表达乙型肝炎表面抗原的重组CHO血清培养基的优化及生物反应器培

DOI：10.13200/j.cjb.2010.10.51.tengxn.008

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中国图书分类号Q813.1+1R392-33

中国生物制品学杂志2010年10月第23卷第10期ChinJBiologicalsOctober2010，Vol.23No.10文献标识码A

文章编号1004-5503（2010）10-1080-05

【预防制品】表达乙型肝炎表面抗原的重组CHO细胞无血清培养基的优化及生物反

应器培养

滕小锘

易小萍

孙祥明

张元兴

【摘要】目的优化表达乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的重组CHO细胞的无血清培养基，并进行生物反应器高密度培养。方法通过对现有重组CHO细胞无血清培养基SFMB的氨基酸、蛋白类激素、蛋白水解物等的优化，建立针对表达HBsAg的重组CHO细胞无血清低蛋白（<10mg／L）培养基SFMC。并利用此培养基在生物反应器中分批、流加、灌注悬浮培养重组CHO细胞，通过最大细胞密度和HBsAg产率评价不同的培养模式。结果SFMC与原培养基SFMB相比，使重组CHO细胞的最大细胞密度提高了20%，HBsAg表达量提高了25%。在生物反应器培养过程中，灌注培养的重组CHO细胞表达的HBsAg产率为0.70mg／（L·d），较分批和流加培养的0.30mg／（L·d）提高了约133%。结论养，可显著提高重组CHO细胞表达HBsAg的效率。

【关键词】CHO细胞；肝炎表面抗原，乙型；培养基，无血清；生物反应器

通过无血清培养基优化及生物反应器高密度培

OptimizationofSerum-freeMediumforRecombinantCHOCellsExpressingHBsAgandCultureinBioreactor

TENGXiao-nuo,YIXiao-ping,SUNXiang-ming,ZHANGYuan-xing（StateKeyLaboratoryofBioreactorEngi－neering,EastChinaUniversityofScienceandTechnology,Shanghai200237,China）

【Abstract】ObjectiveTooptimizeaserum-freemediumforhighdensitycultureofCHOcellsexpressingHBsAginbioreac－tor.MethodsSFMC,alow-protein（<10mg／L）mediumforCHOcellsexpressingHBsAg,wasdevelopedbyoptimizingthecompo－nentsinthecurrentlyavailableSFMBmedium,suchasaminoacids,proteinhormonesandpeptone,thenusedforbatch,fedbatchandperfusedsuspensionculturesofrecombinantCHOcellsexpressingHBsAginbioreactor.TheculturemodeswereevaluatedbythemaximumcelldensityandHBsAgyield.

ResultsComparedwiththosecultureinSFMBmedium,themaximumdensityofrecombi－

nantCHOcellsculturedinSFMCmediumincreasedby20%,whiletheHBsAgexpressionlevelincreasedby25%.Duringcultureinbioreactor,theHBsAgyieldinCHOcellsinperfusedculturewas0.70mg／（L·d）,whichincreasedbyabout133%ascomparedwiththoseinbatchandfedbatchcultures［both0.30mg／（L·d）］.ConclusionOptimizationofserum-freemediumandhighdensitycul－tureinbioreactorincreasedtheexpressionefficacyofHBsAginrecombinantCHOcells.【Keywords】CHOcells;Hepatitissurfaceantigen,B;Medium,serum-free;Bioreactor

我国约有1.2亿人为无症状乙型肝炎患者［1］。利用中国仓鼠卵巢细胞（CHO）生产的重组乙型肝炎疫苗具有比重组酵母乙型肝炎疫苗更好的免疫原性及阳转率，市场前景广阔［2-3］。但由于传统的生产工艺是在有血清的情况下，采用大型转瓶贴壁培养重组CHO细胞，生产效率低，较重组酵母表达的疫苗成生产过程中使用血清也对疫苗质量的本要高。并且，

稳定性产生了一定的影响，所以占市场份额相对较小［4］。本文对培养表达HBsAg的重组CHO细胞的无血清培养基进行优化，并进一步实现生物反应器高密度悬浮培养，以期提高重组CHO细胞的生产能力。

基金项目：国家科技重大专项（2009ZX09503-013）；上海市重点

学科建设项目资助（B505）.

