LC_MS_MS法测定吸烟者和被动吸烟者尿液中的烟碱及其代谢物

烟草科技/Tobacco Science &Technol ogy 烟草化学/Tobacco Che m istry 2008年第9期(总第254期)作者简介:范忠(1982-),在读硕士研究生,研究方向:烟碱及其代谢物的分析。E 2mail:fanzhong 20804@6fc4a7d876a20029bd642d4a 收稿日期:2008-03-06

责任编辑:刘立全　E 2mail:llq@t obaccoinf o 6fc4a7d876a20029bd642d4a 　电话:0371267672637

LC -MS/MS 法测定吸烟者和被动吸烟者尿液中的

烟碱及其代谢物

范　忠,刘惠民,谢复炜,夏巧玲,王　　

中国烟草总公司郑州烟草研究院,郑州高新技术产业开发区枫杨街2号　450001

关键词:LC -MS/MS;尿液;烟碱;代谢物

摘要:以烟碱-d 3、可替宁-d 3、反3’-羟基可替宁-d 3作内标,XDB C 18柱作色谱柱,10mmol/L (pH 618)乙酸铵水溶液和无水甲醇为流动相,梯度洗脱,流速1mL /m in,采用LC -MS/MS 法同时测定了10名吸烟者和5名被动吸烟者尿液中烟碱及其糖苷、可替宁及其糖苷、反3’-羟基可替宁及其糖苷、降烟碱、降可替宁、可替宁氮氧化物和烟碱氮氧化物。结果表明:①烟碱及其代谢物的精密度在211%～1710%之间,回收率在78%～116%之间;②日抽吸20支相同品牌卷烟的吸烟者尿液中烟碱及其9种代谢物的含量差异较大;③被动吸烟者尿液中都检测出烟碱、可替宁、反3’-羟基可替宁,部分检出可替宁糖苷、降烟碱、烟碱氮氧化物,且前3种物质的浓度略高于后3种,但都远远低于吸烟者。烟碱、可替宁、反3’-羟基可替宁有可能作为人体尿液中被动吸烟的生物标记物。

中图分类号:TS416　文献标识码:B 　文章编号:1002-0861(2008)09-0039-06

D eterm i n a ti on of N i coti n e and itsM et abolites i n Ur i n e of I n iti a ti ve and Pa ssi ve S m okers by LC -M S /M S

F AN ZHONG,L I U HU I 2M I N ,X I E F U 2W E I,X I A Q I A O 2L I N G,and WAN

G SHE NG

Zhengzhou T obacco Research I nstitute of CNT C,Zhengzhou 450001,China

Keywords:LC -MS/MS;U rine;N icotine;Metabolite

Abstract:The nicotine,cotinine,trans -3’-hydr oxycotinine,and their corres ponding glucosides,as well as nornicotine,norcotinine,cotinine -N -oxide and nicotine -N ’-oxide in the urine sa mp les fr om ten s mokers and five passive s mokers were deter m ined by liquid chr omat ography with tande m mass s pectr ometry (LC -MS/MS ),using deuterium -labeled nicotine,cotinine,and trans -3’-hydr oxycotinine as internal standards .The co mpounds were separated on an XDB C 18column by gradient eluti on of the m ixture of 10mmol/L a mmoniu m acetate water s oluti on (pH 6.8)and methanol,a mobile phase,at a fl ow rate of 1mL /m in .The results showed that:1)the recoveries of the analytes ranged fr om 78%t o 116%with the relative standard deviati on (RS D )of 2.1%t o 17.0%;2)the contents of nicotine and its metabolites in the urine sa mp les fr om s mokers who s moked 20cigarettes of the sa me brand everyday differed obvi ously;3)nicotine,cotinine and trans -3’-hydr oxycotinine were detectable in all urine sa mp les fr om passive s mokers,cotinine -N -glucoside,nornicotine and nicotine -N ’-oxide were detectable in s ome of the sa mp les fr o m passive s mokers at slightly l ower levels;while all of the m were far l ower than these in s moker ’s urine sa mp les .N ico 2tine,cotinine and trans -3’-hydr oxycotinine in hu man urine m ight be used as the bi omarkers of t obacco s moke exposure .

