发酵工程复习资料

发酵工程复习资料

发酵工程：利用微生物的生长和代谢活动来大量生产人们所需产品的过程理论与工程技术体系。

该技术体系主要包括菌种选育与保藏、菌种扩大生产、代谢产物的生物合成与分离纯化制备等技术集成。

发酵的本质

1、显微镜观察：微生物 2、 著名的巴斯德实验：微生物作用 3、著名的毕希纳实验：酵素（酶）的作用

本质：由微生物的生命活动所生产的酶的生物催化作用所致。

发酵动力学：是研究发酵过程中菌体生长、基质消耗、产物生产的动态平衡及其内在规律。

二.发酵工业菌种

一、工业上常用的微生物

1. 细菌

醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌、乳酸杆菌、枯草杆菌、丙酮丁醇梭菌、大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌 常用的细菌： 大肠杆菌

应用：对谷氨酸定量分析，生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸 乳酸杆菌

应用：乳酸、干酪、奶子酒、发面、泡菜、酸奶等的制作 枯草芽孢杆菌

应用：生产淀粉酶

2. 酵母菌

种类：酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母 红酵母、面包酵母

应用：生产酒精、啤酒、石油发酵脱蜡和制取蛋白质、生产脂肪

3. 霉菌

黑曲霉：应用：生产有机酸、生产淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶 黄曲霉:应用：酱油、酱类（淀粉酶）

米曲霉：应用：产糖化酶和蛋白酶、主要用于酿酒制曲和酱油制曲 土曲霉：应用：生产甲义丁二酸

毛霉：应用：可以产生蛋白酶，我国多用于豆腐乳、豆豉等的制作 根霉：种类：米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根霉

应用：酿酒

青霉：应用：生产青霉素、葡萄糖氧化酶

红曲霉：应用：用于南方红曲酒（女儿红）的生产；用于红色色素的生产、豆腐乳的生产等

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4. 放线菌：种类：龟裂链霉菌、金霉素链霉菌、灰色链霉菌、红霉素链霉菌

应用：各类抗生素。土霉素、四环素、链霉素、红霉素

5.未培养微生物

定义：指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养方法还未获得纯培养的微生物，其在自然环境微生物群落中占有非常高的比例，约为99％。

? 研究方法

1．模拟自然培养法: 原位培养、培养条件优化、 单细胞操作 2.宏基因组分析法

二、发酵工业菌种分离筛选

菌种选择的总趋势

? 野生菌→变异菌

? 自然选育→代谢控制育种

? 诱发基因突变→基因重组的定向育种 ?

1.分离的思路

? 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。

? 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。 ? 有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。 设计筛选方案时必须考虑两个要点： 1.选择性 2.灵敏度

2.新种分离与筛选的步骤

样品的采集——>样品的处理——>目的菌富集培养——>分离纯化——>性能测定 1.样品的采集原则：

（1）样品的来源越广泛，获得新种的可能性越大，特别是在一些苛刻的环境如：高温、高压、高盐等极端环境中。

（2）了解目标产物的性质和可能目标产物的微生物种类及其生理特征：

☆ 微生物在代谢上具有一定的规律，次生代谢在进化上后移，芽孢菌以上才有筛选意义。 ☆分离不同种类的微生物时，还要考虑微生物的生理特性。如：要筛选纤维素酶产生菌，要到富含纤维素的土壤中采样，如深林土壤。

采样的注意事项

1、采样时应尽可能保持相对无菌； 2、所采集的样本必须具有某种代表性；

3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等； 4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的；

5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长

2. 样品的处理

（1）物理方法： 热处理、膜过滤、离心法

（2）化学方法：通过在培养基中加入某些化学成分来增加特定微生物的数量。

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（3）诱饵法：将一些固体物质，如：石蜡、花粉、蛇皮、毛发等，加到待分离的土壤或水中做成诱饵，将期菌落长成后再进行平板分离，可获得某些特殊的微生物种类

3.富集培养

定义：就是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条件，以促使目标菌株大量繁殖，从而有利于分离它们。 方法：

（1）控制培养基的营养成分 （2）控制培养条件 （3）添加抑制剂

添加专一性抑制剂也可达到抑制不需增殖的微生物的目的.如土样悬浮液中加数滴10%酚可抑制霉菌和细菌的生长,而放线菌仍生长;又如添加青霉素,链霉素之类抗生素能抑制细菌的生长.

