浓度。

2.5.3 蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

⑴ 配制胶液

12%分离胶10ml，配方如下：

水 4.95 ml

30%丙烯酰胺 4.0 ml

1.5mmolTris（PH 8.8） 3.75 ml

10%SDS 0.1 ml

10%过硫酸胺0.1 ml

TEMED 0.004 ml

5%积层胶4ml，配方如下：

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水 2.7 ml

30%丙烯酰胺0.47 ml

1.0mmolTris（PH 6.8）0.5 ml

10%SDS 0.04 ml

10%过硫酸胺0.04 ml

TEMED 0.004 ml

注意加入TEMED后应即刻灌胶，以免聚合。

⑵ 制胶用长颈吸将配好混匀的分离胶液注入已夹好的电泳槽的两块玻璃板之间，达到一半后立即再加入2ml蒸馏水到胶液之上，以使胶液与空气隔离，避免胶聚合不完全。注意注水时应尽量轻，以免胶液与水混合使胶不均匀。室温下约40min分离胶聚合完全。待胶凝固后，用注射器将水抽出，弃去，用滤纸吸干；灌入积层胶到分离胶上，并插入梳子。注意梳子齿孔下不要留有气泡。1h后可将梳子轻轻拔出，将玻璃板放入架中固定，用注射器抽取电泳缓冲液将齿孔一一冲洗，以洗掉未聚合的丙烯酰胺。加电泳缓冲液，灌满内槽、外槽。

⑶ 加样每个泳道蛋白上样量均为100μg，与等体积的2xLoading buffer混匀后在沸水中煮5min，加入样孔。

⑷ 电泳恒压，积层胶60V，分离胶100V，溴酚蓝跑至胶底停止电泳。

⑸ 转膜提前1h将硝酸纤维素膜、两份6层滤纸、两块海绵垫用转膜缓冲液充分浸湿；将胶小心取出，把积层胶切掉。修剪滤纸和硝酸纤维素膜，滤纸应比胶稍小，膜应比胶稍大，避免两侧滤纸接触。转膜负极→正极顺序：海绵垫—6层滤纸—凝胶—硝酸纤维素膜—6层滤纸—海绵垫，排除气泡，转膜槽中充满转膜液，200MA恒流转膜。

⑹ 封闭5%封闭蛋白干粉液室温、摇床封闭3h。

⑺ 加一抗浓度均为1:100，4℃，孵育13h。

⑻ 洗一抗PBS洗10min + 5min。

⑼ 加二抗室温，摇床孵育1h。

⑽ 洗二抗PBS洗10 min + 5min，洗两次；PBST洗10 min + 5min，洗一次。

⑾ ECL显色加入E C L化学发光试剂，室温下膜反应1min，X线胶片曝光显影、定影。

⑿ Gel-pro图像分析系统分析吸光度，以?-actin灰度值为基础，测定各组的相对比值。

2.6E L I S A法检测Z o-1、N c a m蛋白表达

2.6.1标本处理

将每100mg固体组织置于培养皿中，手术剪剪碎成3mm×3mm左右的小块，加入0.5-1ml冷PBS液，用超声粉碎机进行粉碎5秒/次，间隙9.9秒反复5-8次；，收集于1.5ml EP管中，10000rpm，离心5min，将上清液收集于新的EP管中。

2.6.2操作步骤

⑴ 实验前将试剂盒和待测样本放置室温平衡，并确定本次检测所需的已包被抗体的酶

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标板孔数目。

⑵ 将标准品各100μl依次加入一排孔中，处理后的标本按100μl每孔加入，并做好标记。

⑶ 在标准品孔及待测样本孔中分别加入50μl酶联亲和物，充分混匀。

⑷ 37℃温育60分钟后充分弃尽各孔内液体，用稀释好的洗涤液反复冲洗5次并扣干孔内剩余水份。

⑸ 每孔依照次序，分别加入显色液A、B各50μl，充分混匀，在室温下避光反应15分钟。

⑹ 反应过后（正常情况下应为蓝色并带有明显的梯度）每孔加入终止液50μl，充分混匀（正常情况下应转变为黄色），终止反应。

⑺ 用酶标仪在450nm测定O D值。

2.6.3计算结果

⑴ 分别计算各标准品及待测样本的S/S0%数值，S=标准品或样本OD值，S0=上图所示S0点OD值。

⑵ 以标准品浓度作为横坐标，S/S0%数值为纵坐标，在对数坐标纸上绘制标准曲线。

⑶ 正常情况下所绘制出的标准曲线应为自上向下的一条直线。在绘制好的标准曲线图上查找每个样本所对应的浓度。

统计学分析

计数资料数据结果用x±s,表示，组间比较采用单因素方差分析，采用SPSS17.0软件进行统计学分析。

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结 果

1、IRI组大鼠肾组织上皮细胞蛋白Pax-2 、Zo-1和间充质蛋白Ncam 、Wt-1和Vimentin 在IRI后1d到3d表达明显增加（P＜0.01），与假手术组相比具有统计学意义。其中，1d明显增加，2d达到高峰，3d开始逐渐下降，4d后基本恢复（P >0.05）。

2、转染IMD组，在IRI后1d到4d的Pax-2 、Zo-1、Ncam 、Wt-1和Vimentin表达均显著高于同时间点其它3组，与其它3组分别比较均有统计学意义（P<0.01）。

3、IRI组、转空质粒组和转IMD组三组上述基因的7d、14d表达和正常组的差异无统计学意义（P>0.05）；IRI组和转空质粒组4d的表达较正常组增高，但无统计学意义（P>0.05）。

4、IRI组和转染空质粒组之间的差异均无统计学意义（P >0.05）。

5、正常组Wt-1不表达，IRI组及转空质粒组Wt-1在IRI后1d开始表达，2d达到高峰，3d开始下降，4d后消失；转染IMD质粒后，其1d、2d、3d和4d表达显著高于IRI组（P＜0.01），7d和14d消失。

6、运用RT-PCR检测上述指标的mRNA表达变化与运用western法或者ELISA法检测的蛋白表达变化趋势一致。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/alee.html