9

3? 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 6fc4a7d876a20029bd642d4a

烟碱是烟草中的主要生物碱,在人体内(主要是在肝脏中,其次是在肺和肾脏中)可以很快地代谢成各种产物,主要代谢产物有烟碱糖苷、可替宁及其糖苷、反3′-可替宁及其糖苷、降烟碱、降可替宁、烟碱氮氧化物、可替宁氮氧化物,约占烟碱在人体尿液中代

谢总量的90%[1]

。烟碱及其代谢物作为衡量人体烟气暴露程度和区别吸烟者、被动吸烟者及非吸烟者的生物标记物,已经受到生物医学、环境科学、吸烟与健康研究的广泛重视[223]

,其分析方法主要包括放射性免

疫法(R I A )[425]、酶联免疫法(EL I S A )[4]

、GC /MS 法[628]、HP LC 法[9211]、液相色谱-质谱法(LC -MS/

MS )[12219]

。LC -MS/MS 法灵敏度高,分离能力强,适

用范围宽,专属性强,但其前处理复杂[12214,17218]

、分析物质少[12214,19]

,因此,采用LC -MS/MS 法同时测定了吸烟者和被动吸烟者尿液中烟碱及其9种代谢物,旨在为人体尿液中吸烟生物标记物的测定提供参考。1　材料与方法

1.1　材料与仪器

超纯水(电导率≥1812M Ω?c m )、甲醇(色谱纯,

美国J&T Baker 公司);醋酸铵(色谱纯,美国TE D I A 公司);烟碱及其糖苷、可替宁及其糖苷、反3’-羟基可替宁及其糖苷、降烟碱、降可替宁、可替宁氮氧化物、烟碱氮氧化物、烟碱-d 3、可替宁-d 3、反3’-羟基可替宁-d 3(色谱纯,加拿大TRC 试剂公司);吸烟者(抽吸相同牌号,日吸烟量20支)、非吸烟者[工作和生活环境中没有环境烟气(ETS )]与被动吸烟者[工作(7h /d )环境中有ETS ]的尿样。

Agilent 1200高效液相色谱仪、Agilent Ecli p se XDB C 18柱、XDB C 8柱(150mm ×4.6mm i .d .,5μm )

(美国安捷伦公司);AP I 4000液相色谱/质谱(LC /MS )联用仪(美国应用生物系统公司);Synergy MAX RP 柱(150×4.6mm i .d .4μm )(美国菲罗门公司);BondElut C 18固相萃取柱(美国瓦里安技术有限公司);

OasisMCX 、HLB (3c m 3

×60mg )固相萃取柱(爱尔兰

W aters 公司);M illi 2Q50超纯水仪(美国M I L L I P ORE 公司);CP2245电子分析天平(感量0.0001g,德国Sart orius 公司);0.2μm 水相滤膜(天津市津腾实验设

备有限公司);SI G MA 1215PK 高速离心机(德国Sig ma 公司)。

1.2　尿样的采集、处理与分析

[14,16]

采集吸烟者、非吸烟者和被动吸烟者24h 尿样,晨尿弃去,以后每次尿液都收集于清洁容器中,直至收集了第二天晨尿。

吸取250μL 尿样,加入725μL 超纯水,然后加入25μL 烟碱-d 3、可替宁-d 3和反3’-羟基可替宁-d 3(内标)混合水溶液,浓度均为10mg/L,混匀后于14500r/m in 下离心15m in 。取上清液,用012μm 水相滤膜过滤,滤液进行LC -MS/MS 分析。分析条件为:

色谱柱:Agilent Ecli p se XDB C 18柱(150mm ×416mm i .d .,5μm );柱温:30℃;流动相:10mmol/L (pH 618)乙酸铵水溶液:无水甲醇(体积比95∶5)(0～2m in )2～6m in

10mmol/L (pH 618)乙酸铵水溶液(2m in ),流速1mL /m in;进样量:5μL;离子源:ESI ;检测模式:正离子MRM (表1);雾化气(N 2):01448MPa;