4.分离纯化

尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这—步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。

5.生产性能的测定

一、菌种分离的一般过程:

土样的采取→土样预处理→ 富集培养→ 菌种初筛-----菌种复筛----性能鉴定--菌种保藏 目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物。 二、目的微生物富集的一些基本方法

富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。 复筛

复筛是在初筛的基础上进一步鉴定菌株的生产能力的筛选，采用摇瓶培养，一般一个菌株重复3－5瓶（较优的菌株）培养后的发酵液采用精确的分析方法测定。 实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目） 文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌 采样（造纸厂）→80度30分钟处理 ↓

以1%CMC（羧甲基纤维素）为唯一碳源、pH10.5的平板上，培养3～4天，然后再平板上加入1%刚果红染色，Nacl脱色后选择有透明圈的菌落

从285个土样中获得62株:26株为组成型，36株为诱导型

实验题（或许会有用）：淀粉酶可以通过微生物发酵生产，为了提高酶的产最，请你设计一个实验，利用诱变育种方法，获得产生淀粉酶较多的菌株。①写出主要实验步骤。②根据诱发突变率低和诱发突变不定向性的特点预期实验结果。（提示：生产菌株在含有淀粉的固体培养基上，随其生长可释放淀粉酶分解培养基中的淀粉，在菌落周围形成透明圈。）

1.主要实验步骤：①将养好的生产菌株分两组。一组用一定剂量的诱变剂处理，另一组不处理做对照。②制备含淀粉的固体培养基。③把诱变组的大量菌株接种于多个含淀粉的固体培养基上，同时接种对照组，相同条件下培养。④比较两组菌株菌落周围透明圈的大小，选出透明圈变大的

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菌株。预期实验结果：①由于诱发突变率低，诱变组中绝大多数菌落周围的透明圈大小与对照组相同。②由于诱发突变不定向性，诱变组中极少数菌落周围的透明圈与对照组相比变大或变小 2.氨基酸产生菌的筛选

样品

预处理

初筛（除真菌）

在分离平板上生长获得多个单菌落

复印平板（copy 法） 平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸 对应到copy前相应位置，找到目的菌

落

u.v线杀死长好的菌落 再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂 培养后 产氨基酸菌落周围有生长圈 目的菌落进行液体培养，

对产物进行定量测定 筛选产物含量高的菌株

发酵工业菌株的鉴定：

通常把鉴定微生物技术分为四个不同的水平：

（1）细胞的形态和习性水平：例如用经典的的研究方法，观察细胞的形态特征、运动性、酶反应、营养要求和生长条件

（2）细胞组分水平：包括细胞组成成分如：细胞壁成分、细胞氨基酸库、脂类、醌类以及光合作用色素等的分析，所用的技术除常规的实验室技术外，还使用红外光谱、气相色谱和质谱分析等技术。

（3）蛋白质水平：包括氨基酸序列分析、凝胶电泳和血清学反应等技术 （4）基因或核酸水平：包括核酸分子杂交（DNA与DNA 、 DNA 与RNA）、（G+C）含量的测定、遗传信息的转化和转导、16SrRNA或18SrRNA寡核苷酸组分分析、以及DNA或RNA的核苷酸序列分析等。

三．发酵工业培养基设计

培养基：指用于维持微生物细胞生长繁殖和产物形成的营养物质。 二、发酵工业培养基的营养成分及来源 （一）碳源： 1、作用

（1）提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳骨架 （2）提供合成目的产物所的原料 2.常用的碳源：

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（1）糖类：葡萄糖、淀粉、糖蜜

（2）油和脂肪：豆油、菜子油、葵花籽油、猪油、鱼油、棉籽油等 （3）有机酸：乳酸、柠檬酸、乙酸 （4）烃和醇类：正烷烃、乙醇 （5）生物质：木材、秸秆、草类等

3.发酵培养基的选择原则：

* (1)必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。

* (2)有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质所合成产物数量或最大产率。 * (3)有利于提高培养基和产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。 * (4)有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。 * (5)尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化。 * (6)原料价格低廉，质量稳定，取材容易。

* 7)所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗。 (8)有利于产品的分离纯化，并尽可能减少产生“三废”的物质。

淀粉水解糖的制备

第一步：利用淀粉酶将淀粉液化转化为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加；（液化） 第二步：利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖。（糖化）

* 3.酸酶结合法：

4.淀粉水解糖的制备方法（目的使淀粉变成葡萄糖）：酸解法；酶解法；酸酶结合水解法。 5.糖蜜可分为：甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜。糖蜜前处理的方法：加酸通风沉淀法；加热加酸沉淀法添加絮凝剂澄清处理法；

（1）酸酶法：先将淀粉酸水解成糊精或低聚糖，然后再用糖化酶将其水解为葡萄糖。

用酸酶法水解淀粉制糖，酸液化速度快，且糖化是由酶来进行的，对液化要求不高，可采用较高的淀粉乳浓度，以提高生产效率。

（2）酶酸法：将淀粉先用淀粉酶液化到一定程度，然后用酸水解成葡萄糖。 糖蜜预处理的方法 (1) 加酸通风沉淀法 (2) 加热加酸沉淀法

（3）添加絮凝剂澄清处理法 絮凝剂:聚丙烯酰胺

（二）氮源 1、无机氮源

种类：氨盐、硝酸盐和氨水

所以选择合适的无机氮源有两层作用：

（1）满足菌体生长 （2）稳定和调节发酵过程中的pH 2、有机氮源

来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。 （三）生长调节物质

生长调节物质：发酵培养基中某些成分的加入有助于调节产物的形成，这些添加的物质称为生长调节物质。包括生长因子、前提、产物抑制剂和促进剂。

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1、生长因子：凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。

