普通生物学实验（三）

普通生物学实验（三）

教 案

目 录

35、细菌的简单染色、革蓝氏染色???????????????????????3 36、细菌的芽孢、荚膜、鞭毛染色鉴定及运动性观察???????????????5 37、微生物细胞形态及菌落特征观察??????????????????????11 38、培养基制作、灭菌与无菌操作接种技术??????????????????? 19 39、微生物的分离纯化及稀释平板菌落计数???????????????????35 附：微生物的菌种保藏?????????????????????????????41 40、微生物鉴定中常用的生化反应……………………………………………………………45 附：微生物自动鉴定仪鉴定???????????????????????????48 41、微生物细胞大小测定及显微镜直接计数 ??????????????????51 42、乳酸菌分离及食用乳酸制作 ???????????????????????55 ①乳酸菌分离与鉴定?????????????????????????????55 ②食用乳酸制作???????????????????????????????55 43、微生物营养和环境条件设计实验 ?????????????????????57 44、水体中微生物检测 ?????????????????????????62 ①水体中细菌总数的检测???????????????????????????62 ②水体中大肠菌群的检测???????????????????????????65 参考文献??????????????????????????????????68

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实验三十五 细菌的简单染色及革兰氏染色

一、实验目的与要求

1、 学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法； 2、 学习显微镜油镜观察的方法；

3、 进一步学习并掌握无菌操作技术要点。 二、重点与难点

1、 在取菌涂片的过程中怎样操作才能保证斜面菌种不受到污染？

2、革兰氏染色实验中首先是涂片的厚薄会对结果有很大影响；其次是在媒染1min后一定要用水洗去碘液，此步不可以省去；第三脱色20～25s应立即水洗。 三、教学方法与手段

本次实验课主要采取讲授法和演示法,辅以视频影象资料进行教学。 四、实验内容 1、 细菌的简单染色； 2、 细菌的革兰氏染色。 五、实验原理

用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿）等使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。

简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法，简单染色一般难于辨别细菌细胞的构造。

革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（C）和革兰氏阴性菌（G）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G＋菌和G－菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。 六、实验材料

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+

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1、活材料：培养12～16h的苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），培养24h 的大肠杆菌（Escherichia coli）。

2、染色液和试剂：结晶紫、卢哥氏碘液、95%酒精、番红、复红、二甲苯、香柏油。 七、实验用品

废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、吸水纸、滴管、玻片搁架、镊子、洗瓶、香柏油、无菌水、生物显微镜等。 八、实验方法 （一）简单染色

1、涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂苏云金芽胞杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌悬液。再取干净载玻片一块，挑刚制成的苏云金芽胞杆菌浓菌悬液2～3环涂在左边制成薄的涂面，将大肠杆菌的浓菌液取2～3环涂在右边制成薄涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。 2、晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方用文火烘干。★是否还有其它方法？ 3、固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2～3次固定，以不烫手为宜。★为什幺要进行该步骤？

4、染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色1～2min。 5、水洗：用水洗去涂片上的染色液。

6、干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。

7、镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。★怎样操作才能做到既快而又不易损坏玻片地调准焦距？ （二）革兰氏染色

1、涂片：涂片方法与简单染色涂片法相同。★涂片厚薄对结果有影响吗？ 2、晾干：与简单染色法相同。 3、固定：与简单染色法相同。

4、结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量的结晶紫染色液染色1min，以盖满细菌涂面。

5、水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。 6、媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。 7、水洗：用水洗去碘液，★此步可否省去？

8、脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇，脱色20～25s至流出液无色，立即水洗。★为什么要立即水洗？

9、复染：滴加番红复染2～5min。

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10、水洗：用水洗去涂片上的番红染色液。

11、晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。

12、镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。 13、实验完毕后的处理

⑴ 将浸过油的镜头按下述方法擦试干净: ①先用擦镜纸将油镜头上的油擦去； ②用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2～3次；

③再用干净的擦镜纸将镜头擦2～3次，注意擦镜头时向一个方向擦试。

⑵ 观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，并放入盛有75%酒精溶液的回收缸中。 ⑶ 显微镜复原并做好使用登记。 九、作业与思考题 （一）、绘图

1、 简单染色后绘出苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli）

的形态图。

2、 革兰氏染色后绘图并注明金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌

（Escherichia coli）两菌的革兰氏染色的反应性。 （二）思考题

2、 在取菌涂片的过程中怎样操作才能保证斜面菌种不受到污染？ 3、 革兰氏染色成败的关键操作是哪一步？为什么？ 4、 为什么革兰氏染色法要选用幼龄菌种？

实验三十六 细菌的芽孢、荚膜、鞭毛染色及运动性观察

一、实验目的与要求

1、 学习并掌握细菌芽孢染色法，初步了解芽孢杆菌的形态特征； 2、 学习并掌握细菌荚膜染色法；

3、 学习并初步掌握细菌鞭毛染色法，观察细菌鞭毛的形态特征； 4、 学习用压滴法和悬滴法观察细菌的运动性。 二、重点与难点

1、细菌芽孢染色实验中改良的Schaeffer和Fulton氏染色法试管中菌悬液应充分打匀，制成浓稠的菌液。Schaeffer与Fulton氏染色法涂片后加染色液用酒精灯火焰加热过程中要随时添加染色液，切勿让标本干涸。

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2、采用负染色法进行细菌荚膜染色过程中，制片后应将涂片放在空气中晾干或用电吹风冷风吹干。若采用湿墨水法则要注意在制好的菌液上加盖玻片时勿留气泡，以免影响结果观察。 而干墨水法中要用6%葡萄糖液与菌体充分混匀。 三、教学方法与手段

本次实验课主要采取讲授法和演示法,辅以视频影象资料进行教学。实验过程中1-4项实验内容会按照学生分组情况调整各小组每个实验进行的先后顺序。 四、实验内容 1、 细菌芽孢染色； 2、 细菌荚膜染色； 3、 细菌鞭毛染色； 4、 细菌的运动性观察。 五、实验原理

细菌的芽孢壁较细胞壁厚而致密，透性低，不易着色，也不易脱色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色，芽胞呈无色透明状。芽孢染色法就是基于细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同，用不同的染料进行着色，使芽孢和菌体呈现不同的颜色而加以区别。所有的芽孢染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽孢着色。当芽孢着色时，菌体也会着色，然后水洗，芽孢染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。再用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，形成鲜明的对照，便于观察。

荚膜是包在细菌细胞壁外面的一层黏胶状或胶质状物质，成分为多糖、糖蛋白或多肽，与染料间的亲和力弱，不易着色，故通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一浅色或无色的透明圈。由于荚膜的含水量在90%以上，故染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形，影响观察结果。

细菌的鞭毛极细，直径一般为10～20nm ,超过了普通光学显微镜的分辨力，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，将鞭毛直径加粗，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色的方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。

细菌是否具有鞭毛是细菌分类鉴定重要特征之一。采用鞭毛染色法虽能观察到鞭毛的形态、着生位置和数目，但此法既费时又麻烦。如果只需查清供试菌是否有鞭毛，可采用悬滴法或水封片法即压滴法，直接在光学显微镜下检查活细菌是否具有运动能力，以此来判断细菌是否有鞭毛。此法较快速、简便。

悬滴法就是将菌液滴加在洁净的盖玻片中央，在其周边涂上凡士林，然后将它倒盖在有凹槽的载玻片中央，即可放置在普通光学显微镜下观察。水封片法是将菌液滴在普通的载玻

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片上，然后盖上盖玻片，置显微镜下观察。

细菌依赖鞭毛的运动方式，与鞭毛的排列形式和数目有关，但根据细菌的运动方式，对鞭毛的数目和排列方式只能作大致判断。单毛菌和丛毛菌多做直线运动，周毛菌多做翻转运动。依赖鞭毛的运动称为真性运动。无鞭毛细菌做左右颤动而不改变其位置，这种运动称为非真性运动，亦称布朗运动。 六、实验材料

1、活材料：培养36h的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillus subtilis）；培养3～5d的胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus，俗称“钾细菌”），该菌在甘露醇作碳源的培养基上生长时，荚膜丰厚；培养12～16h 的水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae ），黏质赛氏杆菌（Serratia marcescens ）或荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens ）斜面菌种；培养12～16h的枯草杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）以及荧光假单胞菌（Pseudomonas Fluorescens）。

2、染色液和试剂：5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液；Tyler法染色液、用滤纸过滤后的绘图墨水、复红染色液、黑素、6%葡萄糖水溶液、1%甲基紫水溶液、甲醇、20%CUSO4水溶液；硝酸银染色液（包括A液和B液，）、Leifson 染色液；香柏油、二甲苯。 七、实验用品

小试管（75mm×10mm）、烧杯（300mL）、载玻片、凹载玻片、盖玻片、滴管、废液缸、玻片搁架、接种环、擦镜纸、吸水纸、镊子、记号笔、洗瓶、凡士林、无菌水、水浴锅、生物显微镜等。 八、实验方法 （一）细菌芽孢染色

1、改良的Schaeffer和Fulton氏染色法

⑴制备菌液：加1～2滴无菌水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2～3环菌体于试管中并充分打匀，制成浓稠的菌液。★为什么要制成浓稠的菌液？

⑵加染色液：加5%孔雀绿水溶液2～3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。

⑶加热：将此试管浸于沸水浴，加热15～20min。

⑷涂片：用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的载玻片上，做成涂面，晾干。 ⑸固定：将涂片通过酒精灯火焰3次。

⑹脱色：用水洗直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。

⑺复染：加番红水溶液染色5min后，倾去染色液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。 ⑻镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜观察。 结果：芽胞呈绿色，芽胞囊和菌体为红色。 2、Schaeffer与Fulton氏染色法

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⑴涂片：按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片。 ⑵晾干固定：待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过2～3次。 ⑶染色：

①加染色液：加5%孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），然后，将涂片放在铜板上，用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持15～20min。加热过程中要随时添加染色液，切勿让标本干涸。★加热时温度可否太高？

②水洗：待玻片冷却后，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。 ③复染：用番红液染色5min。 ④水洗、晾干或吸干。

⑤镜检：先低倍、再高倍，最后在油镜下观察芽胞和菌体的形态。 结果：芽孢呈绿色，菌体为红色。 （二）细菌荚膜染色

细菌荚膜染色方法很多，其中以湿墨水方法较简便，并且适用于各种有荚膜的细菌。如用相差显微镜检查则效果更佳。 1、负染色法

⑴制片：取洁净的载玻片一块，加蒸馏水一滴，取2～3环菌体放入水滴中混匀并涂布。 ⑵干燥：将涂片放在空气中晾干或用电吹风冷风吹干。★为什么不能在火焰上方烘干？ ⑶染色：在涂面上加复红染色液染色2～3min。 ⑷水洗：用水洗去复红染液。

⑸干燥：将染色片放空气中晾干或用电吹风冷风吹干。

⑹涂黑素：在染色涂面左边加一小滴黑素，用一边缘光滑的载玻片轻轻接触黑素，使黑素沿玻片边缘散开，然后向右一拖，使黑素在染色涂面上成为一薄层，并迅速风干。 ⑺镜检：先低倍镜，再高倍镜观察。

结果：背景灰色，菌体红色，荚膜无色透明。 2、湿墨水法

⑴制菌液：加1滴墨水于洁净的载玻片上，挑2～3环菌体与其充分混合均匀。 ⑵加盖玻片：放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸去多余的菌液。★加盖玻片时勿留气泡，以免影响观察。 ⑶镜检：先用低倍镜、再用高倍镜观察。