辅助加热气(N 2):01483MPa;气帘气(N 2):01069

MPa;电喷雾电压:5000V;干燥温度:600℃;扫描时间:100m s 。

表1　烟碱、代谢物及其内标的M R M 参数①

化合物

母离子(m /z )

子离子(m /z )

去簇电压(V )

碰撞能量(V )

保留时间(m in )

烟碱163.1

130.0

30

27

7.05

163.1132.03027烟碱糖苷339.1163.040205.11可替宁

177.180.030306.41177.198.13030可替宁糖苷

352.2177.120221.96反3’-羟基可替宁193.080.040325.98193.0134.04036反3’-羟基可替宁糖苷369.2193.120185.25降烟碱149.0130.020275.64149.080.03027降可替宁

163.0

118.0

32

33

6.22

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(续表1)

化合物母离子(m/z)子离子(m/z)去簇电压(V)碰撞能量(V)保留时间(m in)

163.080.03232

烟碱氮氧化物179.1132.030255.62

179.1130.03027

可替宁氮氧化物193.096.030285.25

193.098.13030

烟碱-d

3

(内标)166.3130.035286.94

166.3132.03528

可替宁-d

3

(内标)180.080.030326.39

180.0101.03033

反3’-羟基可替宁-d

3

(内标)196.280.040335.95

196.2134.04035

注:①黑体字为定量用的参数,非黑体字为辅助定性参数。

2　结果与讨论

2.1　前处理方法的选择

为选择适宜的前处理方法,采用离心后直接过滤和固相萃取2种方法分别对尿样进行前处理。结果发现,糖苷类物质在各种固相萃取柱如C

18

柱、MCX、HLB 柱上保留很弱,上样过程中就有相当比例的糖苷类物质流出,如可替宁糖苷上样时可流出50%左右,而采用离心后直接过滤的方法进行前处理则效果较好。2.2　色谱柱的选择

为选择适宜的色谱柱,对3种类型的色谱柱: MAX RP柱、XDB C18柱和XDB C8柱的分离效果进行了比较。结果显示,用MAX RP柱分离,烟碱及其代谢物的色谱峰都明显拖尾,且半峰宽较宽(图1a);在XDB C18柱和XDB C8柱上烟碱及其代谢物峰形都较

好(图1b),但大部分在XDB C

18

柱上的信号响应要比XDB C8柱高5%左右。因此,选择XDB C18柱进行分离

。

2.3　洗脱方式的选择

以10mmol/L乙酸铵水溶液(A)和无水甲醇(B)作流动相[16],对2种洗脱方式:等梯度洗脱和梯度洗

脱进行了考察。结果表明(图1c),当用配比为20∶80的流动相A与B等梯度洗脱时,烟碱及其9种代谢物标样的峰形都较好,但各峰之间不能达到基线分离,且尿样处理液等梯度洗脱的出峰效果不好,有些物质如降烟碱、降可替宁等甚至不能被检出,而梯度洗脱可使糖苷类物质与尿液中内源性成分峰的基线分离,其他烟碱代谢物峰之间也达到较好的分离(图1d)。虽然梯度洗脱条件下降烟碱与烟碱氮氧化物、可替宁氮氧化物与反3’-羟基可替宁糖苷等没有实现基线分离,但可以通过MR M色谱图进行定性定量分析。　　1.可替宁糖苷　2.烟碱糖苷　3.可替宁氮氧化物　4.反3’-羟基可替宁糖苷　5.降烟碱　6.烟碱氮氧化物　7.反3’-羟基可替宁　8.

降可替宁　9.可替宁　10.烟碱　11.烟碱

-d3　12.可替宁-d3　13.反3’-羟基可替宁-d3

图1　等度洗脱烟碱及其9种代谢物标样在Synergy M AX RP

柱(a)、XD B C

18

柱(b)、以及等度(c)和梯度(d)洗脱尿样处理

液在X D B C

18

柱上的色谱图比较

2.4　质谱条件的选择

在正离子模式下以流动注射的方式先对1mg/L

烟碱及其代谢物的标准溶液进行母离子全扫描,确定

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其母离子,然后分别以其分子离子选择其子离子(碎片),每种物质先选择2个碎片,再从中选取信号较强、又无互相干扰的碎片作为定性和定量参数(表1)。2.5　工作曲线和检测限