2、前体：前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接在微生物生物合成过程中合成到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高的一类化合物。（采用少量多次的流加工艺）如：苯乙酸、甘氨酸、吲哚、氨茴酸等 （二）培养基的类型 （1）斜面培养基

（2）种子培养基（包括摇瓶种子和小罐种子培养基）： （3）发酵培养基

发酵培养基是发酵生产中最主要的培养基，它不仅耗用大量的原材料，而且也是决定发酵生产成功与否的重要因素。

1）根据菌体自身生长规律和产物合成的特点来设计培养基：

☆ 对菌体生长与产物相偶联的发酵类型，充分满足细胞生长繁殖的培养基就能获得最大的产物。 ☆ 对于生产氨基酸等含氮的化合物时，它的发酵培养基除供给充足的碳源物质外，还应该添加足够的铵盐或尿素等氮素化合物。

2）发酵培养基的各种营养物质的浓度应尽可能高些，这样在同等或相近的转化率条件下有利于提高单位容积发酵罐的利用率，增加经济效益。

3）发酵培养基需耗用大量原料，因此，原料来源、原材料的质量以及价格等必须予以重视。 （四）培养基的设计与优化：看课本大概了解一下P49

四．发酵工业的无菌技术

一、概念:灭菌、消毒、除菌、防腐

灭菌(sterilization):用化学或物理方法杀死物料或设备中所有有生命物质的过程。 消毒(disinfection):用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器具表面的微生物。 除菌(degermation): 用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。 防腐(antisepsis): 用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖 。

1.染菌的不良后果: 1.消耗营养物 2.合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难 3.改变pH 4.分解产物 5.噬菌体破坏极大

2.染菌危害的具体分析

（1）染菌对不同菌种发酵的影响 A．细菌

? 谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大。

? 肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢产物。

B. 霉菌

? PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，发酵一无所获。 ? 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染菌。 C. 酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌

D. 疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，都应全部废弃。

? 青霉素：怕染细短产气杆菌

? 链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌 ? 四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌 ? 柠檬酸：怕染青霉菌

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? 肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌

? 谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染

（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响 (1) 种子扩大时期染菌:

（2） 发酵前期染菌：

（3） 发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方法应根据各种发酵的特点和具体

情况来决定 a) 抗生素发酵 b) 柠檬酸发酵

a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制细菌

b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制酵母；通风加大，加速产酸。

柠檬酸发酵

c.染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH下降，黄曲霉自溶。 d.青霉菌：在pH很低下能够生长。提前放罐。 （4） 发酵后期污染

a) 染菌量不太多，可继续发酵 b) 污染严重，则提前放罐

6.发酵染菌后的措施

发酵过程一旦发生染菌，应根据污染微生物的种类、染菌的时期和杂菌的危害程度等进行挽救和处理，同时也要对有关的设备也要进行相应的处理。

（1） 种子培养期染菌的处理：一发现种子染菌，该种子不能再接入发酵罐中，应弃之，并对种

子罐、管道等进行仔细检查和彻底的灭菌。同时采用备用种子，选择生长正常无染菌的种子接入种子罐。

（2） 发酵前期染菌的处理：此时培养基的碳、氮源含量还比较高，终止发酵，将培养基加热至

规定的温度，重新灭菌后，再接入种子进行灭菌。如此时染菌已造成较大的危害，碳、氮源消耗得比较多，则可放掉一部分的料液，补充新鲜的培养基，重新灭菌后，在接种发酵。

（3） 发酵中期、后期染菌的处理：可以适当的加入杀菌剂或抗生素以及正常的发酵液，以抑制

杂菌的生长，也可采取降低培养温度、降低通风量、停止搅拌等进行处理。若代谢产物已经达到一定值，只要明确是染菌就放罐。

染菌后对设备的处理：必须对空罐进行彻底的清洗，空罐加热灭菌至120℃以上、30min后才可用。亦可用甲醛熏蒸或甲醛溶液浸泡12h以上等。

杀菌剂的添加：前期无必要，增加成本； 发现后加入，效果要具体评价

2. 污染原因分析

主要原因：① 种子带菌② 无菌空气带菌 ③ 设备渗漏 ④ 灭菌不彻底 ⑤操作失误 ⑥技术管理不善

? 从污染时间看：早期污染可能与①②④⑤→接种操作不当有关；后期污染可能与③⑤及中间补料有关。 ? 从杂菌种类看：

? 耐热芽孢杆菌：与④有关

? 球菌、无芽孢杆菌：与① ② ③⑤有关

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? 浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏 ? 霉菌：与④⑤有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问题 ? 酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长

? 从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所污染的是同一种杂菌，一般是空气系统问题，若个别罐连续染菌，一般是设备问题。

发酵工业的无菌技术——灭菌方法1.干热灭菌法 2.湿热灭菌法 3.射线灭菌法 4.化学药剂灭菌法5.过滤除菌法6.火焰灭菌法

热阻：微生物的热阻就是指微生物对热的抵抗能力。 对数残留定律：

（一）分批灭菌（实罐灭菌）

定义：将配制好的培养基同时放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将 培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程，通常也称为实罐灭菌。 二、连续灭菌

