WB实验原理

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹技术

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术首先在1967年由Shapiro等建立，主要用于测定蛋白质亚基分子量。Western 印迹是在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳基础上，将电泳分离的蛋白组分从凝胶转移至一种固相支持物上，应用抗体可与附着于固相支持物上的靶蛋白发生特异性反应的特点，针对特定蛋白进行鉴别和定量。 原理

1． SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂，例如巯基乙醇和二硫苏糖醇则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚，使其氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。在水溶液中蛋白质-SDS胶束的长度与亚基分子量的大小成正比。因此这种胶束在SDS聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质或亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15KD～200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。由此可见，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅可以分离蛋白质，而且可以根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量。 2． Western 印迹

在Western印迹法中，待测样品溶解于去污剂和还原剂的溶液中，经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后被转移到固相支持物上（常用硝酸纤维素滤膜），然后可被染色。随后滤膜可与抗靶蛋白的一抗反应。最后，结合上的抗体可用多种二级免疫学试剂（与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的A蛋白或抗免疫球蛋白）检测。Western 印记法可测出1-5ng中等大小的待检蛋白。 方法

1. 样品的制备

从细胞中提取蛋白质样品用于Western印记的方法有两种，一是可以在加样缓冲液中直接溶解完整细胞；二是制备细胞提取液。可根据不同的目的采用不同的方法。如果仅是定性实验，可应用第一种方法；如果需测定蛋白含量并进行定量实验，可应用后一种方法。 1.1 凝胶加样缓冲液裂解哺乳动物细胞和组织制备蛋白质样品 1） 裂解细胞或组织

a. 单层培养细胞：用PBS缓冲液漂洗细胞2次，弃去洗液并吸尽残余的PBS液体，

加入一定体积（50～200μl）的加热到85℃的1×SDS凝胶加样缓冲液[50mmol/L Tris.Cl(pH 6.8), 100mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）, 2% SDS, 0.1% 溴酚蓝，10%甘油] 溶解细胞，用细胞刮刀把粘稠状的细胞裂解物收集于一个微量离心管中，用于步骤2）。

b. 悬浮培养细胞：用冷的PBS充分洗涤细胞后，去尽残液，加入一定体积用冰预冷

的悬浮缓冲液[0.1mol/L NaCl，0.01mol/L Tris.Cl（pH 7.6），0.001mol/L EDTA（pH 8.0），1μg/ml Aprotinin，100μg/ml PMSF]，涡流振荡混匀后，加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液[100mmol/L Tris.Cl(pH 6.8), 200mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）, 4% SDS, 0.2% 溴酚蓝，20% 甘油]，混匀后，用于步骤2）。

c. 动物组织：用冷的PBS洗去残血后，加入一定体积用冰预冷的悬浮缓冲液，用剪

刀剪碎，如有必要可在冰浴下匀浆，然后加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液，混匀后，用于步骤2）。

2） 将样品置于沸水浴中加热10分钟。

3） 室温下以10000rpm将样品离心10分钟，将上清移至一新管中，分装后，冻存于-20℃。 1.2 裂解缓冲液裂解哺乳动物细胞和组织制备蛋白质样品

用于制备哺乳动物细胞蛋白质裂解缓冲液有多种，在对靶蛋白的抗原性一无所知的情况下，一般使用三去污剂和单去污剂裂解缓冲液，然后逐步过渡到更专门的提取方法。

三去污剂裂解缓冲液：50mmol/L Tris.Cl（pH 8.0），150mmol/L NaCl，0.02% 叠氮钠，0.1% SDS，100μg/ml PMSF，1μg/ml Aprotinin，1% NP-40，0.5% 去氧胆酸钠

单去污剂裂解缓冲液：50mmol/L Tris.Cl（pH 8.0），150mmol/L NaCl，0.02% 叠氮钠，100μg/ml PMSF，1μg/ml Aprotinin，1% NP-40或Triton X-100。

高盐裂解缓冲液：50mmol/L HEPES（pH 7.0），500mmol/L NaCl， 100μg/ml PMSF，1% NP-40，1μg/ml Aprotinin。

无盐裂解缓冲液：50mmol/L HEPES（pH 7.0）， 100μg/ml PMSF，1% NP-40，1μg/ml Aprotinin。

1） 裂解细胞或组织

a. 单层培养细胞：用冷PBS缓冲液漂洗细胞2次，弃取洗液并吸尽残余的PBS液体，

加入一定体积（50～200μl）用冰预冷的裂解缓冲液，置于冰上孵育20分钟。然后用细胞刮刀将细胞刮下，连同裂解缓冲液一起移至微量离心管中，用于步骤2）。 b. 悬浮培养细胞：用冷的PBS充分洗涤细胞后，去尽残液，加入一定体积用冰预冷的