作者单位：华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室（上海

200237）.

通讯作者：张元兴，E-mail:yxzhang@ecust.edu.cn

1.材料与方法

1.1细胞株

CHO-HBsAg基因工程细胞株由武汉生物制品研究所提供。

1.2主要试剂及仪器

HBsAg体外诊断试剂盒购自华美生物工程公HBsAg标准品购自深圳康泰生物工程有限公司司；

（为基因工程酿酒酵母表达的HBsAg）；葡萄糖分析（GOD-POD）试剂盒和尿素氮分析试剂盒购自上海捷门生物技术公司；乳酸分析试剂盒购自南京建成生物制品研究所；邻苯二甲醛（OPA）购自瑞士Fluka公司；DMEM和HamF12培养基购自Invitrogen公司；其他添加物均购自Sigma公司；反相高效液相色谱系统（HPLC1100）购自德国HewlletPackard公

200mm×2.1mm（Algient）；司，分析柱Aminoquant，

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1.5L搅拌式生物反应器为本实验室自行设计；5LCellisGenPlus哺乳动物细胞培养反应器为美国NBS公司产品。

1.3SFMB无血清培养基的配制及优化

SFMB无血清培养基以DMEM／F12为基础培养基，添加胰岛素、转铁蛋白、微量元素等多种成分，针对CHO-GS系统进行优化。

1.3.1氨基酸组分的优化：在100ml摇瓶中使用SFMB培养基分批培养重组CHO细胞，采用OPA柱前衍生的反相高效液相色谱系统检测0h和96h的氨基酸浓度，通过氨基酸浓度的变化确定优化的氨基酸添加量。

1.3.2蛋白类激素和蛋白水解物组分的优化：在100ml摇瓶中使用SFMB培养基分批培养重组CHO细胞，分别添加不同浓度的胰岛素和转铁蛋白（浓度分别为1、3、5、7、9mg／L），用血球计数板点样计数细胞，台盼蓝拒染法检测细胞的存活率，HBsAg诊断试剂盒检测HBsAg的表达量［5］，HBsAg标准品为基因工程酿酒酵母表达的HBsAg。

在不含蛋白水解物的SFMB培养基中分别添加不同浓度的PrimatoneRL及酪蛋白和酵母水解物，所有蛋白水解物均通过超滤，只保留相对分子质量5000以下的成分。在100ml摇瓶中分批培养重组CHO细胞，检测细胞的最大活细胞密度和HBsAg表达量。

1.3.3硫酸葡聚糖对重组CHO细胞影响的检测：在150ml转瓶中分批培养重组CHO细胞，在SFMB培养基中添加25mg／L硫酸葡聚糖（DS，相对分子质量5000），显微镜下观察CHO细胞的结团情况，另设未加DS的重组CHO细胞作为对照。1.3.4SFMB与SFMC培养基的比较：除了上述组分的优化外，还对微量元素、脂质体和维生素进行了优化，降低浓度或者去除了部分添加物（数据略），最终得到优化后的培养基SFMC。利用SFMB和SFMC在250ml摇瓶中分别分批悬浮培养重组CHO细胞，检测CHO细胞的最大细胞密度和HBsAg表达量。1.4生物反应器无血清悬浮培养重组CHO细胞1.4.1分批和流加悬浮培养：用本实验室自行设计的1.5L搅拌式生物反应器及O2、N2、CO2和空气4种气体调节控制系统分批悬浮培养和流加悬浮培养重组CHO细胞。初始培养体积均为600ml，溶解氧设定为50%，搅拌转速为50r／min。初始培养基使