1.定义：将配制好的培养基在向发酵罐输送的同时加热、保温和冷却进行灭菌。 分批灭菌和连续灭菌的优缺点比较 灭菌方式 优 点 缺 点 连续 灭菌 1.灭菌温度高，可减少培养基中营养物质的损失 ； 2.操作条件恒定，灭菌质量稳定 ； 3.易于实现管道化和自控操作 ； 4.避免了反复的加热和冷却，提高了热的利用率； 5.发酵设备利用率高。 1.设备要求低，不需另外设置加热、冷却装置； 2.操作要求低，适于手动操作； 3.适合于小批量生产规模； 4.适合于含有大量固体物质的培养基的灭菌。 1.对设备的要求高，需另外设置加热、冷却装置； 2.操作较麻烦； 3.染菌的机会较多； 4.不适合于含大量固体物料的灭菌； 5.对蒸汽的要求高。 1.培养基的营养物质损失较多，灭分批 菌后培养基的质量下降； 灭菌 2.需进行反复的加热和冷却能耗 较高； 3.不适合于大规模生产过程的灭菌； 4.发酵罐的利用率较低。 由表可见，无论在理论上或者在实践上，与间歇灭菌过程相比，连续灭菌的优点十分明显。因此，连续灭菌越来越多地被用培养基的灭菌。 但是出于对设备的考虑，中小型罐还是采用分批灭菌比较好。

五、空气除菌：看课本了解流程P73

空气除菌系统包括：冷却、分离油水、加热、

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五．发酵工业的种子的制备（种子扩大培养）

种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。

1.优良种子应具备的条件：(1).生长活力强，延迟期短；(2).生理状态稳定； (3).浓度及总量能满足发酵罐接种量的要求；(4).无杂菌污染，保证纯种发酵； (5)适应性强，生产能力稳定

种子的制备分为两个阶段：1.实验室种子制备阶段：琼脂斜面至固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜面培养等或液体摇瓶培养 ）

2.生产车间种子制备阶段：种子罐扩大培养 种龄：是指种子的培养时间。

接种龄 :种子罐中培养的菌体从开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间 接种量：移入的种子液体积和接种后培养液体的体积的比例

影响种子质量的因素（了解p81）

1原材料质量2. 培养温度 3. 湿度4. 通气与搅拌 5. 斜面冷藏时间 6. 培养基 7.PH

六.发酵动力学

发酵动力学的概念和研究内容：

发酵动力学：是研究发酵过程中菌体生长、基质消耗、产物生成的动态平衡及其内在规律。 研究内容：包括了解发酵过程中菌体生长速率、基质消耗速率和产物生成速率的相互关系，环境因素对三者的影响，以及影响其反应速度的条件。

比生长速率μ的定义P87

Monod方程 88页

上式中: S—限制性基质浓度，mol/m3 Ks—底物亲和常数(也称半饱和速度常数），表示微生物对底物的亲和力 , mol/m3 ； Ks越大，亲和力越小， μ越小。（单一限制性基质：就是指在培养微生物的营养物中，对微生物的生长起到限制作用的营养物。）

当S>>KS时,μ︾ μm ;若继续提高底物浓度,细胞生长速率基本不变

当S<

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就呈现一级反应特点.此时S↓，μ ↓ ∴ 减速期， μ

根据发酵时间过程分析，微生物生长与产物合成存在以下三种关系：

? 与生长相关→生长偶联型

? 与生长部分相关→生长部分偶联型 ? 与生长不相关→无关联

(1).与生长相关→生长偶联型：乙醇发酵

产物的生成是微生物细胞主要能量代谢的直接结果，菌体生长速率的变化与产物生成速率的变化相平行。 (2).与生长部分相关→生长部分偶联型： 柠檬酸、氨基酸发酵

产物间接由能量代谢生成，不是底物的直接氧化产物，而是菌体内生物氧化过程的主流产物（与初生代谢紧密关联）。

(3)与生长不相关→无关联：抗生素发酵

产物生成与能量代谢不直接相关，通过细胞进行的独特的生物合成反应而生成。 公式：93页

公式:94页

七.发酵工业中氧的供需

呼吸强度（比耗氧速率） QO2 ：单位质量干菌体在单位时间内消耗氧的量。 单位：mmolO2/（kg干菌体·h）。 耗氧速率（r）：表示单位体积培养液在单位时间内的吸氧量。

当溶解氧浓度达某一值后，CL增加而QO2不变，此时的溶解氧浓度称为呼吸临界氧浓度 用C临界表示。

2.提高氧传递的能力：

根据气液传质方程式N＝ KLa （C*-CL）看出，影响发酵过程中传递速率N（或供氧）的主要因素有推动力（C*-CL）和液相溶氧系数KLa。若能改变这两个因素，则能改变N，即改变发酵罐的供氧能力。