结果，背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即为荚膜。 3、干墨水法

⑴制菌液：加1滴6%葡萄糖液于洁净载玻片一端，挑2～3环胶质芽胞杆菌，与葡萄糖液充分混合，再加1环墨水，充分混匀。★为什么加6%葡萄糖液？

⑵制片：左手执玻片，右手另拿一边缘光滑的载玻片，将载玻片的一边与菌液接触，使菌

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液沿玻片接触处散开，然后以30度角，迅速而均匀地将菌液拉向玻片的一端，使菌液铺成一薄膜。

⑶干燥：空气中自然干燥。

⑷固定：用甲醇浸没涂片，固定1min，立即倾去甲醇。 ⑸干燥：在酒精灯上方，用文火干燥。 ⑹染色：用甲基紫染1～2min。 ⑺水洗：用自来水轻洗，自然干燥。

⑻镜检：先用低倍镜观察，再用高倍镜观察。

结果：背景灰色，菌体紫色，荚膜呈一清晰透明圈。 4、Tyler法

⑴涂片：按常规法涂片，可挑2～3环菌体与水充分混合，并将黏稠的菌液尽量涂开，但涂布的面积不宜过大。

⑵干燥：在空气中自然干燥。 ⑶染色：用Tyler染色液染5～7min。

⑷脱色：用20%CUCO4水溶液洗去结晶紫，脱色要适度，冲洗2遍即可。用吸水纸吸干，并立即加1～2滴香柏油于涂片处，以防止CUCO4结晶的形成。★为什么是用20%CUCO4脱色，而不是用水洗脱色？

⑸镜检：先用低倍镜观察，再用高倍镜观察。观察完毕后注意用二甲苯擦去镜头上的香柏油。

结果：背景蓝紫色，菌体紫色，荚膜无色或浅紫色。 （三）细菌鞭毛染色 1、镀银法染色

⑴清洗玻片 选择光滑无裂痕的玻片，最好选用新的。为了避免玻片相互重迭，应将玻片插在专用金属架上，然后将玻片置洗衣粉过滤液中，洗衣粉煮沸后用滤纸过滤，以除去粗颗粒，煮沸20min。取出稍冷后用自来水冲洗、晾干，再放入浓洗液中浸泡5～6天。浓洗液的成分是：重铬酸钾60g ,浓硫酸460mL ,水300mL；配制方法是：重铬酸钾溶解在温水中，冷却后再徐徐加入浓硫酸。使用前取出玻片，用自来水冲去残酸，再用蒸馏水洗。将水沥干后，放入95%乙醇中脱水。

⑵菌液的制备及制片 菌龄较老的细菌容易脱落鞭毛，所以在染色前应将待染细菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培养基斜面上连续移接3～5代，要求培养基表面湿润，斜面基部含有冷凝水，以增强细菌的运动力。最后一代菌种放恒温箱中培养12～16h。然后，用接种环挑取斜面与冷凝水交接处的菌液3～5环，移至盛有1～2mL无菌水的试管中，使菌液呈轻度混浊。将该试管放在37℃恒温箱中静置10min。放置时间不宜太长，否则鞭毛会脱落，让幼龄菌的鞭毛松展开。然后，吸取少量菌液滴在洁净玻片的一端，立即将玻片倾斜，使菌液缓慢地流

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向另一端，用吸水纸吸去多余的菌液。让涂片自然干燥。

用于鞭毛染色的菌体也可用半固体培养基培养。方法是将0.3～0.4%的琼脂牛肉膏培养基熔化后倒入无菌平皿中，待凝固后，在平板中央点接活化了3～4代的细菌，恒温培养12～16h后，取扩散菌落边缘的菌体制作涂片。 ⑶染色

①滴加A液，染4～6min。 ②用蒸馏水充分洗净A液。

③用B液冲去残水，再加B液于玻片上，在酒精灯火焰上加热至冒气，约维持0.5～1min，加热时应随时补充蒸发掉的染料，不可使玻片出现干涸区。

④用蒸馏水洗，自然干燥。

⑷镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜检查。 结果：菌体呈深褐色，鞭毛呈浅褐色。 2、改良Leifson染色法 ⑴清洗玻片法同前。

⑵配制染料：见附录2-9。染料配好后要过滤15～20次后染色效果才好。 ⑶菌液的制备及涂片。 ①菌液的制备同前。

②用记号笔在洁净的玻片上划分3～4个相等的区域。

③放1滴菌液于第一个小区的一端，将玻片倾斜，让菌液流向另一端，并用滤纸吸去多余的菌液。

④干燥 在空气中自然干燥。 ⑷染色

①加染色液于第一区，使染料覆盖涂片。隔数min 后再将染料加入第二区，依此类推，相隔时间可自行决定，其目的是确定最合适的染色时间，而且节约材料。

②水洗：在没有倾去染料的情况下，就用蒸馏水轻轻地冲去染料，否则会增加背景的沉淀。

③干燥：自然干燥。

⑸镜检：先低倍观察，再高倍观察，最后再用油镜观察，观察时要多找一些视野，不要指望在1～2个视野中就能看到细菌的鞭毛。

结果：菌体和鞭毛均染成红色。 （四）细菌的运动性观察

1、制备菌液：在幼龄菌斜面上，滴加3～4mL无菌水，制成轻度混浊的菌悬液。 2、涂凡士林：取洁净无油的盖玻片1块，在其四周涂少量的凡士林。

3、滴加菌液：加1滴菌液于盖玻片的中央，并用记号笔在菌液的边缘做一记号，以便在显微镜观察时，易于寻找菌液的位置。

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4、盖凹玻片：将凹玻片的凹槽对准盖玻片中央的菌液，并轻轻地盖在盖玻片上，使两者粘在一起，然后翻转凹玻片，使菌液正好悬在凹槽的中央，再用铅笔或火柴棒轻轻压盖玻片，使玻片四周边缘闭合，以防菌液干燥（图示）。

若制水浸片，在载玻片上滴加一滴菌液，盖上盖玻片后即可置显微镜下观察。 5、镜检：先用低倍镜找到标记，再稍微移动凹玻片即可找到菌滴的边缘，然后将菌液移到视野中央高倍镜观察。由于菌体是透明的，镜检时 可适当缩小光圈或降低聚光器以增大反差，便于观察。镜检时要仔细辨别是细菌的运动，还是分子作布朗运动，前者在视野下可见细菌自一处游动至它处，而后者仅在原处左右摆动。细菌的运动速度依菌种不同而异，应仔细观察。

结果：有鞭毛的枯草杆菌和假单胞菌可看到活跃的活动，而无鞭毛的金黄色葡萄球菌不运动。

九、作业与思考题

（一）绘图：绘出所用材料的芽孢和菌体的形态图；绘出Bacillus mucilaginosus的荚膜和菌体形态图，并注明各部位的名称；绘出鞭毛菌的形态图；绘出所看到的细菌的形态图，并用箭头表示其运动方向。 （二）思考题

1、用简单染色法能否观察到细菌的芽孢？

2、若涂片中观察到的只是大量游离芽胞，很少看到芽孢囊及营养细胞，你认为这是什么原因？

3、通过荚膜染色法染色后，为什么被包在荚膜里的菌体着色而荚膜不着色？ 4、用鞭毛染色法准确鉴定一株细菌是否具有鞭毛，要注意哪些环节？

5、悬滴法中，为什么要涂凡士林？为什么加的菌液不能太多？如果发现显微镜视野内大量细菌向一个方向流动，你认为是什么原因造成的？

实验三十七 微生物细胞形态及菌落特征观察

一、实验目的与要求

1、学习制水浸片观察蓝细菌的形态；

2、学习用放线菌的玻璃纸培养物观察放线菌的个体形态； 3、 学习插片培养法观察放线菌形态； 4、 学习放线菌的印片染色法； 5、 学习自制水浸片观察霉菌的形态； 6、 学习接合孢子的培养和观察方法； 7、 学习酵母菌子囊孢子的培养及观察方法；

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8、 学习压片法观察伞菌的担子和担孢子的形态； 10、学习观察衣藻和水绵的形态；

11、掌握四大类微生物的菌落特征；初步掌握从菌落特征识别四大类微生物的方法。 二、重点与难点

1、区分和识别四大类微生物的菌落特征和个体形态上有哪些相同点和不同点？为什么？ 2、运用学到的理论知识解释从微生物菌落形态区分四大类微生物有哪些意义？ 三、教学方法与手段

本次实验课主要采取讲授法和演示法进行教学。实验过程中1-10项实验内容会按照学生分组情况调整各小组每个实验进行的先后顺序。 四、实验内容 1、 蓝细菌的观察；

2、 用玻璃纸琼脂平板透析培养法观察放线菌形态； 3、 用插片培养法观察放线菌形态； 4、 放线菌的印片染色法；

5、 霉菌水浸标本片的制备与观察；

6、 霉菌接合孢子的培养与观察霉菌接合孢子的培养与观察； 7、 酵母菌子囊孢子的培养与观察； 8、 伞菌子实体的压片观察； 9、 衣藻和水绵的形态观察；

10、微生物菌落特征观察微生物菌落特征观察。 五、实验原理

蓝细菌是光能营养菌，广泛分布于自然界，它们普遍生长在河流、海洋、湖泊和土壤中，并在极端环境中也能生长。部分蓝细菌还具有固定空气中氮素的能力，一些蓝细菌还能与真菌、苔藓、蕨类和种子植物共生。

最简单的蓝细菌为杆状或球形的单细胞生物，多数则形成不分枝的丝状体，由许多单个细胞联成一串，并为一共同的胶质鞘套包被。蓝细菌主要进行分裂繁殖，单细胞蓝细菌分裂后形成群体，包围在胶质层内。丝状蓝细菌细胞在鞘内排列成行，通过细胞分裂使菌丝加长，菌丝不分枝，但有时有假分枝。某些丝状蓝细菌能在丝状体中间或顶部产生异形胞，异形胞比营养细胞稍大，具厚壁，两端有极节，只含有叶绿素a，是固氮蓝细菌固氮的场所。另一些蓝细菌可形成由营养细胞膨大、细胞壁加厚的厚垣孢子。在不良环境下，厚垣孢子可处于休眠状态，待环境适宜时，孢子再萌发成新菌丝。

放线菌自然生长的个体形态观察，目前多采用玻璃纸琼脂透析培养法。

玻璃纸具有半透膜特性，其透光性与载玻片基本相同，采用玻璃纸琼脂平板透析培养，能使放线菌生长在玻璃纸上，然后将长菌的玻璃纸剪取小片，贴放在载玻片上，用显微镜镜

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检可观察到自然生长的放线菌个体形态。另外，采用插片培养法也能观察放线菌的个体形态。

放线菌的孢子丝形状和孢子排列情况是放线菌分类的重要依据，为了不打乱孢子的排列情况，常用印片法进行制片观察。现在，放线菌孢子的排列和孢子的表面形状是用电子显微镜来进行观察的。

霉菌的营养体是分枝的丝状体。其个体比细菌和放细菌大得多，分为基内菌丝和气生菌丝。气生菌丝中又可分化出繁殖丝。不同霉菌的繁殖菌丝可以形成不同的孢子。

霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，且孢子容易飞散，所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成的霉菌标本片的特点是：细胞不变形，具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长时间，溶液本身呈蓝色，有一定染色效果。

利用培养的玻璃纸上的霉菌作为观察材料，可以得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌形态；也可以直接挑取生长在平板中的霉菌菌体制水浸片观察。