葡萄糖浓度控制在用SFMC培养基。流加过程中，

7mmol／L。流加培养基由氨基酸浓缩液和1mmol／L

葡萄糖组成。取样时间12～24h。使用尿素氮分析

试剂盒和乳酸分析试剂盒测定培养过程中氨及乳酸

同时监测细胞密度和HBsAg的表达量。的含量［6］，

1.4.2灌注悬浮培养：使用5LCellisGenPlus哺乳

动物细胞培养反应器灌注悬浮培养重组CHO细胞。灭菌前加入200gDISK载体（FibraCelDisks，NBS）。接种时待细胞进入DISK载体后再补加剩余培养基至总培养体积3.6L，溶解氧设置为50%，搅拌转速为80r／min。pH值设定为6.8，通过通入CO2和4%的NaHCO3控制。初始培养基和灌注培养基均为SFMC。通过调整灌注速率保持培养体系中葡萄糖的浓度在7mmol／L。根据细胞生长时期的不同，取样时间为8～48h。在灌注培养过程中，由于细胞被DISK载体截留，细胞密度不能直接测得，但与同一时刻的葡萄糖消耗速率呈正相关，可通过培养过程中葡萄糖消耗速率的变化来反映细胞密度的变化趋势，从而推算出最大细胞密度。同时监测HBsAg的表达量。

2.结果

2.1SFMB无血清培养基的优化

2.1.1各种氨基酸的最佳添加浓度：试验结果显示，在无血清培养基培养重组CHO细胞的过程中，

蛋氨酸和苏氨酸3种氨基酸的利用率会随缬氨酸、

着其添加浓度的不同而发生变化，而其他种类的氨

基酸则不会发生变化。通过调整初始氨基酸浓度，更精确地测定了重组CHO细胞对氨基酸的利用，见图1。由此确定了优化的无血清培养基SFMC中各种氨基酸的最佳添加浓度，见表1。

2.1.2最佳蛋白类激素浓度和蛋白水解物组分：试验结果显示，当胰岛素和转铁蛋白浓度超过5mg／L后，对细胞密度和HBsAg表达量无明显促进作用，见图2，因此，确定SFMC中胰岛素和转铁蛋白的添加量均为5mg／L。未添加蛋白水解物和添加Pri-matoneRL与酵母水解物的混合物使CHO细胞最大细胞密度及HBsAg的表达量均下降了16%～20%，其他处理方式HBsAg的表达量无明显差异，见图3，

）的Primatone因此确定蛋白水解物为0.15%（w／w

RL。

2.1.3硫酸葡聚糖对重组CHO细胞结团的影响：试验结果显示，24h后对照组CHO细胞出现了严重的结团，而添加了25mg／LDS的重组CHO细胞120h后仍未出现明显的结团现象，见图4。2.1.4SFMC与SFMB培养基的比较：试验结果显示，在250ml摇瓶中采用优化的SFMC培养基培养重组CHO细胞时，最大细胞密度可达3.5×106个／ml，

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较SFMB培养基（2.9×106个／ml）提高了20%；SFMC培养基培养的重组CHO细胞HBsAg表达量可达1.5mg／L，较SFMB培养基（1.2mg／L）提高

了25%。

550500450400350300250200150100500

0h96h

为0.30mg／（L·d）；最大乳酸和氨浓度分别达45和5.3mmol／L，见图6。

最大活细胞密度（×106个／ml）4.0

3.83.63.43.23.02.82.62.42.22.0

胰岛素，细胞生长

HBsAg表达胰岛素，

转铁蛋白，细胞生长转铁蛋白，HBsAg表达

0

1

2

3

4

5

6

7

8

910

1.6

HBsAg浓度（mg／L）HBsAg浓度（mg／L）1.2

氨基酸浓度（mg／L）0.8

0.40.0

HiGlsArygAlaTyCyrs2ValMetTrpPhelleLeuAspGlAsunSerG（mg／L）胰岛素／转铁蛋白浓度

ln氨基酸

图2不同浓度的胰岛素和转铁蛋白对重组CHO细胞生长和HBsAg表达的影响

Fig2.EffectofvariousconcentrationsofinsulinandtransferrinongrowthofrecombianntCHOcellsandex－pressionofHBsAg