裂解缓冲液，重悬细胞，于冰上放置30分钟后，用于步骤2）。

d. 动物组织：用冷的PBS洗去残血后，加入一定体积用冰预冷的裂解缓冲液，用剪

刀剪碎，如有必要可在冰浴下匀浆，用于步骤2）。

2）于4℃以12000rpm将裂解物离心2分钟。

3）将上清移至一新管中，分装后，冻存于-20℃。电泳时取出适量的提取液（50μg）与等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液混合后，置于沸水浴中加热5分钟以使蛋白变性。 2．蛋白含量的测定（Bradford） 2.1 所需试剂

1） 0.15mol/L NaCl： NaCl 0.88g 水 100ml

2） 0.5mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）：BSA 0.5mg 0.15mol/L NaCl 1ml 3） 考马斯亮蓝溶液：

在1L容量瓶中，将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml磷酸，然后补加水至容量瓶体积。用滤纸过滤后，于4℃保存。

2.2 操作步骤

1） 分别在两组微量离心管中各加入0.5mg/ml BSA（ 1.0，2.5，5.0，10和20μl），

以0.15mol/L NaCl补足体积至20μl，同时以两管20μl的0.15mol/L NaCl作空白对照。

2） 每管各加入480μl考马斯亮蓝溶液，振荡混匀，室温放置2分钟。

3） 用1cm光径的比色杯测A595，取A595吸光值对标准蛋白浓度作图，画出标准曲线。 4） 取待测样品2.5μl，补加0.15mol/L NaCl 17.5μl，480μl考马斯亮蓝溶液，混

匀后，在A595下比色，从BSA标准曲线中确定待测样品的蛋白含量。如果待测样品的浓度过高，可稀释后再测。

3． SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western 印迹 3.1 所需试剂

1） 30%丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺 29g

N，N′-亚甲双丙烯酰胺 1g 水 100ml 2） 10% SDS： SDS 10g

水 100ml

3） 1.5mol/L Tris（pH 8.8）：Tris 18.17g

水 80ml

溶解后，用浓HCl调pH至8.8，补水至100ml，4℃保存。

4） 10% 过硫酸铵：

过硫酸铵 0.1g 水 1ml

4℃保存可使用一周。

5） 1.0 mol/L Tris（pH 6.8）：Tris 12.11g

水 80ml

溶解后，用浓HCl调pH至6.8，补水至100ml，4℃保存。

6） Tris-甘氨酸电泳缓冲液（25mmol/L Tris，250mmol/L甘氨酸， 0.1% SDS）： Tris 3.02g 甘氨酸 18.8g 10% SDS 10ml 水至 1000ml

7） SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳12%分离胶所需溶液：水 3.3ml

30%丙烯酰胺溶液 4.0ml

1.5mol/L Tris（pH 8.8） 2.5ml 10% SDS 0.1ml 10% 过硫酸铵 0.1ml TEMED 0.004ml

8） SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶所需溶液：水 3.4ml

30%丙烯酰胺溶液 0.83ml

1.0 mol/L Tris（pH 6.8） 0.63ml 10% SDS 0.05ml 10% 过硫酸铵 0.05ml TEMED 0.005ml 9） 甲醇：冰醋酸固定液：甲醇 450ml

冰醋酸 450ml 水 100ml

10）0.25% 考马斯亮蓝R250染液：考马斯亮蓝R250 0.25g 甲醇：冰醋酸固定液 100ml

11）转移缓冲液（48 mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037% SDS，20% 甲醇）： Tris 5.8g 甘氨酸 2.9g 10% SDS 3.7ml 甲醇 200ml

水至 1000ml

12）丽春红储存液： 丽春红S 2g

三氯乙酸 30g 磺基水杨酸 30g

水至 100ml 使用时，用水稀释10倍。

13）封闭液[10mmol/L Tris.Cl（pH 7.5），150mmol/L NaCl，2% Tween 20，4% BSA]： 1mol/L Tris.Cl（pH 7.5） 1ml 1mol/L NaCl 15ml 20% Tween 20 10ml 牛血清白蛋白（BSA） 4g 水至 100ml

14）洗涤缓冲液[10mmol/L Tris.Cl（pH 7.5），150mmol/L NaCl，0.05% Tween 20]： 1mol/L Tris.Cl（pH 7.5） 1ml 1mol/L NaCl 15ml 20% Tween 20 0.25ml 水至 100ml