接合孢子是霉菌的一种有性孢子，由两条不同性别的菌丝特化的配子囊接合而成。有的为同宗配合，有的为异宗配合。根霉和蓝色梨头霉的接合孢子都属于异宗配合，将它们的两种不同性别的菌株分别记为“＋”和“－” ，将“＋”和“－”菌株接种在同一琼脂平板中，经一定时间培养后，即可产生出接合孢子。

酵母菌的有性繁殖一般产生子囊孢子。其形成过程为：两营养细胞各伸出一个小突起而相接触，使两个细胞结合起来，而后接触处的细胞溶解，经质配和核配后，形成双倍体核，原来的细胞形成合子。此双倍体细胞可以进行芽殖。在适宜条件下，合子减数分裂，双倍体核分裂成4～8个单倍体核，核外再围以原生质逐渐形成子囊孢子，子囊孢子包含在由母细胞壁演变而来的子囊即原来的二倍体细胞中。子囊孢子的形成与否及其数量和形状，是鉴定酵母菌的依据之一。

将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）从营养丰富的培养基上移植到含有醋酸钠和葡萄糖或棉籽糖的产孢培养基上，于适温下培养，即可诱导其子囊孢子的形成。本实验即以酿酒酵母为材料观察酵母菌的子囊孢子。

磨菇的子实体形如伞状，其有性繁殖器担子和担孢子着生在伞盖下面菌褶两边的子实层上，用石蜡切片或者徒手切片法制成玻片标本，可在显微镜下观察到担子和担孢子的形状、颜色及其着生方式等结构。这里介绍一种压片方法，能很容易对伞菌如双孢蘑菇、香菇、平菇及其它常见野生菇类的子实层进行较为细致的显微镜观察。

衣藻是一种单细胞的藻类，水绵是一种丝状绿藻，它们在自然界里分布广泛、在池塘水域和土壤中都有存在。制水浸片在显微镜下可看到它们的形态。

区分和识别各大类微生物通常包括菌落特征和个体形态的观察。由于微生物个体形态结构、分裂方式、运动能力、生理特征以及产生色素等能力的不同，因而在固体培养基上生长的菌落各有特点。微生物的个体形态是菌落特征的基础，而菌落特征又是个体形态的集中反应。每一大类微生物都有其独特的细胞形态，故它们在一定的培养条件下都有各自的菌落特

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征，即它们的菌落在形态、大小、色泽、透明度、粘稠度、边缘情况等都有明显的差异。一般根据这些差异就能识别四大类微生物。此法简便快速，在科研和生产中常可采用。 六、实验材料

1、活材料：满江红鱼腥蓝细菌（Anabaena azollae ）；培养5～7d 的紫色直丝链霉菌（Streptomyces uiolaceorectus）的斜面菌种、吸水链霉菌“5102”（Streptomyces hygroscopicus var. Yingchengensis（5102））斜面菌种；培养5～7d的吸水链霉菌“5102”

和紫色直丝链霉菌平板培养物；在马铃薯琼脂平板上生长或用玻璃纸透析培养法培养3～4d 的葡枝根霉（Rhizpus stolonifer）、橘青霉（Penicillum citrinum）、黑曲霉（Aspergillus niger）；葡枝根霉（Rhizopus stolonifer）或蓝色梨头霉（Absidia coerulea）的“＋”、

“－”菌株各一支；酿酒酵母（S. cerevisiae）斜面菌种；从栽培场所或野外采集的成熟的伞菌子实体,也可用商品干菇代用；含有衣藻（Clamydomonas sp.）的绿色池塘水、自然水域中的采集或者人工培养的水绵（Spirogyra sp.）；细菌：大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）；放线菌：灰色链霉菌（Streptomyces griseus ），紫色直丝链霉菌（Streptomyces violaceorectus ）；酵母菌：酿酒酵母（Saccharomyces cereuisiae），产朊假丝酵母(Candida utilis)；霉菌：桔青霉（Penicillum citrinum）、

黑曲霉（Aspergillus niger）等；

2、培养基：高氏一号琼脂培养基。马铃薯琼脂培养基、克氏培养基或麦氏培养基的试管斜面、

3、试剂：石炭酸复红染色液、乳酸石炭酸棉蓝染色液、50%酒精（V/V）、3%的酸性酒精、美蓝染色液、50g/L的KOH溶液、碘液、新鲜稻草、1%碳酸氢钠溶液、甲基绿。 七、实验用品

无菌平皿、玻璃纸、9mL无菌水若干支、酒精灯、火柴、接种环、玻璃刮铲、1mL无菌吸管、剪刀、小刀、有凹窝的载玻片、载玻片、盖玻片、解剖针、镊子、眼科镊子、5%甘油、蒸馏水、滴管、玻璃瓶、吸水纸、量杯、天平、pH试纸、试管、玻璃缸、三脚架、石棉网、烧杯、培养皿、药棉、巴氏吸管、放大镜、生物显微镜。 八、实验方法 （一）蓝细菌的观察

用红萍观察蓝细菌的形态。其方法是：在载玻片上加一滴蒸馏水，取红萍叶片一块，放在水滴中，用解剖针将叶片撕开，盖上盖玻片，再用手指压一下，使红萍叶片散开，置显微镜下观察，先用低倍镜，后用高倍镜观察，可见到共生在红萍小叶腹腔中的满江红鱼腥蓝细菌（Anabaena azollae ）。可见到蓝细菌的营养细胞、异形胞、极节和由营养细胞组成的藻殖段。

（二）用玻璃纸琼脂平板透析培养法观察放线菌形态 1、将玻璃纸剪成培养皿大小，用旧报纸隔层迭好后灭菌。

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2、将放线菌斜面菌种制成10－3的孢子悬液。

3、将高氏一号琼脂培养基熔化后在火焰旁倒入无菌培养皿内，每皿倒15mL左右，待培养基凝固后，在无菌操作下用镊子将无菌玻璃纸覆盖在琼脂平板上即制成玻璃纸琼脂平板培养基。

4、分别用1mL无菌吸管取0.2mL吸水链霉菌“5102”孢子悬液、紫色直丝链霉菌孢子悬液分别滴加在两个玻璃纸琼脂平板培养基上，并用无菌玻璃刮铲涂抹均匀。 5、将接种的玻璃纸琼脂平板置28～30℃下培养。

6、在培养至3d ，5d ，7d 时，从温室中取出平皿。在无菌环境下。打开培养皿，用无菌镊子将玻璃纸与培养基分离，用无菌剪刀取小片置于载玻片上用显微镜观察。可见到放线菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝。 （三）放线菌的插片培养法

放线菌的插片培养是将放线菌菌种制成孢子悬液，浓度以10－2～10－3为好，取0.2mL放在适合放线菌生长的平板培养基上，用玻璃刮铲涂布均匀，然后将灭过菌的盖玻片斜插入固体培养基中，置28～32℃下培养，3～5d 后取出盖玻片放在载玻片上镜检，可见自然生长的放线菌个体形态。可见到放线菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝。 （四）放线菌的印片染色法

1、制片：取干净载玻片一块，用小刀切取放细菌培养体一块，应带培养基切下，放在载玻片上，用另一载玻片对准菌块的气生菌丝轻轻按压，然后将载玻片垂直拿起。注意不要使培养体在玻片上滑动，否则会打乱孢子丝的自然形态。

2、固定：将印有放线菌的涂面朝上，通过酒精灯火焰2～3次加热固定。 3、染色：用石炭酸复红染色液染色1min。 4、水洗，晾干。★可否用吸水纸吸干?

5、镜检：先用低倍镜，后用高倍镜，最后用油镜观察，可见孢子丝、孢子的形态及孢子排列情况。

（五）霉菌水浸片标本的制备与观察 1、 制水浸片观察法

在载玻片上滴加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液或蒸馏水，用解剖针从生长有霉菌的平板中挑取少量带有孢子的霉菌菌丝，用50%的乙醇浸润，再用蒸馏水将浸过的菌丝洗一下，然后放入载玻片上的液滴中，仔细地用解剖针将菌丝分散开来。盖上盖玻片，勿使产生气泡，且不要再移动盖玻片，先用低倍镜观察，必要时转换高倍镜镜检，并记录观察结果。 2、玻璃纸透析培养观察法

⑴ 玻璃纸的选择与处理：要选择能够允许营养物质透过的玻璃纸。也可收集商品包装用的玻璃纸，加水煮沸，然后用冷水冲洗。经此处理后的玻璃纸若变硬，必定是不可用的，只有那些软的可用。将那些可用的玻璃纸剪成适当大小，用水浸湿后，夹于旧报纸中，然后一

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起放入平皿内121℃灭菌30min备用。

⑵ 菌种的培养：按无菌操作法，倒平板，冷凝后用灭菌的镊子夹取无菌玻璃纸贴附于平板上，再用接种环沾取少许霉菌孢子，在玻璃纸上方轻轻抖落于纸上。然后将平板置28～30℃下培养3～5天，曲霉和青霉即可在玻璃纸上长出单个菌落（根霉的气生性强，形成的菌落铺满整个平板）。

⑶ 制片与观察：剪取用玻璃纸透析法培养3～4d 后长有菌丝和孢子的玻璃纸一小块，先放在50%乙醇中浸一下，洗掉脱落下来的孢子，并赶走菌体上的气泡，然后正面向上贴附于干净载玻片上，滴加1～2滴乳酸石炭酸棉蓝液，小心地盖上盖玻片，注意不要产生气泡，不要移动盖玻片，以免搞乱菌丝。

标本片制好后，先用低倍镜观察，必要时再换高倍镜。注意观察菌丝有无隔膜，有无假根、足细胞等特殊形态的菌丝。注意其无性繁殖器官的形状和构造，孢子着生的方式和孢子的形态、大小等。

（六）霉菌接合孢子的培养与观察

1、倒平板：按无菌操作法，将已熔化的琼脂培养基倒入无菌平板中，待凝固后接种。 2、接种：用接种环挑取葡枝根霉“＋”菌株的菌丝少许，在平板左侧点接一下，烧环后，再挑取“－”菌株的菌丝在平板右侧点接一下。★为什么在左右两侧点接菌种？注意：两菌之间应有一定距离，菌种在接合培养前要活化2～3代。 3、培养：将接种好的平板置28～30℃下培养5d 后观察。

4、制片与观察：取一块干净载玻片，滴加1滴蒸馏水或乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针挑取“＋”、“－”菌丝间的菌丝少许,★为什么是取两菌落间的菌丝来进行观察？用50%酒精浸润并用水洗涤,放于液滴中，小心分散菌丝，加盖盖玻片后先置低倍镜下观察，必要时再转换高倍镜。注意观察不同时期形成的接合孢子，以及接合孢子和配子囊的形状。 （七）酵母菌子囊孢子的培养与观察

1、子囊孢子的培养：将酿酒酵母用马铃薯培养基活化2～3代后，转接于克氏或麦氏斜面培养基上，于25℃培养3～5d ，即可形成子囊孢子。

2、制片与观察：于载玻片上加蒸馏水一滴，取子囊孢子培养体少许放入水滴中制成涂片，干燥固定后用石炭酸复红染色液加热染色5～10min,不能沸腾，倾去染液，用酸性酒精冲洗30～60s脱色，再用水洗去酒精，最后加美蓝染色液染色，5～10s 后用水洗去染液，用吸水纸吸干后置显微镜下镜检。子囊孢子为红色，菌体为青色。

