PCR步骤

RT-PCR实验步骤

一、总RNA提取

1）试剂配制

1. 0.1TPC水：1000mL双蒸水中加入1mLDEPC，室温下静置4小时。（①用来泡使用

器具处理12小时；②在120℃下高压灭菌30分钟后室温放置备用用来溶解RNA。） 2. 氯仿 3. 异丙醇

4. 75%乙醇：用无水乙醇和高压后的DPEC水配制，现配现用。

2）操作步骤：

1. 样品处理

a. 组织：将组织放在液氮中磨碎（低温处理）。每50-100mg组织加1mL裂解液TRZOL，

用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过裂解液TRZOL体积的十分之一。 b. 单层培养细胞；直接在培养板上加入裂解液TRZOL裂解细胞，每10cm2面积加1mL

TRZOL。用取样器抽打几次。（注意：裂解液RZ的加入量根据培养瓶面积决定，不是由细胞数决定。如果加量不足，可能导致提取的RNA中有DNA污染。）

c. 细胞悬液：离心取细胞，弃上清。每5-10×106动物细胞和植物细胞加入1mL裂解液RZ。

加裂解液RZ前不要洗涤细胞，以免降解RNA。

d. 血液：直接取新鲜血液，加入3倍体积RZ（推荐0.25mL血液+0.75mLRZ），充分震荡

混匀。

2. 将裂解样品在室温放置5分钟，使得核酸蛋白质复合物完全分离。

3. 4℃ 12,000rpm离心5分钟，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中。（注意：如果

样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可加此步骤离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，RNA存在于上清溶液中。） 4. 加入1/5体积氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置5分钟。

5. 4℃ 12,000rpm离心15分钟，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，

RNA主要在水相中，将水相转移到新管中。 6. 缓慢加入等体积异丙醇，室温静置5分钟。 7. 4℃ 12,000rpm离心10分钟,。

8. 洗脱沉淀：弃上清，向沉淀中加入1mL的75%无水乙醇，震荡混匀， 4℃ 12,000rpm

离心5分钟。

9. 弃上清，通风厨内挥干75%无水乙醇，加入适量（20~30μL）DEPC水溶解后放置-80℃

保存。

预防RNase污染，应注意以下几方面：

1. 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。 2. 使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。

3. RNA在TRNzol试剂中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含

RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。

4. 配制溶液应使用无RNase的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%

(v/v),放置过夜，高压灭菌。）

二、DNA去除及cDNA扩增

1）基因组DNA的除去反应。 试剂 5×gDNA Eraser Buffer gDNA Eraser Total RNA RNase Free dH2O 42℃ 2min (或者室温10min)

4℃

使用量 2μL 1μL *1 Up to 10 2μL 2）反转录反应。

试剂 5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time) PrimeScripe RT Enzyme Mix I RT Primer Mix 1.的反应液 RNase Free dH2O 37℃ 15min 85℃ 5s 4℃

*1 20μL反应体系可最大使用1μg的Total RNA

使用量 4μL 1μL 1μL 10μL Up to 20 μL 注意事项：

1. 避免多次反复冻融RNA，使RNA保持在冰浴中处于融化状态。 2. 试剂盒各组成成分应在-20℃保存。 3. cDNA产物应置于-20℃保存。

三、PCR反应

1） PCR反应体系：

模板cDNA 0.5μL 2×PCR Master 12.5μL 灭菌ddH2O 11μL 上游引物 0.5μL 下游引物 0.5μL Total 25μL

2） 反应条件：

94℃ 5min 94℃ 30s

55℃ 30s 30-35cycles(具体反应体系根据自己需求改变条件) 72℃ 30s 72℃ 5min 4℃ ∞

扩增产物-20℃保存。

四、PCR产物电泳

1）试剂配制

1. 50×TAE：

Tris Base 24.2g EDTANa2 3.72g ddH2O 60mL 混匀后加入5.71mL冰醋酸

定容至100mL，4℃保存备用，使用时稀释成1×工作液。

2. 6×上样缓冲液（4℃保存）：溴酚蓝0.0025g，蔗糖0.4g，双蒸水定容至1mL。

3. EB替代品（20mL琼脂糖凝胶加入0.5μL，30mL琼脂糖凝胶加入0.8μL）

2）操作步骤

1. 制胶：① 2%琼脂糖凝胶（跑cDNA）：0.6g琼脂糖加入30mL 1×TAE中，微波炉中高温熔化2-3次，每次1min，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入EB替代品，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min充分凝固，转入电泳槽。 ② 1%琼脂糖凝胶（跑RNA）：0.3g琼脂糖加入30mL 1×TAE中，RNA容易感染，所以跑的时候最好用新配。

2. 加样：①跑cDNA （2ul 6 *buffer 与10ul的cDNA 混匀后 取10ul加到凝胶孔中 ） Maker：5μL 样品：5μL

电泳条件：120V，15min ②跑RNA

Loading buffer 1μL 1×TAE 3μL RNA 2μL

电泳：100V左右电泳30--40分钟。 扩增条件：U6和microRNA-199a： 94℃ 3min 94℃ 30s

60℃ 30s 30cycles 72℃ 30s 72℃ 5min 4℃ ∞

注：电泳跑胶时间10-15min，U6和microRNA-199a分子量小不需要跑那么长时间，时间跑长了反而会出现两条条带。 GAPDH 和 Mn-SOD： 94℃ 3min 94℃ 30s

55℃ 30s 30cycles 72℃ 30s

72℃ 7min 4℃ ∞ CHOP和Caspase12：

94℃ 3min 94℃ 30s

51℃ 30s 35cycles 72℃ 72℃ 4℃

30s 5min ∞

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/afy2.html