图1重组CHO细胞在培养过程中氨基酸的利用情况Fig1.ConsumptionofaminoacidsbyCHOcellsdur－ingculture

表1SFMC中各种氨基酸的浓度

Tab1.AminoacidconcentrationinSFMCmedium

氨基酸L-色氨酸

L-酪氨酸钠盐L-异亮氨酸L-亮氨酸L-缬氨酸L-精氨酸盐酸L-组氨酸L-半胱氨酸L-天冬酰胺L-天冬氨酸L-脯氨酸L-丝氨酸L-苏氨酸L-谷氨酰胺L-甲硫氨酸L-谷氨酸L-苯丙氨酸L-甘氨酸L-胱氨酸盐酸

浓度（mg／L）

38

22.50

4788362231182606.3534150603253562481220

最大活细胞密度（×106个／ml）43210

最大活细胞密度

HBsAg浓度

43210

+物RLLRLeRL解eRennnee水物oooatat白ton白aton解imatammi蛋水i蛋rrmmrii母加PPPPr酪Pr添1%.2%%.1%1%1%酵未.100..0000.0.RL+图3添加蛋白水解物对重组CHO细胞生长和HBsAg表达的影响

Fig3.EffectofadditionofproteinhydrolysateongrowthofrecombianntCHOcellsandexpressionofHBsAg

2.2在反应器中不同工艺无血清悬浮培养重组CHO细胞的比较

2.2.1分批和流加悬浮培养：重组CHO细胞在1.5L搅拌式生物反应器中分批培养76h，活细胞密度达最大值，为3.4×106个／ml，随后急速下降，见图5；最高HBsAg表达量为1.5mg／L，产率为0.30mg／（L·d）；最大乳酸和氨浓度分别为35和2.4mmol／L，见图6。而流加培养在140h时，总细胞密度达最大值，但在88h时活细胞密度开始显著下降，见图5；在整个流加过程中，最高HBsAg表达量为2.3mg／L，产率

A

B

A：添加25mg／LDS培养120h的细胞；B：对照组培养24h的细胞

图4硫酸葡聚糖对重组CHO细胞结团的影响（×100）Fig4.EffectofdextransulfateonmassformationofrecombinantCHOcells（×100）

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2.2.2灌注悬浮培养：重组CHO细胞在5LCellis－GenPlus哺乳动物细胞培养反应器中灌注悬浮培养，葡萄糖消耗速率在168h时达到最大值，并一直稳定到培养结束，见图7，经计算，最大活细胞密度达1×107个／ml；最高HBsAg表达量为0.5mg／L，产率为0.70mg／（L·d）；较分批和流加培养提高了约133%。

活细胞密度（×106个／ml）6543210

0

分批培养，总细胞密度

分批培养，活细胞密度流加培养，总细胞密度流加培养，活细胞密度50100150

培养时间（h）

3.讨论

无血清培养基中游离氨基酸的常规优化方法是

在含有一定浓度氨基酸的培养基中培养目的细胞，

检测培养前后氨基酸浓度的变化，并确定氨基酸的最终添加量［7］。由于细胞对氨基酸的利用率可能随着氨基酸本身浓度的变化而发生变化，因此适合的初始氨基酸浓度很难确定。本文首先确定了细胞对多种氨基酸的利用率随其浓度的变化趋势，然后再通过常规方法确定其消耗量，除去蛋白水解物中的氨基酸含量，便可确认游离氨基酸的添加量。蛋白水解物在低蛋白或无蛋白培养基中起着提供营养和激素类替代物的重要作用［8-9］。多种蛋白水解物的混合往往可以起到互补的作用［10］。本试验结果表明，单独添加PrimatoneRL已可满足蛋白表达的营养需