准确称取烟碱及其代谢物标样各1010mg,用甲醇溶解后分别转移至10mL 棕色容量瓶中,用甲醇定容,摇匀,得各标样的标准贮备液(贮于-40℃下)。取各标样的贮备液各100μL,混合后用超纯水稀释并定容至10mL,即得到浓度均为10mg/L 的混合标准工作溶液。内标混合溶液的配制亦同。

取250μL ×10非吸烟者尿样(空白尿液)的处理液,均加入25μL (10mg/L )混合内标溶液,然后分别加入一定量混合标准工作溶液,用超纯水稀释并定容至1mL,摇匀,得浓度为110、210、510、1010、5010、10010、50010、100010、400010、800010μg/L 空白尿液-标准溶液,分别进行LC -MS/MS 分析,并以各标样的峰面积与其内标的峰面积的比值(Y )对其浓度(X )进行线性回归分析,得烟碱及其代谢物的标准曲线(表2)。由此可见,在设定的浓度范围内,烟碱及其代谢物的标准曲线线性良好,适合定量分析。2.6　精密度与回收率

取250μL ×18空白尿液,加入混合工作标准溶液,制备高、中、低3种不同浓度的样品,每个浓度6份样品。分别进行前处理,每个浓度6份样品的处理液同日分析,并计算回收率和相对标准偏差(表3)。由

此看出,待测物高、中、低3个水平的精密度(RS D )在

2.1%～17.0%之间,回收率在78%～116%之间。2.7　样品的稳定性取吸烟者尿样约200mL,摇匀后分成9等份,各取3份分别在室温、4℃、-40℃下放置0h 、48h 和1周,测定其烟碱及其代谢物的含量。结果(表4)表明:在3种温度下存放48h 尿样中烟碱及其代谢物都较稳定(测定量变化<810%),-40℃下存放烟碱及其

代谢物也较稳定

[15,20]

(测定量变化<710%)。因此,常温下应在48h 内完成尿样测定,或先于-40℃下存

放而后测定。2.8　吸烟者和被动吸烟者尿样中烟碱及其代谢物含量比较

采用LC -MS/MS 法测定了10名日抽吸20支相同品牌卷烟的吸烟者和5名工作环境中存在ETS 的被动吸烟者24h 尿液中烟碱及其9种代谢物的浓度。结果(表5)表明:①虽然抽吸相同品牌相同支数的卷烟,但各吸烟者尿中烟碱及其9种代谢物的含量却存在较大差异,可能是抽吸习惯不同或烟碱实际摄入量

和代谢方式的差异[1,16]

造成的;②被动吸烟者24h 尿液中都检测出烟碱、可替宁、反3’-羟基可替宁,部分检出可替宁糖苷、降烟碱、烟碱氮氧化物,且前3种物质的浓度稍高,但都远远低于吸烟者。因此,烟碱、可替宁、反3’-羟基可替宁有可能作为人尿液中被动吸烟的生物标记物。

表2　烟碱及其代谢物的标准曲线、线性范围、相关系数、检测限

待测物①

线性方程

线性范围

(μg/L )相关系数

(R 2)检测限②

(μg/L )烟碱Y =6.7E -03X +0.0142.0～8000.00.99921.0可替宁

Y =4.6E -03X +4E -032.0～8000.01.00000.5反3’-羟基可替宁Y =2.9E -03X +2E -032.0～8000.01.00001.3烟碱糖苷Y =7.6E -03X +4E -031.0～4000.00.99990.4可替宁糖苷

Y =3.5E -05X +5E -042.0～8000.01.00000.5反3’-羟基可替宁糖苷Y =8.3E -04X +8E -055.0～4000.00.99992.7降烟碱Y =1.5E -03X +5E -031.0～4000.00.99960.2降可替宁Y =2.0E -04X +6E -0510.0～4000.00.99864.2可替宁氮氧化物Y =5.9E -04X +4E -051.0～4000.00.99930.4烟碱氮氧化物

