PCSK9 ELISA测定试剂盒说明书

1.样品准备：

细胞培养液：通过离心去除颗粒后马上检测或分装后保存在-20度以下，避免反复冻融。 细胞裂解液：分析前，细胞必须按照细胞裂解程序进行裂解。

血清：使用血清分离管并让标本在室温下凝血30min然后1000g离心15min，马上检测或分装后保存在-20度以下，避免反复冻融。

血浆：EDTA或肝素抗凝的血浆，1000g离心15min，马上检测或分装后保存在-20度以下，避免反复冻融。

血清或血浆样本需20倍稀释后，建议的稀释的方法是20ul样本加上380ul Calibrator Diluent RD 5p（1:5倍稀释）。

2.细胞裂解程序

（1）.细胞用10ml Cell Lysis Buffer1 将细胞重悬浮到5*10^6个/ml。 （2）.孵育并间断在室温下给予漩涡30min。 （3).12, 000rpm下离心10min以去除细胞成分。 (4).分装细胞并在-20度以下，避免反复冻融。

3.试剂准备 Wash Buffer：如果浓缩液中出现结晶，室温复温后轻轻混合直到结晶溶解。20ml Wash Buffer的浓缩液可以用去离子水或灭菌水配到500ml。

Substrate solution：等体积的Reagent A和Reagent B应该在使用前15min内混合，避光保存。每个孔需要200ul的混合液。

Calibrator Diluent RD 5p（1:5倍稀释）：20ml 的Calibrator Diluent RD 5p的浓缩液到80ml的 去离子水或灭菌水配到100ml。

Human PCSK9 standard-参考玻璃瓶上的标签的重建的体积：使用Calibrator Diluent RD 5p（1:5倍稀释）来重建，以产生40ng/ml的储存液。混合标准品以确保完全溶解，将标准品放至少15分钟并轻轻搅动以充分溶解。

吸取250ul的Calibrator Diluent RD 5p（1:5倍稀释）液到每个管子中，然后用储存液来产生浓度梯度，在转移到下一个管子之前需充分混合，未稀释的储存液作为坐高的标准浓度（40ng/ml），Calibrator Diluent RD 5p（1:5倍稀释）作为0浓度。

4.测定程序：所有的试剂和样品在室温中复温，建议所有的样品及对照及标准品使用2重复。 (1).准备试剂、样品和标准品。

（2）去除架子上多余的微孔，将他们放回到铝箔中,密封。

(3)每个孔中加入100ul的Assay diluent RD1-9。Assay diluent RD1-9可能包含有沉淀物，室温中复温后轻摇以溶解，如果沉淀物不能完全溶解，使用时充分混合。

（4）加入50ul 的标准、对照、样品（需稀释）到每个孔中，以粘合带覆盖，室温下孵育 2小时，然后读一次板子以记录标准品及样本的计数。

（5）每个孔吸干后然后每个孔加入400ul的Wash Buffer洗涤（用枪或排枪），重复4次。每次做好充分吸干液体以保证效果，最后一次洗涤时，应充分吸干或倒干残余的液体，在干净的纸上拍。

（6）加入200ul的Human PCSK9 conjugate到每个孔中，然后用新的粘合带覆盖，室温孵育2小时。

（7）重复步骤5的洗涤步骤。

（8）每个孔中加入200ul的substrate solution。室温中孵育30分钟，避光保存。

（9）每个孔中加入50ul的stop solution。这时孔中的颜色应当由蓝变黄。如果此时孔中的颜色仍为蓝色或者颜色变化不均匀，轻轻的拍打板子以充分混合。 （10）30分钟内测定吸光度，在450nm处读取。如果波长校正可以使用，设定在540-570nm之间，如果波长校正不可以使用，于450nm的减去540nm或570nm的读数以校正，减除后可以校正板子的光学 缺陷，如果直接在450nm读数而不校正可能更高并且不太准。

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