（一）、影响氧传递推动力的因素：提高C*的方法和降低CL的方法：

①提高C*的方法：影响C*的因素有温度、溶液的性质、氧分压等，即↑ C*，则T ↓或营养物质含量↓或氧分压↑（即提高罐压或通入纯氧）

②降低CL：降低CL可通过减少空气流量等方法来达到，但CL不能

（二）、影响KLa（液相体积溶氧系数）的因素

①、搅拌:搅拌器的设计对N的影响(包括搅拌器的型式、搅拌器相对位置、搅拌转速n和叶径d、档板、搅拌组数对溶氧的影响)。

②、空气线速度：VS，则KLa。但当VS过大，会发生“过载”现象（或称“气泛”现象）。

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③、空气分布器：空气分布管的形式、喷口直径、管口与罐底距离对溶氧速率有较大的影响。 ④、发酵罐的结构（罐内液注的高度、发酵罐的体积）：通常发酵罐体积大的氧的利用率高； 增加发酵液体积会使通风效率降低。

⑥、发酵液的理化性质：通常发酵液浓度增大、粘度增大时，KLα值降低。 3.溶解氧系数的测定方法：亚硫酸盐氧化法；取样极谱法；排气法。

4.空气除菌的方法：加热灭菌；电除尘；介质过滤除菌（分为绝对过滤、介质过滤，机制主有惯性碰撞、阻截、布朗运动、重力沉降、和静电吸引等）。

影响微生物耗氧的因素

（一）微生物本身遗传特征的影响

? 1、微生物种类不同，其生理特性不同，代谢活动的需氧量不同； ? 2. 同一种微生物的耗氧量,随菌龄和培养条件的不同而异. ? 3、同一菌种的不同生长阶段，其需氧量不同. (二) 培养基的成分和浓度

? 碳源种类

耗氧速率：油脂或烃类>葡萄糖> 蔗糖> 乳糖

? 培养基浓度

浓度大, QO2 ↑; 浓度小, QO2↓

(三)菌龄的影响:一般幼龄菌生长旺盛,QO2大,晚龄菌生长缓慢,QO2小

(四) 培养条件:与PH、T等有关,主要通过影响酶活性来影响菌体细胞的耗氧 一般，T ，营养愈丰富，QO2 ， (五)代谢类型(发酵类型)的影响

若产物通过TCA循环获取,则QO2高,耗氧量大 若产物通过EMP途径获取,则QO2低,耗氧量小

氧的传递途径与传质阻力

1、在好氧发酵中微生物的供氧过程是气相中的氧首先溶解在发酵液中，然后传递到细胞内的呼吸酶位置上而被利用。这一系列传递过程，又可分为供氧与耗氧俩方面。供氧是指空气中的氧气从空气泡里通过气膜、气液界面和液膜扩撒到液体主流中。耗氧是指氧分子自液体主流通过液膜、菌丝丛、细胞膜扩撒到细胞内。 1、供氧方面的阻力 1）气膜阻力（ 1/k1 ）：2）气液界面阻力（1/k2）：3）液膜阻力（1/k3）： 4）液流阻力（1/k4）： 2、耗氧方面的阻力

1）细胞周围液膜阻力（1/k5），与发酵液的成分和浓度有关。 2）菌丝丛或团内的扩散阻力（1/k6），与微生物的种类、 生理特性状态有关，单细胞的细菌和酵母菌不存在这种 阻力；对于菌丝，这种阻力最为突出。 3）细胞膜的阻力（1/k7）：与微生物的生理特性有关。 4）细胞内反应阻力（1/k8）

氧分子与细胞内呼吸酶系反 应时的阻力；与微生物的种类、生理特性有关。 ? 供氧方面主要阻力是气膜和液膜阻力

? 耗氧方面主要阻力是细胞团内与细胞膜阻力

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氧首先由气相扩散到气液两相的接触界面，再进入液相，界面的一侧是气膜，另一侧是液膜，氧由气相扩散到液相必须穿过这两层－－双膜理论 氧传递的主要阻力存在于气膜和液膜中 4 氧传递方程 105页

八．发酵过程控制（p124）

直接参数：温度、pH、罐压、空气流量、搅拌转速、溶氧浓度等 生物热 （Q生物）：产生菌在生长繁殖过程中本身会产生大量的热，此为生物热。

发酵热：在发酵过程中，引起温度变化的原因是由于发酵过程所产生的净热量，称为发酵热。[ J / m3 · h ] 或 ------ 单位体积的发酵液在单位时间内释放出来的净热量。 Q发酵 = Q生物 + Q搅拌 - Q蒸发 - Q显 – Q辐射

二、温度对发酵的影响和控制 1.影响发酵温度的因素

发酵热、生物热、搅拌热、蒸发热、辐射热

2.温度对微生物生长的影响

不同微生物的生长对温度的要求不同，根据它们对温度的要求大致可分为四类： 嗜冷菌适应于0～26℃生长，嗜温菌适应于15～43 ℃生长，嗜热菌适应于37～65 ℃生长，嗜高温菌适应于65 ℃ 以上生长