亦可不经染色直接制水浸片观察。水浸片中的酵母菌的子囊为圆形大细胞，内有2～4个圆形的小细胞即为子囊孢子。 （八）伞菌子实体的压片观察

1、取载玻片和盖玻片数块，用干净纱布擦净后，用镊子夹住分别在酒精灯火焰上来回通过几次，以进一步烧去玻片上所沾污的有机物,注意：盖玻片很易烧碎，一定不要久烤。

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2、在冷却的载玻片中央加一小滴蒸馏水,如果选用干标本作观察材料，可用以50g/L的KOH溶液代替蒸馏水，能使干缩的担子及担孢子等组织结构复原到原来大小。再用尖头镊子在菌褶中间部分夹取米粒大小一块褶片置于载玻片的蒸馏水或KOH溶液中，并用解剖针将褶片分散,若用干菇，则要待稍浸润后再进行分散。

3、取盖玻片一块先使一边浸在载玻片上的溶液中，慢慢将盖玻片加盖在分散的褶片上，尽量不要把气泡封闭在盖玻片内。

4、用铅笔上的橡皮头挤压或轻轻敲打盖玻片,注意不要把盖玻片敲碎。至观察材料呈极薄的膜状分散后，即可置于显微镜下，先低倍镜后高倍镜观察。如果光线太强，可以通过升降聚光器或调节光圈，减弱视野亮度，便可清楚地看到担子、担孢子或其它结构的大小、形态和排列状态。

（九）衣藻和水绵的形态观察 1、衣藻的形态观察

到绿色池塘边取少量水，采回后镜检有无衣藻，若有，把它培养在自然水里。如果用自来水，必须静置1～2d ，让水里氯气散失，以免影响衣藻的生活。用滴管吸一滴含有衣藻的水，放在洁净的载玻片上，盖上盖玻片，放在低倍镜下观察。若能看到一个绿色、椭圆形的细胞活泼地在水里运动，可初步判断是衣藻，再换高倍镜观察。然后加一滴碘液或稀的碘酒，用吸水纸吸去一部分水，再用高倍镜观察。这时衣藻被杀死，染上了颜色，能清楚地看到它的细胞结构。衣藻是单细胞生物，外面由细胞壁包围着，里面有杯状的叶绿体，叶绿体中有一个蛋白核，前端还生着两条染上黄褐色的鞭毛和一个红色的眼点。 2、水绵的培养和观察

水绵是一种多细胞的绿藻，由于它的细胞外有胶质，手触摸时有滑腻感。

在静水池塘里采取漂浮着的像丝绵那样的绿色物，用手摸一摸，若有点滑腻，这便是水绵。采集时不要把刚毛藻和丝藻错认为水绵。虽然这三种绿色藻类都呈丝状，但刚毛藻是分枝的，丝藻只有2cm左右长，且一端附着在水里的砖头或木头上，像长了一层绿色的毛。

如果要培养水绵，可以用硝酸钾、硫酸镁和磷酸二氢钾各1g，溶解在1L水里，再加入3g碳酸钙，配制成培养液。把上述培养液加两倍水稀释，用来培养水绵，可以加速细胞的发育和分裂。

观察水绵时，用镊子取少量亮绿的水绵，放在载玻片上的水滴里，用解剖针轻轻地分开水绵的细丝，盖上盖玻片，用显微镜观察，就能看到由许多圆筒状细胞组成的藻丝。细胞里有螺旋盘绕的带状叶绿体。叶绿体上有一列蛋白核。

水绵在培养液里培养几天后，再移到盛有天然水的玻璃缸里。如果用自来水，要先把水放在缸里晒1～2d ，让水里的氯气散出。把缸里的水绵暴露在日光下，4～5d 以后可以得到接合生殖。春季，在静水池塘里也容易采集到接合生殖材料，水绵生长时大都呈亮绿色，形成接合孢子后转变成黄棕色。

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把接合生殖的水绵放在载玻片上的水滴中，盖上盖玻片，用显微镜观察，可以看到并排的两条水绵藻丝相对的两细胞生出突起，突起接触处的细胞壁消失，一个细胞里的原生质流到相对的一个细胞里去，形成合子。 （十）微生物菌落特征观察 1、已知菌落的观察与识别

⑴ 细菌和酵母菌菌落的观察和识别 细菌和酵母菌都是单细胞微生物，菌落有共同的特征，较湿润、光滑、透明、易挑起，菌落的正反面、边缘和中央颜色一致，质地较均匀。但两者也有区别，细菌的菌落较小、较薄、较透明、较湿润、颜色多样，较有“细腻”感。有鞭毛的细菌其菌落较扁平、边缘不规则。有芽孢的细菌菌落粗糙、多皱、不透明。酵母的菌落比细菌的大、厚，外观较稠、较不透明。

⑵ 放线菌和霉菌菌落的观察和识别 放线菌和霉菌的细胞都呈丝状，在固体培养基上都有基内菌丝即营养菌丝和气生菌丝的分化，因此它们的菌落外观干燥、不透明，呈蛛丝状或绒毛状，菌落与培养基结合紧密不易挑起。菌丝、孢子常分泌不同色素，故使菌落的正反面、中央和边缘表现不同的颜色。两者也有区别：放线菌比霉菌菌丝细，生长后期分化的孢子丝有大量的孢子，因而它的菌落比霉菌小而紧密，表面呈干粉状。霉菌的菌丝比放线菌粗长，菌丝生长快而松散，所以菌落大而疏松。

按照“菌落形态观察记录表”的项目，认真观察并比较四大类微生物的异同。 2、 认识未知菌

认真观察各编号的未知菌落的各项特征，运用区别各大类微生物的原则，分别归入相应的大类中，并将鉴别的结果填入“微生物菌落形态观察记录表”中。微生物菌落形态参见图示。

九、作业与思考题 （一）绘图：

1、绘出所观察到的红萍鱼腥蓝细菌的形态图，注意观察细胞排列及细胞形状，异形胞的结构，着生部位以及介于两个异形胞之间由一串营养细胞组成的藻殖段； 2、绘出吸水链霉菌“5102”和紫色直丝链霉菌自然生长的个体形态图； 3、绘出吸水链霉菌“5102”和紫色直丝链霉菌的孢子丝和孢子的形态图； 4、给出根霉、青霉、曲霉的个体形态图，并注明各部位名称； 5、绘出葡枝根霉接合孢子形态图，并注明配子囊、接合孢子的名称； 6、绘出酵母菌的子囊、子囊孢子形态图并注明各部位的名称； 7、绘出伞菌担孢子着生在担子上的形态图，并注明各部位的名称； 8、绘出衣藻的形态图，并注明各部位的名称；

9、绘一条水绵的形态图，并画出细胞中叶绿体的轮廊； 10、画一个放大的水绵细胞，并注明各单位名称；

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11、绘出水绵的接合生殖图；

12、将各菌落的观察结果记入下表中，并报告各编号菌落的观察、识别结果。 （二）思考题

1、为什么在培养基上放了玻璃纸后，放线菌仍能生长？ 2、印片法成败关键在哪里？

3、四大类微生物的菌落形态有何异同？为什么？ 4、从微生物菌落形态区分四大类微生物有何意义？

微生物菌落形态观察记录表

大类 细菌 放线菌 酵母菌 霉菌 菌名或编号 1 2 3 大小形成 表面 形态 边缘 干湿 颜色 光泽 厚度 透明度 （mm） 方式

实验三十八 培养基制作、灭菌与无菌操作接种技术

一、实验目的与要求

1、学习细菌、放线菌及真菌常规培养基的制备方法； 2、学习微生物操作中常用的灭菌与消毒方法； 3、掌握高压蒸汽灭菌锅的灭菌原理及使用方法； 4、学习并掌握棉塞制作及常用器皿包扎的方法； 5、学习并掌握无菌操作接种技术要点。 二、重点与难点

1、高氏一号培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯蔗糖琼脂培养基分别属于哪种类型的培养基？分别适合培养哪种微生物？

2、使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时必须排尽锅内的冷空气，为什么？ 3、掌握无菌操作与斜面接种技术要点。 三、教学方法与手段

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本次实验课主要采取讲授法和演示法,辅以视频影象资料进行教学。实验过程中1-7项实验内容会按照学生分组情况调整各小组每个实验进行的先后顺序。 四、实验内容

1、 牛肉膏蛋白胨培养基的制备； 2、 高氏一号合成培养基的制备； 3、 马铃薯蔗糖琼脂培养基的制备； 4、 棉塞的制作及玻璃器皿的包扎； 5、 常用灭菌和消毒方法简介；

6、 用高压蒸汽灭菌锅对培养基和器皿进行灭菌； 7、 无菌操作与斜面接种技术。 五、实验材料

1、药品和试剂：牛肉膏、蛋白胨、NaC1、10%NaOH溶液、10%盐酸溶液；可溶性淀粉、K2HPO4、MgSO4·7H2O、KNO3、NaCI、FeSO4·7H2O、琼脂、10%NaOH 溶液、10%盐酸。

2、材料：新鲜马铃薯、蔗糖或葡萄糖。 六、实验用品

小烧杯、小铝锅、天平、牛角匙、100mL刻度搪瓷杯、玻棒、pH试纸、分装漏斗、棉花、棉皮圈、天平、100 mL烧杯、标签纸、电炉、菜板、小刀、纱布、18mm×180mm试管。 七、实验方法

（一）牛肉膏蛋白胨培养基的制备 1、实验原理

牛肉膏蛋白胨培养基是细菌学研究最常用的天然培养基。在配方中不加琼脂时称之为肉汤培养基。加入琼脂配制的固体培养基一般用于细菌的分离、培养和测数等。 2、培养基配方

牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、NaC1 5.0g、琼脂20.0g、自来水1000 mL、pH7.0。 3、操作步骤

⑴ 在100 mL小烧杯中称取牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g，加50 mL自来水，置电炉搅拌加热至牛肉膏、蛋白胨完全溶解。

⑵ 向小铝锅中加入500 mL自来水，将溶解的牛肉膏、蛋白胨倒入铝锅中并用自来水洗2～3次。加入5.0gNaC1，在电炉上边加热边搅拌。

⑶ 加入洗净的琼脂条，继续搅拌，加热至琼脂完全熔化，补足水量至1000 mL。 ⑷ 用玻棒沾少许液体，用pH试纸测定pH值。用NaOH或HC1调至pH7.0。

⑸ 分装漏斗分装于10mm×180mm试管中，塞好棉塞，装入小铁丝筐，然后用旧报纸将棉塞部分包好。★是否可以搁置几天后进行灭菌？ ⑹ 高压蒸汽灭菌，121℃灭菌30min。

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⑺ 灭菌后摆放斜面。

（二）高氏一号合成培养基的制备 1、 实验原理

高氏一号培养基是一个合成培养基，常用于分离和培养放线菌。 2、 培养基配方

可溶性淀粉20.0g、硝酸钾1.0g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、氯化钠0.5g、硫酸亚铁0.01g、琼脂20g、蒸馏水1000 mL、pH7.2～7.4。 3、操作步骤

⑴ 用搪瓷杯量取自来水500 mL置小铝锅中，在电炉上加热。

⑵ 根据培养基配方，依次称取各种药品加入搪瓷杯中，搅拌均匀。其中可溶性淀粉称入100 mL烧杯中，加入50 mL自来水调成糊状，待培养液沸腾时及如铝锅中，边加边搅拌，以防糊底。

⑶ 加入20g浸洗过的琼脂煮沸至熔化，补足1000 mL水量，调pH7.2～7.4。

⑷ 趁热分装于18mm×180mm试管，斜面试管每管8 mL，若倒平板则每管装15 mL，装量根据需要而定。

⑸ 塞好棉塞，装入小铁丝筐，并用旧报纸将棉塞部分包好，贴好标签。 ⑹ 高压蒸汽灭菌，121℃灭菌30min。 ⑺ 若有斜面试管，在灭菌后及时摆放斜面。 （三）马铃薯蔗糖琼脂培养基的制备 1、实验原理