200

要，即使未添加蛋白水解物也仅仅使HBsAg的表达量下降了16%。这可能是因为培养基中添加的其他营养物质，如胰岛素、转铁蛋白、游离氨基酸和维生素等基本可以替代蛋白水解物，这为后续开发化学成分明确的培养基奠定了基础。硫酸葡聚糖是一种高度磺化的聚阴离子物质，可通过改变细胞表面的电荷促使单个细胞悬浮，有利于营养物质和氧的传递［11-12］，本文也证明了其对重组CHO细胞具有明显的效果。

本试验所用的细胞株构建于20世纪80年代，表现在生与现在主流CHO细胞株存在一定的差异，

长代谢方面为最大细胞密度偏低，细胞生长过程中会产生较多的乳酸和氨等代谢副产物，同时对副产物耐受能力相对较差。另一方面，由于SFMC是根据SFMB培养基优化而来，其营养结构组成尚未能达到最佳配比。在生物反应器中进行分批和流加培养时，CHO细胞达到稳定期后活性下降很快，难以实现较高的蛋白表达率。尤其对于流加培养，控制难度更大。而通过灌注培养的方式可有效降低培养环境中不利因素对细胞造成的影响，提高重组蛋白的产率［13-14］。本试验结果表明，灌注式培养的重组CHO细胞表达的HBsAg产率显著高于分批及流加培养。

通过针对性地对无血清培养基进行优化，提高其对某种重组细胞株的性能，是一种快速而有效地提高重组蛋白产率的手段。在此基础上，进一步研究适合细胞株代谢特点的培养工艺，使重组细胞能够

图5在1.5L反应器中分批和流加培养的重组CHO细胞的生长情况

Fig5.GrowthsofrecombinantCHOcellsinbatchandfedbatchculturesin1.5Lbioreactor

50乳酸浓度（mmol／L）4030201000

50

100培养时间（h）

150

分批培养，乳酸

流加培养，乳酸分批培养，氨流加培养，氨

10）氨浓度（mmol／L86420

200

图6在1.5L反应器中分批和流加培养重组CHO细胞过程中乳酸和氨浓度的变化

Fig6.Lactateandammoniaconcentrationsinbatchandfedbatchculturesin1.5Lbioreactor

葡萄糖消耗速率［mmol／（L·h）］2.0

1.81.61.41.21.00.80.60.4

50

100150200250300350400

培养时间（h）

在生物反应器上实现高密度、高表达培养，极大地提高了重组蛋白的产率。本研究为降低重组CHO细胞

乙型肝炎疫苗的成本，以及研究生物反应器高效率表达工艺奠定了基础。

（下转第1086页）

图7在5L反应器中灌注培养的重组CHO细胞过程中葡萄糖消耗速率的变化

Fig7.GlucoseconsumptionrateofrecombinantCHOcellsinperfusedculturein5Lbioreactor

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中国生物制品学杂志2010年10月第23卷第10期ChinJBiologicalsOctober2010，Vol.23No.10

有参加单位对国际参考品的病毒滴定结果均值为（3.96±0.08）lgCCID50／ml，在标定滴度的±0.2lgCCID50／ml范围之内，表明不同实验室的检

测方法及细胞具有一致性。

《中国药典》三部（2005版）要求：标准品一般需经3个有经验的实验室协作标定［3］。为使标定结果更具有代表性，国内所有风疹减毒活疫苗生产、检定相关实验室均参加了协作标定。除了一个实验室的标定结果无效外，其他实验室均得到有效结果。经协作标定，候选国家参考品病毒滴度为（4.56±0.52）lgCCID50／ml。

本参考品为冻干剂型，在4℃以下保存具有良好的稳定性。参考品的保存温度远低于市售疫苗的保存温度（参考品保存在-20℃），且在生产过程中增加了人血白蛋白，水分含量也更低，这些均有效增强了

本参考品在-20℃保其稳定性。稳定性分析结果表明，

存具有较好的稳定性，能满足长期存放的需要。

本参考品已通过专家审评，批准作为风疹减毒活疫苗病毒滴定国家参考品，批准文号为（2009）国生参字0032。

参考文献

［1］许青，徐爱强，宋立志，等.山东省实施儿童风疹疫苗免疫后风疹

发病年龄变化趋势的分析［J］.中华流行病学杂志，2005，26（11）:861-863.