在其最适温度范围内，生长速率随温度升高而增加，当温度超过最适生长温度，生长速率随温度增加而迅速下降。

? 不同生长阶段的微生物对温度的反应不同

? 处于延迟期的细菌对温度的影响十分敏感。

? 对于对数生长期的细菌，如果在略低于最适温度的条件下培养，即使在发酵过程中升温，则升温的破坏作用较弱。

? 处于生长后期的细菌，其生长速度一般主要取决于溶解氧，而不是温度。

4.温度对发酵产物合成的影响

1） 温度影响产物合成的速率及产量 2）温度可能会影响终产物的质量 3）温度还可能影响生物合成的方向 4）影响酶系组成及酶的特性。 5）温度对代谢有调节作用

5.最适温度的选择

（1）根据菌种以及生长阶段（中期适当降低温度，后期适当升温） （2）根据培养条件（空气较差、培养基稀薄时，适当降温） （3）根据菌种生长情况

三、pH的影响及控制

(1)、发酵过程中PH的变化规律

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1.会导致微生物细胞原生质体膜的电荷发生改变 2.PH变化会影响菌体代谢方向。 3.PH对代谢产物合成的影响 (2).最适PH 的选择 (3).PH的调控策略：

1. 配制合适的培养基，调节培养基初始ph 至合适范围并使其有很好的缓冲能力。 2. 培养过程中加入非营养基质的酸碱调节剂，如CaCO3等防止PH过度下降。 3. 培养过程中加入基质性酸碱调节剂，如氨水等。 4. 加生理酸性或碱性盐基质，通过代谢调节PH。

5. 将PH控制与代谢调节结合起来，通过补料来控制PH。 溶解氧对发酵的控制（从供需氧方面P126） 基质对发酵对发酵的影响及控制（P132了解） 空气搅拌对发酵的影响及控制（P133了解）

四、泡沫的控制

（1）机械消泡（2）化学消泡 （3）从微生物本身特性着手，防止泡沫形成筛选不产生泡沫的微生物突变株几种微生物混合培养

十一.发酵产物的提取与精制方法 （主要看课本了解一下） 1、产物的提取方法：萃取、吸附

2、产物的精制方法：离子交换、膜分离法、色谱分离法、浓缩法、沉淀 3、成品阶段：结晶、干燥、蒸馏

萃取：利用溶质在互不相溶的两相之间的分配系数的不同而使溶质达到浓缩和提纯的方法。 双水相萃取法：

利用亲水性高分子聚合物的水溶液可形成双水相的性质进行物质分离的方法。

凝胶色谱技术

概念：是利用生物大分子的分子量差异进行的色谱分离方法。

凝胶色谱介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等为原料，通过特殊工艺合成的色谱介质。

膜分离法

指利用具有一定选择性透过特性的过滤介质（如高分子薄膜），将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术。 常用的有：透析、超滤及反渗透、微滤

细胞破碎技术：利用外力破坏细胞壁和细胞膜，是细胞内目标物释放出来的技术。 方法：（1）物理法：高压匀浆破碎法；高速珠磨法；超声破碎。 （2）化学法：酸热法；化学渗透法。 （3）生物酶溶法

9.热死时间：即在规定温度下杀死一定比例的微生物所需要的时间。 致死温度：杀死微生物的极限温度。

湿热灭菌原理：由于蒸汽具有很强的穿透能力，而且在冷凝时会放出大量的冷凝热，很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。 灭菌条件：121℃，30min。

灭菌不利方面：同时也会破坏培养基中的营养成分，甚至会产生不利于菌体生长的物质。因此，在工业培养过程中，除了尽可能杀死培养基中的杂菌外，还要尽可能减少培养基中营养成分的损

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失。

致死时间：在此温度下，杀死全部微生物所需要的时间。

热阻：对热的抵抗力，指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。 相对热阻：几种微生物对热的相对抵抗能力。指微生物在某一特定条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。