马铃薯蔗糖培养基是一种半合成培养基，常用于培养多种真菌。 2、培养基成分

去皮的马铃薯200g 、蔗糖或葡萄糖20g、琼脂20g、自来水1000 mL、pH 自然 3、操作步骤

⑴ 称取去皮新鲜马铃薯200g 切成1cm 见方小块放于小铝锅中，加1000m L 自来水，置电炉上煮沸20min 后，用双层纱布过滤。滤液计量体积后倒入小铝锅中煮沸。 ⑵ 加入称好的蔗糖、琼脂，加热搅拌至琼脂完全熔化，并补足水量至1000m L。 ⑶ 趁热用分装漏斗分装于18mm×180mm试管，斜面以8 m L为宜，柱状15m L为宜。分装完毕后做好棉塞，装入小试管筐并捆好，写好标签。

⑷ 高压蒸汽灭菌，121℃灭菌30min。若需摆斜面，灭菌后趁热摆成斜面。 （四）棉塞的制作及玻璃器皿的包扎

棉塞的作用有二：一是防止杂菌污染，二是保证通气良好。因此棉塞质量的优劣对实验的结果有很大的影响。正确的棉塞要求形状，大小，松紧与试管口或三角瓶口完全适合，过

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紧则防碍空气流通，操作不便；过松则达不到滤菌的目的。加塞时，应使棉塞长度的1/3在试管口外，2/3在试管口内（图示）。做棉塞的棉花要选纤维较长的，一般不用脱脂棉做棉塞。因为它容易吸水变湿，造成污染，而且价格也贵。做棉塞过程如图所示。

此外,现配现用的培养基和无菌水，还可使用硅胶橡胶塞或聚丙烯塑料试管帽。 在微生物实验和科研中，往往要用到通气塞。所谓通气塞就是几层纱布，一般8层，相互重迭而成，或是在两层纱布间均匀铺一层棉花而成。这种通气塞通常加在装有液体培养基的三角烧瓶口上。经接种后，放在摇床上进行振荡培养，以获得良好的通气促使菌体的生长或发酵。

（五）常用灭菌和消毒方法

采用强烈的理化因素使任何物体内外所有的微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施称之为灭菌（sterilization）。消毒（disinfection）则是用较温和的物理或化学方法杀死物体上绝大多数微生物主要是病原微生物和有害微生物的营养细胞，实际上是部分灭菌。

在微生物实验、生产和科学研究工作中，需要进行微生物纯培养，不能有任何外来杂菌。因此，对所用器材、培养基要进行严格灭菌，对工作场所进行消毒，以保证工作顺利进行。

实验室最常用的灭菌方法是利用高温处理的达到杀菌效果。高温的致死作用，主要是是使微生物的蛋白蛋和核酸等重要生物大分子发生变性。高温灭菌分为干热灭菌和湿热灭菌两大类。湿热灭菌的效果比干热灭菌好。这是因为湿热下热量易于传递，更容易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构，从而加速其变性。此外，过滤除菌、射线灭菌和消毒、化学药物灭菌和消毒等也是微生物学操作中不可缺少的常用方法。 1、干热灭菌

火焰灭菌

微生物接种工具如接种环、接种针或其它金属用具等，可直接在酒精灯火焰上灼烧进行灭菌。这种方法灭菌迅速彻底。此外，接种过程中，试管或三角瓶口等，也可通过火焰灼烧灭菌。

干热灭菌

用干燥热空气杀死微生物的方法称为干热灭菌。通常将灭菌物品置于鼓风干燥箱内，在160oC～170oC加热1～2h。灭菌时间可根据灭菌物品性质与体积作适当调整，以达到灭菌目的。玻璃器皿（如吸管、培养皿等）、金属用具等，凡不适于用其它方法灭菌而又能耐温的物品都可用此法灭菌。但是，培养基、橡胶制品、塑料制品等不能使用干热灭菌。干热灭菌箱的构造（图示）。 ⑴ 干热灭菌操作步骤

①装箱：将准备灭菌的玻璃器材洗涤干净、晾干，用锡箔纸包裹好或放入灭菌专用的铁

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盒（或铝盒）内，放入干热灭菌箱，关好箱门。

②灭菌：接通电源，打开干热灭菌箱排气孔，待温度升至80C～100C时关闭排气孔。继续升温至160oC～170oC时，开始计时。恒温1～2h。

③灭菌结束后，断开电源，自然降温至60oC，打开干热灭菌箱门，取出物品放置备用。 ⑵ 注意事项

①灭菌的玻璃器皿切不可有水。有水的玻璃器皿在干热灭菌中容易炸裂。 ②灭菌物品不能堆得太满、太紧，以免影响温度均匀上升。

③灭菌物品不能直接放在电烘箱底板上，以防止包装纸或棉花被烤焦。

④灭菌温度恒定在160～170C为宜。温度超过180C，棉花、报纸会烧焦甚至燃烧。 ⑤降温时，需待温度自然降至60oC以下才能打开箱门取出物品，以免因温度过高而骤然降温导致玻璃器皿炸裂。 2、湿热灭菌

湿热灭菌法比干热灭菌法更有效。湿热灭菌是利用热蒸气灭菌。在相同温度下，湿热的效力比干热灭菌好的原因是：①热蒸气对细胞成分的破坏作用更强。水分子的存在有助于破坏维护蛋白质三维结构的氢键和其它相互作用弱键，更易使蛋白质变性。蛋白质含水量与其凝固温度成反比（表示）；②热蒸汽热空气穿透力强，能更加有效地杀灭微生物；③蒸汽存在潜热，当气体转变为液体时可放出大量，故可迅速提高灭菌物体温度。

多数细菌和真菌的营养细胞在60oC左右处理15min后即可杀后，酵母菌和真菌的孢子要耐热些，要用80oC以上的温度处理才能杀死，而细菌的芽胞更耐热，一般要在120oC下处理15min才能杀死。湿热灭菌常用的方法有常压蒸汽灭菌和高压蒸汽灭菌。

常压蒸汽灭菌： （1）常压蒸汽灭菌方法

常压蒸汽灭菌是湿热灭菌的方法之一，在不能密闭的容器里产生蒸汽进行灭菌。在不具备高压蒸汽灭菌的情况下，常压蒸汽灭菌是一种常用的灭菌方法。此外，不宜用高压蒸煮的物质，如糖液、牛奶、明胶等，可采用常压蒸汽灭菌。这种灭菌方法所用的灭菌器有阿诺氏（Aruokd）灭菌器或特制的蒸锅，也可用普通的蒸笼。由于常压蒸汽的温度不超过100oC，压力为常压，大多数微物的营养细胞能被杀死，但芽胞细菌却不能在短时间内死亡，因此必须采取间歇灭菌或持续灭菌的方法，以杀死芽胞细菌，达到完全灭菌。

蛋白质含水量与其凝固温度的关系

蛋白质含水量/% 蛋白质凝固点/oC

50 56 25 74～80 18 80～90 6 145

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①巴氏消毒：是用于牛奶、啤酒、果酒和酱油等不能进行高温灭菌的液体的一种消毒方法，其主要目的是杀死其中的无芽胞病原菌，如牛奶中的结核分枝杆菌或沙门氏菌，而又不影响其特有风味。巴氏消毒法是一种低温消毒法，具体的处理温度和时间各有不同，一般在60～85C下处理15～30min。具体的方法可分两类，第一类是较老式的，称为低温维持法，例如在63C下保持30min可进行牛奶消毒；另一类是较新式的，称为高温快速，用于牛奶消毒时只要在85C下保持5min即可。但是巴氏消毒法不能杀灭引起Q热的病原体——伯氏考克斯氏体（一种立克次氏体）。

②间歇灭菌法：又称分段灭菌法。适用于不耐热培养基的灭菌。方法是：将待灭菌的培养基在100oC下蒸煮30～60min，以杀死其中所有微生物的营养细胞，然后置室温或20～30oC下保温过夜，诱导残留的芽胞萌发，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续重复3天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。例如，培养硫细菌含硫培养基就应用间歇灭菌法灭菌，因为其中的元素硫经常规的高压灭菌（121C）后会发生熔化，而在100C的温度下则呈结晶状。

③蒸汽持续灭菌法：微生物制品土法生产或食用菌菌种制备时常用这种方法。在容量较大的蒸锅中进行。从蒸汽大量产生开始，继续加大火力保持充足蒸汽，待锅内温度达到100oC时，持续加热3～6h，杀死绝大部分芽胞和全部营养体，达到灭菌目的。

以上三种方法通过是在无高压蒸汽灭菌条件的地方（如农村）使用。 （2）灭菌过程中注意事项

①使用间歇法或持续法灭菌时必须在灭菌物里外都达到100oC后，开始计算灭菌时间，此时锅顶上应有大量蒸汽冒出。

②为利于蒸汽穿透灭菌物，锅内或蒸笼上堆放物品不宜过满过挤，应留有空隙。固体曲料大量灭菌时，每袋以1.5～2.0kg为宜，料袋在锅内用蓖子分层隔开，不能堆压在一起。

③火大水足才能保证汽足，蒸锅里应先把水加足。一次持续灭菌时，如锅内盛水量不能维持到底，应在蒸锅侧面安装加水口，以便在蒸煮过程中添水。添水应用开水，以防骤然降温。

④间歇法灭菌时应在每次加热后，迅速降温，然后在室温放置24h，再第二次加热。如果降温慢，往往使未杀死的杂菌大量滋长，反而导致灭菌物变质，特别是固体曲料包装过大时，靠近中心部分更易发生这种情况。

⑤从使用效果看，分装试管、三角瓶或其它容器的培养基，因其体积小，透热快以用间歇法为佳。固体曲料，因其包装较大，透热慢，用间歇法容易滋生杂菌变质或者水分蒸发过多，曲料变得不新鲜，影响培养效果，因此使用一次持续灭菌法较好。

高压蒸汽灭菌

高压蒸汽灭菌法是微生物学研究和教学中应用最广、效果最好的湿热灭菌方法。

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⑴ 灭菌原理

高压蒸汽灭菌是在密闭的高压蒸汽灭菌器（锅）中进行的，其原理是：将待灭菌的物体放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内。把锅内的水加热煮沸，并把其中原有的冷空气彻底驱尽后将锅密闭。再继续加热就会使锅内的蒸汽压逐渐上升，从而温度也随之上升到100oC以上。为达到良好的灭菌效果，一般要求温度应达到121C（压力为0.1MPa），时间维持15～30min。也可采用在较低的温度（115C，即0.075MPa）下维持35min的方法。★为什么比干热灭菌的工艺指标低？此法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基及多种器材、物品的灭菌。蒸汽压力与温度的关系如表所示。

蒸汽压力与温度的类系

蒸汽压力（表压） kg/cm2 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.50 2.00 在使用高压蒸汽灭菌器进行灭菌时，蒸汽灭菌器内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压。所以当水蒸汽中含有空气中，压力表所表示的压力是水蒸汽压力和部分空气压力和总和，不是水蒸气的实际压力，它所相当的温度与高压灭菌锅内的温度是不一致的。这是因为在同一压力下的实际温度，含空气的蒸汽低于饱和蒸汽。见表所示。