［2］黄跃龙，李树民，唐蕊妍，等.国产冻干风疹减毒活疫苗免疫持久

性研究［J］.中国自然医学杂志，2004，6（2）：84-85.

［3］国家药典委员会.中华人民共和国药典（三部）［S］.北京：人民

卫生出版社，2005.

［4］WHO.WHOExpertcommitteeonbiologicalstandardization［S］.

TechnicalReportSeries,2005,932:88.

（收稿日期：2010-03-31）

（上接第1083页）参考文献

［1］黄正京，周脉耕，王黎君.中国肝癌死亡率和乙肝病毒表面抗原

携带率的地理分布研究［J］.疾病监测，2007，22（4）：242-245.［2］邓韶英，柯建厚，孙亚军，等.乙型肝炎基因重组疫苗免疫效果及

持久性观察［J］.实用预防医学，2005，12（6）：1321-1322.［3］何鹏，吴晓音，荆庆，等.两种重组乙型肝炎疫苗免疫儿童后的抗

.中国生物制品学杂志，2008，21（6）：体应答和免疫持久性［J］522-523，526.

［4］胡永华，黄惠琴.用基因工程手段生产HBsAg蛋白［J］.生物技

术通讯，2004，15（5）：513-515.

［5］LiJH,SunXM,ZhangYX.ImprovementofhepatitisBsurface

antigenexpressionbydimethylsulfoxideinthecultureofrecombi－nantChinesehamsterovarycells［J］.ProcessBiochem,2006,41（2）:317-322.

［6］ZhangL,ShenH,ZhangYX.Growthandmetabolismofhybridoma

.ChinJBiotechnol,cellsculturedinflaskandspinnerbottles［J］2000,16（3）:373-377.

［7］刘文献，贾茜，耿娅，等.分泌抗甲肝病毒基因工程单抗的rCHO

细胞无血清培养研究［J］.药物生物技术，2005，12（3）：148-151.［8］KimDY,LeeJC,ChangHN,etal.Developmentofserum-freeme－

diaforarecombinantCHOcelllineproducingrecombinantanti－body［J］.EnzymeMicrobTechnol,2006,39（3）:426-433.

［9］ChabanonG,AlvesdaCostaL,FargesB,etal.Influenceofthe

［J］.Biore－rapeseedproteinhydrolysisprocessonCHOcellgrowthsourTechnol,2008,99（15）:7143-7151.

［10］HeidemannR,ZhangC,QiH,etal.Theuseofpeptonesas

mediumadditivesfortheproductionofarecombinanttherapeutic.proteininhighdensityperfusionculturesofmammaliancells［J］Cytotechnology,2000,32（2）:157-167.

［11］KunouM,HatanakaK.Theeffectofgrowthfactorsonthecyto－

toxicityofsulphatedpolysaccharides［J］.CarbohydratePolym,1997,34（4）:335-342.

［12］张芳,张立,易小萍,等.表达重组蛋白的CHO-GS细胞的无血

清培养［J］.高技术通讯,2005,15（7）:73-78.

［13］LiL,MiL,FengQ,etal.Increasingthecultureefficiencyofhy－

bridomacellsbytheuseofintegratedmetaboliccontrolofglu－coseandglutamineatlowlevel［J］.BiotechnolApplBiochem,2005,42（Pt1）:73-80.

［14］FengQ,MLi,LiL,etal.Applicationof“oxygenuptakerate-aminoacids”associatedmodeincontrolled-fedperfusionculture［J］.JBiotechnol,2006,122（4）:422-430.

（收稿日期：2010-03-18）

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/ale3.html