2.糖酵解的调节机制： 糖酵解的调节机制主要体现在三个激酶： ①G在己糖激酶的作用下生成6-P-葡萄糖；

②6-P-果糖在磷酸果糖激酶作用下生成1，6-二P-果糖；

③2-P-烯醇式丙酮酸在丙酮酸脱氢酶的作用下生成烯醇式丙酮酸，后者自动转为丙酮酸。

它们是EMP途径的关键酶，是EMP途径三个不可逆的步骤。它们的作用是将酵解途径组成一个整体，以维持有机体的功能。

糖酵解的调节主要是能荷的调节，就是受细胞内能量水平的控制。

.酒精的发酵机制：

一、乙醇的生成机制：在酵母的体内，葡萄糖经酵解途径生成丙酮酸，在无氧的条件下，由丙酮酸脱羧酶催化使丙酮酸脱羧生成乙醛，反应如下：

??????乙醛+CO2 丙酮酸??????丙酮酸脱羧酶丙酮酸脱羧酶需要焦磷酸琉胺素为辅酶，并需要Mg2+，所生成乙醛在乙醇脱氢酶的作用下成为变

氢体，被还原成乙醇，反应如下：

????????乙醇 乙醛????????由葡萄糖生成乙醇的总反应式：

NADH?H??NADH?C6H12O6?2ADP?2H3PO4?2CH3CH2OH?2CO2?2ATP?104.600kJ

乙醇也会减少。

1．补料分批发酵法：所谓分批补料培养技术，是指在分批培养过程中，间歇或连续的添加新鲜培养基的方法。

连续发酵：指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使发酵罐内的发酵液总量维持恒定，使培养物在近似恒定状态下生长的微生物培养方式。 分批发酵（培养）：在一个密闭的系统内一次性投入有限数量的营养物进行培养的方法。

dx ?0.生长曲线： dt（1）停滞期：微生物细胞适应新环境的过程。接种物的生理状态和浓度影响停滞期的长短。

(2)对数生长期：处于对数生长期的微生物细胞的生长速率大大加快，单位时间内细胞的数目或质量的增加维持稳定，并达到最大值。 ??max?(3)稳定期在细胞生长代谢过程中，培养基中的底物不断被消耗，一些对微生物生长代谢有害的物质在不断积累。受此影响，微生物的生长速率和比生长速率就会逐渐下降，直至完全停止，这dx时就进入稳定期。 ?0dt

X?Xmax

(4)死亡期：细胞的营养物质和能源储备已消耗殆尽，不能再维持细胞的生长和代谢，因而细胞

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dx?0dt

开始死亡。在发酵工业生产中．在进入死亡期之前应及时将发酵液放罐处理。

6.乳酸的发酵机制：

一、同型乳酸发酵：乳酸菌利用葡萄糖经EMP途径生成丙酮酸，因大多数乳酸菌不具有脱羧酶，，此时丙酮酸在乳酸脱氢酶的催化下（需要辅酶Ⅰ）被还原为乳酸。 同型乳酸菌：乳酸链球菌、酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、德式乳杆菌。 二、异型乳酸发酵：

1. 6-磷酸葡萄糖酸途径（磷酸酮解途径）：葡萄糖经6-磷酸葡萄糖酸生成5-磷酸核酮糖，再经差向异构作用生成5-磷酸木酮糖。后者经磷酸解酮酶催化，分解为3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸。3-磷酸甘油醛经EMP途径生成丙酮酸。后者经乳酸脱氢酶催化为乳酸。 2.双岐反应（磷酸酮解途径）：

机制及特点：①有两个磷酸酮解酶参与；②在没有氧化作用和脱氢作用的反应参与下，2分子葡萄糖分解为3分子乙酸和2分子3-磷酸甘油醛。接着，在3-磷酸甘油醛脱氢酶和乳酸脱氢酶的参与下，3-磷酸甘油醛转变为乳酸。

7.一、柠檬酸发酵机制：

①NH4+浓度。正常情况下，柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶（PEK，酵解的第一调节点）有抑制作用，而铵离子能解除柠檬酸、ATP对PEK的抑制作用，即有激活作用。当NH4+浓度升高时，使PEK对细胞内柠檬酸不敏感，从而大量积累柠檬酸。

②Mn2+浓度。由于锰缺乏时抑制蛋白合成，导致细胞内NH4＋浓度升高和形成一条呼吸活力强的不产生ATP的侧系呼吸链，这两方面的原因分别解除了对PEK的代谢调节，促进EMP途径的畅通。 ③柠檬酸合成酶。在草酰乙酸和乙酰CoA缩合成柠檬酸时，柠檬酸合成酶不被调节，因此可大量合成柠檬酸。

④呼吸链。当氧气充足时，黑曲霉通过侧系呼吸链不产生ATP，不抑制PEK的生成，促进糖酵解途径；当氧气不足时，会导致侧系呼吸链发生不可逆失活，从而进入标准呼吸链，此途径产生ATP，会抑制PEK，抑制柠檬酸的生成。 ⑤顺乌头酸合成酶。由于此酶在催化时建立柠檬酸、顺乌头酸、异柠檬酸的平衡，同时在控制Fe2+含量时，顺乌头酸合成酶活力低，使柠檬酸开始积累；当柠檬酸浓度升高到某一水平,就抑制异柠檬酸脱氢酶的活力，从而进一步促进柠檬酸的积累；柠檬酸使PH值下降，到PH=2时，顺乌头酸合成酶和异柠檬酸脱氢酶失活，阻断TCA，更利于柠檬酸的积累。

⑥丙酮酸组成酶。由于丙酮酸羧化酶是组成酶，不被控制，会源源不断的提供草酰乙酸；丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和CO2固定两个反应的平衡，增加了合成柠檬酸的能力。

二、柠檬酸合成途径：G经过EMP途径生成丙酮酸，一方面丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA,另一方面丙酮酸羧化生成草酰乙酸，最后草酰乙酸与乙酰CoA缩合生成柠檬酸。