由表看出：如不将灭菌锅中的空气排除干净，即达不到灭菌所需的实际温度。因此，必须将灭菌器内的冷空气完全排除，才能达到完全灭菌的目的。

在空气完全排除的情况下，一般培养基只需在0.1Mpa下灭菌30min即可。但对某些物体较大或蒸汽不易穿透的灭菌物品，如固体曲料、土壤和草炭等，则应适当延长灭菌时间，或蒸气压力升到0.15Mpa保持1～2h。

⑵ 灭菌设备

高压蒸汽灭菌的主要设备是高压蒸汽灭菌锅，有立式、卧式及手提式(图 )等不同类型。实验室中以手提式最为常用。卧式灭菌锅常用于大批量物品的灭菌，不同类型的灭菌锅，虽大小外形各异。但其主要结构基本相同。

高压蒸汽灭菌器的基本构造如下：

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蒸汽温度 oMPa 0.00 0.025 0.050 0.075 0.100 0.150 0.200 C oF 100 107.0 112.0 115.0 121.0 128.0 134.5 212 224 234 240 250 262 274

空气排除程度与温度的关系

压力表读数 灭 菌 器 内 温 度/ oC /Pa 未排除空气 排除1/3空气 排除1/2空气 排除2/3空气 完全排除空气 35 70 105 140 175 210 ①外锅：或称“套层”，供贮存蒸汽用，连有用电加热的蒸汽发生器，并有水位玻管以标志盛水量。外锅的外侧一般包有石棉或玻璃棉绝缘层以防止散热。如直接使用由锅炉接入的高压蒸汽，则外锅在使用时充满蒸汽，作为内锅保温之用。

②内锅：或称灭菌室，是放置灭菌物的空间，可配制铁蓖架以分放灭菌物品。 ③压力表：内外锅各装一只，老式的压力表上标明三种单位：公斤压力单位（kg/cm2），英制压力单位（Ib/in）和温度单位（C），便于灭菌时参照。现在的压力表用MPa表示。

④温度计：可分为两种，一种是直接插入式的水银温度计，装在密闭的铜管内，焊插在内锅中，另一种是感应式仪表温度计，其感应部分安装在内锅的排气管内，仪表安装于锅外顶部，便于观察。

⑤排气阀：一般外锅、内锅各一个，用于排除空气。新型的灭菌器多在排气阀外装有汽液分离器（或称疏水阀），内有由膨胀盒控制的活塞。利用空气、冷凝水与蒸汽之间的温差控制开关，在灭菌过程中，可不断地自动排出空气和冷凝水。

⑥安全阀：或称保险阀，利可调弹簧控制活塞，超过额定压力即自动放气减压。通常调在额定压力之下，略高于使用压力。安全阀只供超压时安全报警之用，不可在保温时用作自动减压装署。

⑦热源：除直接引入锅炉蒸汽灭菌外，都具有加热装置。近年来的产品以电热为主，即底部装有调控电热管，使用比较方便。有些产品无电热装置，则附有打气煤油炉等。手提式灭菌器也可用煤炉作为热源。

几种常用高压蒸汽灭菌锅的使用方法 ⑴立式灭菌锅使用要点

①加水：由漏斗处加水，加水量应在标定水位线以上。可在水位玻管刻度处观察。 ②装锅：将待灭菌物品装入锅内时，不要太紧太满，应留有间隙，以利蒸汽流通。盖好锅盖后。即可将螺旋柄旋紧。

③加热放排冷空气：如果是电热高压蒸汽灭菌锅，则合上电闸通电加热。如属非电热装置，可点燃煤气炉或煤油喷灯加温。同时打开排气阀及下部排冷气余水阀，继续加热到锅中

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72 90 100 109 115 121 90 100 109 115 121 126 94 105 112 118 124 128 100 109 115 121 126 130 109 115 121 126 130 135 水沸腾，待排气阀冒出大量蒸汽后，关闭盖顶排气活塞，使冷气由下部疏水阀排出。此时如有少量冷凝水排出是正常现象。待下部疏水阀有大量蒸汽冒出时，证明锅中已充满蒸汽，应继续排汽，使锅中及灭菌容器中的冷空气完全排除干净。一般不就少于5min。★可否省略此步骤？

④升压保压：排气完毕后，关小下部疏水阀，锅内压力即逐渐升高，注意升压不要过猛。当压力升高到0.1Mpa时，调节火力，使压力保持稳定。压力选择应视具体灭菌物品而定，如草炭、土壤等则可在压力升至0.14MPa～0.15 MPa后定时保压。

⑤降压与排汽：保压时间（一般为30min）结束后，即应停止加热，使其自然冷却。此时切勿急于打开排气塞，因为压力骤然降低，将导致培养基剧烈沸腾而冲掉或污染棉塞。待压力降至0.025Mpa以下可以打开排气阀使余汽排出，同时打开下部疏水阀，排出锅内冷凝水。

⑥出锅：排气完毕后，即可扭松螺旋柄使锅盖松动。先将锅盖打开5～10mm，不必完全推开锅盖，目的是借锅中余热将棉塞及包装纸烘干。烘烤30min后，即可推开锅盖，取出已灭菌的物品。

⑵卧式灭菌锅使用要点

①加水：先将排水阀关闭，调整总阀至“全排”。然后，开启进水阀，放蒸馏水至蒸汽发生器内，待水进至距水表顶端大的1～2cm处时，关闭进水阀，并将总阀调至“关闭”。

②装锅：将待灭菌物品装入锅内，注意不要塞得过紧过满，盛有培养基的三角瓶和试管应立放或适度倾斜，以免灭菌过程中培养基污染棉塞。

③关门：按顺时针方向转动紧锁手柄至箭头处，使撑挡进入门圈内，然后旋动八角转盘，使门和垫圈密合，以灭菌时不漏气为度，不宜太紧，以免损坏垫圈。

④通电加温：将电源控制开关的旋钮旋至“开”处，电源指示灯亮，表示已通电，然后再按灭菌物品所需灭菌汽压将旋钮旋至0.07MPa、0.1MPa或0.14MPa处。此时电热指示灯亮，表示已通电加热。

⑤保温保压：当蒸汽套层内的蒸汽随加热达到自动控制压力时，电热指示灯会自动熄灭，表示停止加热。随着热力散发压力降低，电热指示灯再亮，表示继续加热，这表明压力控制器工作正常。当套层内的蒸汽加热到所选择的控制压力时，即可将套层内的蒸汽导入消毒室进行灭菌。此时应先将汽液分离器前的冷凝阀开放少许，然后将总阀调至“消毒”，套层内的蒸汽即通过总阀进入消毒室进行消毒，冷凝水则通过汽液分离器自动排出。这时蒸汽套层内蒸汽压力迅速下降，而消毒室内的蒸汽压力逐渐上升，消毒室内的温度表也随着物品被蒸汽加热而上升。当表上温度升到所需消毒温度（一般为121 oC）时，开始计算灭菌时间，维持温度至灭菌完毕。

⑥出锅：灭菌完毕后，立即切断开源，按灭菌物品性质和要求，决定消毒室内的蒸汽是自然冷却还是采取“慢排”或“快排”。例如，器械、器皿、固体曲料、土壤、草炭等不致

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因压力骤然下降而受影响的物品，可直接将总阀调至“慢排”和“快排”，使消毒室内蒸汽迅速排出。当消毒室内压力下降至“0”时，方可缓慢转动锅门转盘并拨动紧锁手柄将门开启5～10cm。20～30min后将灭菌物品取出，此时灭菌物品即较干燥。溶液及培养基等物品灭菌完毕时，只能将总阀调至“慢排”，使消毒室内蒸汽慢慢排出，以免突然降低压力导致培养基剧烈沸腾。也可以灭菌完毕后，关闭总阀，让灭菌物品自然冷却。消毒室压力表降至“0”时，再将总阀调至“慢排”数分钟取出灭菌物品。

⑦连续操作：如灭菌物品较多需连续操作时，应先检查水位。有足够水量时，可连续使用。如需加水，应把总阀调至“全排”，打开进水阀加水后继续操作。

⑧保养：每次灭菌完毕后，关闭电源，停止加热，随后将总阀调至“全排”，排出套层内的蒸汽。开启锅门少许，散发剩余蒸汽，使消毒室内壁经常保持干燥，同时排除蒸汽发生器内的余水。

⑶手提式灭菌使用要点

①加水：使用前在锅内加入适量的水，加水不可过少，以防将灭菌锅烧干，引起炸裂事故。加水过多有可能引起灭菌物积水。

②装锅：将灭菌物品放在灭菌桶中，不要装得过满。盖好锅盖，按对称方法旋紧四周固定螺旋，打开排气阀。

③加热排放冷空气：加热后待锅内沸腾并有大量蒸汽自排气阀冒出时，维持2～3min以排除冷空气。如灭菌物品较大或不易透气，应适当延长排气时间，务必使空气充分排除，然后将排气阀关闭。★可否省略此步骤？

④保温保压：当压力升至0.1MPa时，温度达121 oC，此时应控制热源。保持压力，维持30min后，切断热源。

⑤出锅：当压力表降至“0”处，稍停，使温度继续降至100 oC以下后，打开排气阀，旋开固定螺旋，开盖，取出灭菌物。注意：切勿在锅内压力尚在“0”点以上，温度也在100

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C以上时开启排气阀，否则会因压力骤然降低，而造成培养基剧烈沸腾冲出管口或瓶口，污

染棉塞，以后培养时引起杂菌污染。

⑥保养：灭菌完毕取出物品后，将锅内余水倒出，以保持内壁及内胆干燥，盖好锅盖。 3、过滤除菌

控制液体中微生物的群体可以通过将微生物从液体中移走而不是用杀死的方法来实现。通常所采用的做法是过滤除菌，即将液体通过某种微孔的材料，使微生物与液体分离。早年曾采用硅藻土等料装入玻璃柱中，当液体流过柱子时菌体因其所带的静电荷而被吸附在多孔的材料上，但现今已基本为膜滤器所替代。

膜滤器采用微孔滤膜作材料，它通常由硝酸纤维素制成，可根据需要使之具有从0.025 μm～25μm不同范围大小特定孔径。当含有微生物的液体通过孔径为0.2μm的微孔滤膜时，大于滤膜孔径的细菌等微生物不能穿过滤膜而被阻拦在膜上，与通过的滤液分离开来。微孔

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滤膜具有孔径小、价格低、可高压灭菌、滤速快及可处理大容量的液体等优点。

过滤除菌可用于对热敏感液体的除菌，如含有酶或维生素的溶液、血清等。有些物质即使加热温度很低也会失活，也有些物质辐射处理也会造成损伤，此时，过滤除菌就成了惟一的可供选择的灭菌方法。过滤除菌还可用于啤酒生产中代替巴斯德消毒。★此装置可以滤掉病毒吗？

(a) 有些微生物学研究工作需要收集或浓缩细菌细胞，诸如进行细菌三亲本杂交，抗性筛选和同步生长实验等都利用滤膜注射器进行操作。这是一个隔板带有0.22μm孔径的微孔滤膜的注射装置。在菌液注射过程中，细菌细胞由于不能通过滤膜而被收集在膜表面。