15）抗体稀释液：BSA 0.4g 洗涤缓冲液 100ml 分装后，-20℃冻存。

16）ECL检测试剂盒：北京普利莱公司产品。 3.2操作步骤：

3.2.1 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

1） 根据厂家说明书安装好垂直板电泳槽的玻璃板。 2） 配制SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳12%分离胶溶液。

3） 迅速在两玻璃板的间隙中灌注分离胶溶液，留出灌注积层胶所需空间（梳子的

齿长再加1厘米）。用吸管小心地在分离胶溶液上覆盖一层水，以防止空气中的氧进入凝胶而抑制聚合反应。将凝胶垂直放置于室温下聚合。

4） 分离胶聚合完全后，倾去覆盖层液体，用去离子水洗涤凝胶顶部数次以除去未

聚合的丙稀酰胺。尽可能排去凝胶上的液体，再用纸巾的边缘吸净残留液体。 5） 制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶溶液。

6） 在已聚合的分离胶上直接灌注积层胶，立即在积层胶溶液中插入干净的梳子。

小心避免混入气泡，再补充一些积层胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。

7） 当积层胶发生聚合时，从-20℃取出已制备好的样品及标准蛋白，在100℃下加

热5分钟以使蛋白变性。

8） 积层胶聚合完全后，小心移去梳子，用水冲洗齿孔以去除未聚合的丙稀酰胺。

将凝胶固定于电泳装置上，上、下槽各加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。

9） 按预定顺序加样，并在所有不用的样品孔中加入1×SDS凝胶加样缓冲液。 10）将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm。当溴酚蓝前沿进入分离胶后

把电压提高到15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部，然后关闭电源。 11）从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板，取下凝胶，进行考马斯亮蓝染色

或Western印迹。

3.2.2 用考马斯亮蓝对SDS聚丙稀酰胺凝胶染色

1） 用至少5倍体积的考马斯亮蓝染液浸泡凝胶，放在平缓摇动的平台上于室温

染色4小时以上。

2） 移出凝胶并回收染液以备后用，将凝胶浸泡于甲醇-冰醋酸固定液中脱色，

至蛋白带非常清晰为止，中间需更换几次脱色液。

3） 移出凝胶至含20%甘油的水溶液中，4℃保存。可随时进行凝胶图象分析或照

相。

3.2.3 Western印迹

1） 当SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳即将结束时，切6张滤纸和1张硝酸纤维素膜，其

大小应与凝胶的大小完全吻合。如果滤纸或凝胶的面积大于凝胶，滤纸和滤膜伸出的边缘就大有机会相接触，造成电流短路而使蛋白质不能从凝胶向滤膜转移。 2） 把硝酸纤维素滤膜漂浮于一盘蒸馏水中，借毛细作用使之从下往上湿润后，将

之浸没于水中。

3） 在一浅盘中加入一定量的转移缓冲液，将6张滤纸浸泡于其中。

4） 带手套安装转移装置：先平放底部电极（阳极），上放海绵夹层；然后依次放

上3张浸湿的滤纸、硝酸纤维素滤膜、凝胶及另外剩余的3张浸湿的滤纸和海绵夹层；最后用玻璃棒赶出所有的气泡，放上上方电极（阴极），插入电转移槽中。

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5） 连接电源，根据凝胶面积按0.65mA/cm接通电流，电转移1.5～2.0小时。 6） 断开电源，取出滤膜，直接浸入蒸馏水中，稍漂洗一下后，移至丽春红染液中

染色5～10分钟，再用蒸馏水漂洗几次，蛋白带清晰可见，迅速标出标准蛋白所在位置后，进行下面的免疫检测。

7） 加封闭液封闭滤膜，室温1小时或4℃过夜，然后用洗涤缓冲液室温下洗三次，每次10分钟；也可以不洗，直接从封闭液中取出滤膜，去尽残液，加入含0.4%BSA的洗涤缓冲液稀释的一抗（先取一张保鲜膜，固定在桌面上，蛋白面朝上放上滤膜，滴加适量的抗体以覆盖整张膜），室温孵育1小时后，用洗涤缓冲液室温下洗膜三次，每次10分钟；去尽残液后，用同样方法加HRP标记的二抗于膜上，室温孵育1小时后，用洗涤缓冲液室温下洗膜三次，每次10分钟；去尽残液后，将膜放置于一新的保鲜膜上，同时将ECL检测试剂盒中

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的两种试剂等体积混合（0.125ml/cm膜），室温下反应1分钟后，加至滤膜上，将膜在室温孵育1分钟，然后将膜上的液体去净，把膜用保鲜膜包好放入压片盒中；在暗室中，将X光片放于膜上，曝光30秒～10分钟或更长，最后进行显影、定影。

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