8.谷氨酸发酵机制的菌种选育：选育生物素缺陷型；油酸缺陷型；甘油缺陷型；温度敏感突变株；其他突变型如：添加青霉素法。

9.谷氨酸生物合成途径及发酵机制： 一、生物合成途径：G经过EMP途径和HMP途径生成丙酮酸。一方面丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA，另一方面经CO2固定反应作用生成草酰乙酸，两者合成柠檬酸进入TCA循环（也进入乙醛酸循环），由TCA的中间产物α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化下，还原氨基化合成谷氨酸。 二、机制：（1）内在方面：

①TCA循环：在有机酸含量很高时，柠檬酸合成酶、乌头酸酶、异柠檬酸酶等活性很高，促使谷

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氨酸大量生成，而α-酮戊二酸脱氢酶、异柠檬酸裂解酶的活力很弱，使糖代谢流入TCA循环后受阻在α-酮戊二酸处，在有NH4+的情况下，由谷氨酸脱氢酶催化还原氨基化大量生成谷氨酸。 ②DCA循环：菌体内有机酸含量很低时，使DCA运转进而生成草酰乙酸，以补充TCA缺少的C4二羧酸。

③细胞膜通透性的改变：在发酵液中加生物素、表面活性剂等，使细胞膜通透性增大，终产物谷氨酸不断地排出细胞外，加快糖代谢的速度。 （2）外在环境因素方面：

①溶解氧：在O2不足的情况下，谷氨酸会生成乳酸或琥珀酸，充足时生成α-酮戊二酸；

②PH值：若PH值为5~8则会生成谷氨酰胺或其他物质；③磷酸：若环境中充满高浓度的磷酸盐则会生成缬氨酸；④氨的导入：NH4+充足的情况下，由谷氨酸脱氢酶催化还原氨基化大量生成谷氨酸。若不足则会生成α-酮戊二酸。

11.啤酒以大麦芽﹑酒花﹑水为主要原料﹐经酵母发酵作用酿制而成的饱含二氧化碳的低酒精度酒。啤酒生产过程分为麦芽制造、麦芽汁制造、前发酵、后发酵、过滤灭菌、包装等几道工序。

5.甘油的合成机制：在酵母中，葡萄糖经EMP途径生成丙酮酸，其在丙酮酸脱羧酶的作用下，生成乙醛，此时改变发酵条件下或加入某种抑制剂（亚硫酸氢钠），把磷酸二羟丙酮作为受氢体。其在α-磷酸甘油脱氢酶（需辅酶Ⅰ）的催化下被还原为α-磷酸甘油，后者在α-磷酸甘油磷酸酯酶的作用下生成甘油。

实际上在甘油发酵过程中，仍有一些乙醇生成，因为亚硫酸氢钠不能加太多，否则酵母会中毒；当酵母在碱性（PH=7.6）条件下，两个乙醛分子起歧化反应，生成乙醇和乙酸。

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氨酸大量生成，而α-酮戊二酸脱氢酶、异柠檬酸裂解酶的活力很弱，使糖代谢流入TCA循环后受阻在α-酮戊二酸处，在有NH4+的情况下，由谷氨酸脱氢酶催化还原氨基化大量生成谷氨酸。 ②DCA循环：菌体内有机酸含量很低时，使DCA运转进而生成草酰乙酸，以补充TCA缺少的C4二羧酸。

③细胞膜通透性的改变：在发酵液中加生物素、表面活性剂等，使细胞膜通透性增大，终产物谷氨酸不断地排出细胞外，加快糖代谢的速度。 （2）外在环境因素方面：

①溶解氧：在O2不足的情况下，谷氨酸会生成乳酸或琥珀酸，充足时生成α-酮戊二酸；

②PH值：若PH值为5~8则会生成谷氨酰胺或其他物质；③磷酸：若环境中充满高浓度的磷酸盐则会生成缬氨酸；④氨的导入：NH4+充足的情况下，由谷氨酸脱氢酶催化还原氨基化大量生成谷氨酸。若不足则会生成α-酮戊二酸。

11.啤酒以大麦芽﹑酒花﹑水为主要原料﹐经酵母发酵作用酿制而成的饱含二氧化碳的低酒精度酒。啤酒生产过程分为麦芽制造、麦芽汁制造、前发酵、后发酵、过滤灭菌、包装等几道工序。

5.甘油的合成机制：在酵母中，葡萄糖经EMP途径生成丙酮酸，其在丙酮酸脱羧酶的作用下，生成乙醛，此时改变发酵条件下或加入某种抑制剂（亚硫酸氢钠），把磷酸二羟丙酮作为受氢体。其在α-磷酸甘油脱氢酶（需辅酶Ⅰ）的催化下被还原为α-磷酸甘油，后者在α-磷酸甘油磷酸酯酶的作用下生成甘油。

实际上在甘油发酵过程中，仍有一些乙醇生成，因为亚硫酸氢钠不能加太多，否则酵母会中毒；当酵母在碱性（PH=7.6）条件下，两个乙醛分子起歧化反应，生成乙醇和乙酸。

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