使用0.22μm孔径滤膜，虽然可以滤除溶液中存的细菌，但病毒或支原体等仍可通过。必要时需使用小于0.22μm孔径滤膜，但滤孔容易阻塞。 4、紫外线杀菌

紫外线的波长范围是15～300nm，其中波长在260nm左右的紫外线杀菌作用最强，紫外灯是人工制造的低压水银灯，能辐射出波长主要为253.7nm的紫外线，杀菌能力强而且稳定。紫外光杀菌作用是因为它可以被蛋白质（波长为280nm）和核酸（波长为260nm）吸收，造成这些分子的变性失活。例如，核酸中的胸腺嘧啶吸收紫外光后，可以形成二聚体，导致DNA合成和转录过程中遗传密码阅读错误，引起致死突变。紫外光穿透能力很差，不能穿过玻璃、衣物、纸张或大多数其它物体，但能够穿透空气，因而可以用作物体表面或室内空气的杀菌处理，在微生物学研究及生产实践中应用较广。紫外灯的功率越大效能越高。紫外线的灭菌作用随其剂量的增加而加强，剂量是照射强度与照射时间的乘积。如果紫外灯的功率和照射距离不变，可以用照射的时间表示相对剂量。紫外线对不同的微生物有不同的致死剂量。根据照射定律，照度与光源光强成正比而与距离的平方成反比。在固定光源情况下，被照物体越远，效果越差，因此，应根据被照面积、距离等因素安装紫外线灯。由于紫外线穿透力弱，一薄层普通玻璃或水，均能滤除大量的紫外线。因此，紫外线只适用于表面灭菌和空气灭菌。在一般实验室、接种室、接种箱、手术室和药厂包装室等，均可利用紫外灯杀菌。以普通小型接种室为例，其面积若按10m2计算，在工作台下方距地面2m处悬挂1～2只30W紫外灯，每次开灯照射30min，就能使室内空气灭菌，照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒剂，可加强灭菌效果。紫外线对眼黏膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，所以应避免在紫外灯下工作，必要时需穿防护工作衣帽，并戴有色眼镜进行工作。 5、化学药剂消毒与杀菌

某些化学药剂可以抑制或杀死微生物，因而被用于微生物生长的控制。依作用性质，可将化学药剂分为杀菌剂和抑菌剂。杀菌剂是能破坏细菌代谢机能，并有致死作用的化学药剂，如重金属离子和某些强氧化剂等。抑菌剂并不破坏细菌的原生质，而只是阻抑新细胞物质的合成，使细菌不能增殖，如磺胺类及抗生素等。化学杀菌剂主要用于抑制或杀灭物体表面、器械、排泄物和周围环境中的微生物。抑菌剂常用于机体表面；如皮肤、黏膜、伤口等处防

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止感染，有的也用于食品、饮料、药品的防腐作用。杀菌剂和抑菌剂之间的界线有时并不很严格，如高浓度的石碳酸（3%～5%）用于器皿表面消毒杀菌，而低浓度的石碳酸（0.5%）则用于生物制品的防腐抑菌。理想的化学杀菌剂和抑菌剂应当是作用快、效力高，但对组织损伤小，穿透性强，且腐蚀小，配制方便且稳定，价格低廉易生产，并且无异味。但真正完全符合上述要求的化学药剂很少，我们要根据具体需要，尽可能选择那些具有较多优良性状的化学药剂。

常用化学杀菌剂

类 别 醇 类 酸 类 碱类 酚类 醛类 实 例 乙醇 乳酸 食醋 石灰水 石炭酸 来苏儿 甲醛（福尔马林） 升汞 重金属离子 硝酸银 硫柳汞 氧化剂 高猛酸钾 过氧化氢 氯气 漂白粉 过氧乙酸 染料 表面活性剂 季胺盐类 烷基本化合物 金属螯合剂 结晶紫 新洁尔灭 杜灭芬（消毒宁） 环氧乙烷 8－羟喹啉硫酸盐 常用浓度 70%～75% 0.33～1mol/L 3～5mL/m3 1%～3% 5% 2%～5% 40%溶液，2～6mL/m3 0. 1% 0.1%～1% 0.01% 0.1%～3% 3% 0.2～1ppm 1%～5% 0.2%～0.5% 2%～4% 1：20水溶液 0.05%～0.1% 50 mg/100ml 0.1%～0.2% 应用范围 皮肤及器械消毒 空气消毒（喷雾或熏蒸） 熏蒸空气消毒，可预防预感 地面消毒、粪便消毒等 空气消毒、地面或器皿消毒 空气消毒、皮肤消毒 接种室、接种箱或器皿消毒 植物组织（如根瘤）表面消毒 皮肤消毒 生物制品防腐 皮肤、水果、蔬菜、器皿消毒 清洗伤口、口腔黏膜消毒 饮用水消毒等 培养基容器、饮水和厕所消毒 塑料、玻璃、皮肤消毒等 外用紫药水、浅疮口消毒 皮肤及不能遇热器皿的消毒 皮肤疮伤冲洗、棉织品、塑料、

橡胶物品消毒 手术器械、敷料、糖瓷类灭菌 外用清洗消毒 此外，微生物种类、化学药剂处理微生物的时间长短、温度高低以及微生物所处环境等，都影响着化学药剂杀菌或抑菌的能力和效果。微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、乙醇、碘酒、龙胆紫、石碳酸、煤粉皂溶液、漂白粉、氧化乙烯、丙酸内酯、过氧乙酸、新洁尔灭等。常用化学杀菌剂的使用浓度和应用范围如表所示。 （六）无菌操作与微生物接种技术

微生物接种技术是进行微生物实验和相关研究的基本操作技能。无菌操作是微生物接种技术的关键。因实验目的、培养基种类及实验器皿等不同，所用接种方法不尽相同。斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种操作均以获得生长良好的纯种微生物为目的。因此，接

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种必须在一个无杂菌污染的环境中进行严格的无菌操作。由于接种目的不同，采用的接种工具也有区别，如固体斜面培养体转接时用接种环；穿刺接种时用接种针，液体转接用移液管等。

1、 接种前的准备工作

无菌室的准备：

在微生物实验中，一般小规模的接种操作，使用无菌接种箱或超净工作台；工作量大时使用无菌室接种，要求严格在无菌室内，再结合使用超净工作台。 ⑴无菌室的设计

无菌室的设计可因地制宜，但应具备下列基本条件：

①无菌室要求严密、避光，隔板以采用玻璃为佳。但为了在使用后排湿通风，应在顶部设立百叶排气窗。窗口加密封盖板，可以启闭，也可在窗口用数层纱布和棉花蒙罩。无菌室侧面底部应设进气孔。最好能通入过滤的无菌空气。

②无菌室一般应有里外两间。较小的外间为缓冲间，可提高隔离效果。

③无菌室应安装拉门，以减少空气流动。必要时，在向外一侧的玻璃隔板上安装一个双层的小型玻璃橱窗，便于内外传物品，减少进出无菌室的次数。

④室内应有照明、电热和动力用的电源。

⑤工作台面应抗热、抗腐蚀，便于清洗消毒。可采用橡胶板或塑料板铺敷台面。 ⑵无菌室内的设备

①无菌室的里外两间均应安装日光和紫外线杀菌灯。紫外灯常用规格为30W，吊装在经常工作位置的上方，距地高度2.0～2.2m。

②缓冲间内应安排工作台，供放置工作服、鞋、帽、口罩、消毒药物、手持式喷雾器等，并备有废物桶等。

③无菌室内应备有接种用的常用器具、如酒精灯、接种针、不锈钢刀、剪刀、镊子、酒精棉球瓶、记号笔等。 ⑶无菌室的灭菌

①熏蒸：在无菌室全面彻底灭菌时用。先将室内打扫干净，打开进气孔和排气窗通风干燥后，重新关闭，进行熏蒸灭菌。常用的灭菌药剂为福尔马林（含37%～40%甲醛的水溶液）。按6～10mL/ m3的标准计算用量，熏蒸液取出后，盛于铁制容器中，利用电炉或酒精灯直接加热，应能随时在室外停止热源；也可以加半量高锰酸钾，通过氧化作用加热，使福尔马林蒸发。熏蒸后应保持密闭12h以上。由于甲醛气体具有较强的刺激作用，所以在使用无菌室前1～2h，在一搪瓷盘内加入与所用甲醛溶液等量的氨水，放入无菌室，使其挥发中和甲醛，以减轻刺激作用。除甲醛外，也可用乳酸、硫磺等进行熏蒸灭菌。

②紫外灯照射：在每次工作前后，均应打开紫外灯，分别照射30min，进行灭菌。在无菌室内工作时，切记要关闭紫外灯。

③石炭酸溶液喷雾：每次临操作前，用手持续喷雾器喷雾5%石炭酸溶液，主要喷于台

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面和地面，兼有灭菌和防止微尘飞扬的作用。 ⑷无菌空气污染情况的检验

为了检验无菌室灭菌的效果以及在操作过程中空气的污染的程度，需要定期在无菌室内进行空气中杂菌的检验。一般可在两个时间进行检查，一是在灭菌后使用前，一是在操作完毕后。

取牛肉膏蛋白胨琼脂和马铃薯蔗糖琼脂两种培养基的平板各3个，在无菌室使用前（或在使用后），揭开并放置在无菌室台面上，半小时 后重新盖好，另有一份不打开，作检查对照，一并入30oC下培养，48h后检查有无杂菌生长以及杂菌数量的多少。根据检验结果确定应采取措施。

无菌室灭菌后使用前检验时，应无杂菌。如果检查时长出的杂菌多为霉菌，表明室内温度过大，应先通风干燥，再重新进行灭菌；如或检查时长出的杂菌以细菌为主时，可采用乳酸熏蒸，效果较好。 ⑸无菌室操作规则

①将所用的实验器材和用品一次性全部放入无菌室，同时将放入的培养基用牛皮纸遮盖。应尽量避免在操作过程中出入无菌室或传递物品。操作前先打开紫外灯照射半小时 ，关闭紫外灯后，再开始工作。

②进入缓冲间后，应该换好工作服、鞋、帽、戴上口罩，将手用消毒液清洁后，再进入工作间。

③操作时，严格按无菌操作方法进行操作，废物应丢入废物桶内。

④工作后应将台面收拾干净，取出培养物品及废物桶，用5%石炭酸喷雾，再打开紫外灯照射半小时 。

接种工具的准备：

最常用的接种或移植工具为接种环。接种环是一段铂金丝安装在防锈的金属杆上制成。市售商品多以镍铬丝自制，简便适用。

接种环：供挑取菌苔或液体培养物接种用。环前端要求圆而闭合，否则液体不会在环内形成菌膜。根据不同用途，接种环的顶端可以改换为其它形式如接种针等。

玻璃刮铲：是用于稀释平板涂抹法进行菌种分离或微生物计数时的常用工具。将定量（一般为0.1mL）菌悬液置于平板表面涂布均匀的操作过程时需要用玻璃刮铲完成。用一段长约30cm、直径5～6mm的玻璃棒，在喷灯火焰上把一端弯成“了”形或倒“△”形，并使柄与“△”端的平面呈30o左右的角度。玻璃刮铲接触平板的一侧，要求平直光滑。使之即能进行均匀涂布，又不会刮伤平板的琼脂表面。移液管吸管的准备：无菌操作接种用的移液管常为1mL或10mL刻度吸管。吸管在使用前应进行包裹灭菌。吸管的包裹如图所示。 2、接种方法 ⑴斜面接种技术

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斜面接种是从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种移植至另一新鲜斜面培养基上的一种接种方法。具体操作如下：