Y =6.5E -03X +8E -03

1.0～4000.0

0.9993

0.1

注:①烟碱及其糖苷以烟碱-d 3作内标,可替宁及其糖苷、降烟碱、降可替宁、可替宁氮氧化物、烟碱氮氧化物以可替宁-d 3作内标,反3’-羟基可替宁及其糖苷的内标为反3’-羟基可替宁-d 3;②以信噪比S/N =3对应浓度确定。

2

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表3　不同浓度下烟碱及其代谢物的精密度和回收率(n =6)

化合物浓度

(μg/L )精密度

(%)回收率

(%)烟碱

10003.1981506.694108.278可替宁10002.81011504.7104104.2109反3’-羟基可替宁10003.81031503.7102106.7106烟碱糖苷5003.71051503.7109103.9116可替宁糖苷10002.1841503.49510

9.3

93

化合物

浓度

(μg/L )精密度

(%)回收率

(%)反3’-羟基可替宁糖苷

5002.81001503.7100104.597降烟碱

5002.71021503.892107.496降可替宁

5003.5971503.0100107.3105可替宁氮氧化物

5003.3951503.591104.395烟碱氮氧化物

5002.6991504.411010

3.3

116表4　尿样中烟碱及其代谢物的测定量随存放条件的变化①

(%)

时间

温度NN ic

②

N ic NCot OHCot NNO C NO Cot OHCot -G Cot -G

N ic -G 48h

-40℃

5.54.05.6

6.73.05.84.91.3-1.82.94℃

-7.02.3-2.3-0.7-2.2-3.2-1.1-7.4-4.92.4室温

-6.13.1-1.00.1-3.2-3.0-0.5-6.2-5.35.1一周

-40℃-2.92.8-1.23.5-2.6-2.12.2-2.9-3.3-0.54℃-11.3-4.8-5.8-7.2-5.1-9.3-6-8.4-7-3.4室温

-15.6

-9.5

-7.6

-8.5

-9.3

-11.5

-10.6

-12.4

-13.7

-14.1

①(不同存放条件下的测定值-取样时的测定值)/取样时的测定值;②NN ic,降烟碱;N ic,烟碱;NCot,降可替宁;OHCot,反

3’-羟基可替宁;NNO,烟碱氮氧化物;CNO,可替宁氮氧化物;Cot,可替宁;N ic -G,烟碱糖苷;OHCot -G,反3’-羟基可替宁糖

苷;Cot -G,可替宁糖苷;下同。

表5　部分吸烟者和被动吸烟者尿液中的烟碱及其9种代谢物的浓度①

(μg/L )

尿样②

N ic Cot OHCot N ic -G Cot -G OHCot -G NN ic Ncot NNO C NO 1#

238.0

②

300.1452.058.847.230.114.428.241.230.62#324.8910.23040.0380.01648.0664.045.6102.8552.0332.63#736.0701.51072.0488.0920.0304.441.180.8612.0190.64#544.01092.21036.0343.2632.0181.242.276.41076.0114.65#228.0114.9164.062.0101.670.416.223.159.642.36#464.0839.22348.037.415

.01020.036.475.6288.0229.27#836.01491.85840.0420.01944.01776.050.0102.4420.0500.08#1176.0595.01428.0254.8784.0338.848.653.6375.6159.59#480.01274.3880.0636.0904.0184.056.617.2972.0179.510#177.2131.3366.454.046.054.74.918.318.031.711#10.021.639.2nd

③

5.1nd 3.4nd 2.6nd 12#28.019.240.8nd 8.4nd 2.5nd 1.6nd 13#18.418.755.2nd 7.2nd 9.3nd 5.6nd 14#7.410.320.6nd nd nd 4.7nd nd nd 15#

21.2

11.1

34.3

nd

nd

nd

nd

nd

2.0

nd

①3次平行测定的平均值;②1#～10#为吸烟者尿样,11#～15#为被动吸烟者尿样;③nd 未检出。

3

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3　结论

LC -MS/MS 法可以同时测定吸烟者和被动吸烟

者尿液中烟碱及其9种代谢物,前处理简单,重复性好,准确性高,适合批量尿样中烟碱及其9种代谢物的快速分析;烟碱、可替宁、反3’-羟基可替宁有可能作为人体尿液中被动吸烟的生物标记物。

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