①贴标签：接种前在试管上贴标签，注明菌名、接种日期、接种入姓名等。贴在距试管口约2～3cm的位置。也可用记号笔注明上述内容。

②点燃酒精灯。

③接种：用接种环将少许菌种移接到贴好标签的试管斜面上。接种操作必须按无菌 操作法进行，技术要点如下。

手持试管：将菌种和待接斜面的两支试管用大拇指和其它四指握在左手中，使中指位于两试管之间部位。斜面面向操作者，并使它们位于水平位置。

拔管塞：用右手指的无名指、小指和手掌边，先后取下菌种管和待接种试管的管塞， 试管口缓缓过火灭菌，切勿烧得过烫。见图所示试管口缓缓过火灭菌，切勿烧得过烫。

接种环冷却：将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却。

取菌：待接种环冷却后，轻轻沾取少量菌体或孢子，然后将接种环移出菌种管，注意不要使接种环的部分碰到管壁，取出后不可使种环通过火焰。见图示。

接种：在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面培养基的底部向上部作“Z”形来回密集划线，切勿划破培养基。也可用接种针仅在斜针，仅在斜面培养基的中央拉一条直线作斜面接种，直线接种可观察不同菌种的生长特点。见图示。

塞管塞：取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将管塞旋上。塞棉塞时，不要用试管去迎棉塞，以免试管在移动时纳入不洁空气。

将接种环灼烧灭菌，放下接种环，再将棉花塞旋紧。 ⑵液体接种技术

①用斜面菌种接种液体培养基时，有下面两种情况：如接种量小，可用接种环取少量菌体移入培养基容器（试管或三角瓶等）中，将接种环在液体表面振荡或在器壁上轻轻摩擦把菌苔散开，抽出接种环，塞好棉塞，再将液体摇动，菌体即均匀分布在液体中。如接种量大，可先在斜面菌种管中注入定量无菌水，用接种环把菌苔刮下研开，再把菌悬液到培养基中，倒前需将试管口在火焰上灭菌。

②用液体培养物接种液体培养基时，可根据具体情况采用以下不同方法：用无菌的吸管或移液管吸取菌液接种；直接把液体培养物移入液体培养基中接种；利用高压无菌空气通过特制的移液装置把液体培养物注人液体培养基中接种；利用压力差将液体培养物接入液体培养基中接种，如发酵罐接入种子菌液。 ⑶固体接种技术

固体接种最普遍的形式是接固体曲料。因所用菌种或种子菌来源不同，可分为： ①用菌液接种固体料 包括用菌苔刮洗制成的悬液和直接培养的种子发酵液。接种时可

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按无菌操作法将菌液直接倒入固体料中，搅拌均匀。注意接种所用菌液量要计算在固体料总加水量之内，否则往往在用液体种子菌接种后曲料含水量加大，影响培养效果。

②用固体种子接种固体料 包括用孢子粉、菌丝孢子混合种子菌或其它固体培养的种子菌，直接把接种材料混入灭菌的固体料。接种后必须充分搅拌，使之混合均匀。一般是先把种子菌和少部分固体料混合匀后再拌大堆料。固体料接种应注意“抢温接种”。即在曲料灭菌后不要使料温降得过低，尤其在气温低的季节，一般在料温高于培养温度5～10C时抓紧接种，如培养温度为30C，料温降至35～40C即可接种。抢温接种可使培养菌在接种后及时得到适宜的温度条件，从而能迅速生长繁殖，长势好，杂菌不易滋生。此法适用于芽胞菌和产生孢子的放线菌与霉菌的接种。另一个措施是“堆积起温”。即在大量的固体曲料接种后，不要立即分装曲盘或上帘，应先堆积起来，上加覆盖物，防止散热。使培养菌适应新的环境条件，逐渐生长旺盛，产生较大热量使堆温升高后，再分装到一定容器中培养，这样可避免一开始培养菌繁殖慢，料温上不去，拖延培养时间，水分蒸发大，杂菌易发展等缺点。 ⑷穿刺接种技术

穿刺接处技术是一种用接种针从菌种斜面上挑取少量菌体，并把它穿刺到固体或半固体的深层培养基中的接种方法。经穿刺接种后的菌种，常作为保藏菌种的一种形式，同时也是检查细菌运动能力的一种方法，它只适宜于细菌和酵母菌的接种培养。具体操作如下。

①贴标签； ②点燃酒精灯；

③穿刺接种。其方法如下。 手持试管； 旋松棉塞；

右手拿接种针在火焰上将针端灼烧灭菌，接着把在穿刺中可能伸入试管的其它部位，也灼烧灭菌。

用右手的小指和手掌边拔出棉塞。接种针先在培养基部分冷却，再用接种针的针尖沾到少量菌种。

接种有两种手持操作法。一种是水平法，它类似于斜面接种法；另一种是垂直法，如图示。尽管穿刺时手持方法不同，但穿刺时所用接种针都必须挺直，将接种针自培养基中心垂直地刺入培养基中。穿刺时要做到手稳、动作轻巧快速，并且要将接种针穿刺到接近试管的底部，然后沿着接种线将针拔出。最后，塞上棉塞，再将接种针上残留的菌在火焰上烧掉。

④将接种过的试管直立于试管架上，放在37℃或28℃恒温箱中培养。24h 后观察结果。注意：若具有运动能力的细菌，它能沿着接种线向外运动而弥散，故形成的穿刺线较粗而散，反之则细而密。 八、作业与思考题 （一）作业

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每人做3个合格的棉塞，其中一个三角瓶棉塞，2个试管棉塞，在当堂课完成。 （二）思考题

1、高氏一号培养基属何种培养基？除培养放线菌外，高氏一号培养基还能培养细菌和真菌吗？为什么？

2、牛肉膏蛋白胨培养基属何种培养基？它除了培养细菌外，能培养真菌和放线菌吗？为什么？

3、还有哪些半合成培养基可以用来培养真菌？ 4、为什么制作棉塞不能用脱脂棉而要用衣棉？

5、用高压蒸汽灭菌锅灭菌时必须排尽锅内的冷空气，为什么？ 6、在斜面转管接种过程中，应该注意哪些地方？

实验三十九 微生物的分离纯化及稀释平板菌落计数

一、实验目的与要求

1、 了解稀释平板测数的原理，掌握涂抹平板培养法和混合平板培养法的操作技术，认识细

菌、放线菌和霉菌的菌落特征；

2、 掌握用稀释平板分离法分离土壤中的好气性细菌； 3、 学会用划线法分离微生物； 4、 学习从土壤中分离放线菌的方法； 5、 学习用选择性培养基分离真菌的方法。 二、重点与难点

1、从土壤中分离微生物常用的方法有稀释平板法和划线法，根据材料的不同可采用不同方法，其最终目的是在培养基上出现欲分离微生物的单个菌落，必要时再对单个菌落进一步分离纯化。

2、在用稀释平板分离微生物时，还可以同时测定待分离的微生物的数量。 三、教学方法与手段

本次实验课主要采取讲授法和演示法,辅以视频影象资料进行教学。 四、实验内容 1、 稀释平板测数法；

2、 土壤中好气性细菌的分离与计数； 3、 划线分离法；

4、 土壤中放线菌的分离与计数； 5、 土壤中真菌的分离纯化与计数。

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五、实验原理

稀释平板测数是根据微生物在高度稀释条件下固体培养基上所形成的单个菌落是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的繁殖稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使其成单个细胞存在，否则一个菌落就不只是代表一个细胞，再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。此记数方法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。一般用于某些产品检定，如根瘤菌剂等产品检定，生物制品检验，土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验。

自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往是不同种类微生物的混合体。为了研究某种微生物的特性或者要大量培养和使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。

在自然界中，土壤是微生物生活的良好环境，其中生活的微生物数量和种类都是极其丰富的，因此土壤是人类开发利用微生物资源的重要基地。土壤中的微生物数量、种类与土壤肥力有关，肥沃的土壤中多，贫瘠土壤中少。其生理类群则与土壤的其它理化性质，如通气、pH有关，例如在通气良好的菜园土中，好气性微生物占有绝对优势。本实验以菜园土为材料分离土壤中的好气性细菌，并进行数量测定。

分离微生物时，一般是根据该微生物对营养、pH、氧气等要求的不同，供给它们适宜的生活条件，或加入某种抑制剂造成只利于该菌种生长，不利于其它菌种生长的环境，从而淘汰不需要的菌种。分离微生物常用的方法有稀释平板分离法和划线分离法，根据不同的材料，可以采用不同方法，其最终目的是要在培养基上出现欲分离微生物的单个菌落，必要时再对单个菌落进一步分离纯化。在用稀释平板分离微生物时，还可以同时测定待分离的微生物的数量。

放线菌与细菌同属原核微生物，是重要的抗生素产生菌，在土壤中的数量仅次于细菌，尤其是在有机质丰富、透气性好的中性到微碱性土壤中的数量较多。本实验采用高氏一号琼脂培养基分离和计数菜园土中的放线菌。

真菌在土壤中的数量次于细菌和放线菌，主要在有机质丰富、透气性好的偏酸性土壤中较多。分离土壤中的真菌并不难，但由于其菌落大，容易扩展，计数准确性较低。本实验采用加有氯霉素或庆大霉素和孟加拉红的马丁氏培养基分离及计数菜园土中的真菌。按一般资料介绍为链霉素，但此种抗生素要先配成一定浓度的溶液，且应于倒平板前才加入培养基中。在此培养基上，放线菌和细菌被氯霉素或庆大霉素和孟加拉红所抑制，但大多数真菌能够生存，且其菌落受孟加拉红的抑制而较小，从而避免了某些真菌的扩散蔓延而带来的数量上的误差。 六、实验材料

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1、活材料：苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）菌剂。

2、培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；高氏一号琼脂培养基；加有氯霉素（或庆大霉素）和孟加拉红的马丁氏琼脂培养基:在1000mL培养基中加入注射用氯霉素2mL，孟加拉红33.4mg，均于灭菌前加入。

3、材料：肥沃茶园土。 七、实验用品

内装15～20个玻璃珠的90mL无菌水、9mL无菌水、直径9cm的无菌平皿、1mL无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲、经2mm土壤筛过筛的菜园、天平、试管架、无菌称量纸、酒精灯、火柴、接种环、无菌水。 八、实验方法

（一）稀释平板测数法 1、样品稀释液的制备

准确称取待测样品10g，放入装有90mL无菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置20～30s，即成10－1稀释液；再用1mL无菌吸管，吸取10－1稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10－2稀释液；再换一支无菌吸管，吸取10－2稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，也吹吸3次，即成10稀释液；以此类推，连续稀释，制成10、10、10、10

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、10－8、10－9等一系列稀释菌液。

用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多

时，稀释度应高，反之则低。通常测定细菌菌剂含菌数时，采用10－7、10－8、10－9稀释度，测定土壤细菌数量时，采用10、10、10稀释度，测定放线菌数量时，采用10、10、10－5稀释度，测定真菌数量时，采用10－2、10－3、10－4稀释度。 2、平板接种培养

平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法。 ⑴混合平板培养法

将无菌平板编上10－7、10－8、10－9号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取1×10－9稀释液各1mL放入编号10－9的3个平板中，同法吸取10－8稀释液各1mL放入编号1×10的3个平板中，再吸取1×10稀释液各1mL放入编号1×10的3个平板中，由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换。然后在9个平板中分别倒入已熔化并冷却至45～50℃的细菌培养基，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷凝后倒置，在30℃下培养。至菌落长出后即可计数。 ⑵涂抹平板计数法

涂抹平板计数法与混合法基本相同，所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.1mL菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板

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－7

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上，每个编号设三个重复。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个 灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更 换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上20～30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板 倒转，保温培养，至菌落长出后即可计数。

图示 稀释平板测数法中样品的稀释和稀释液的取样培养

（二）土壤中好气性细菌的分离与计数 1、土壤稀释液的制备

按“稀释平板测数法”的相同步骤进行，按无菌操作法将土壤稀释至10－6即可。 2、分离方法

可以用三种方法进行分离。

⑴混菌法：按“稀释平板测数法”中的“混合平板培养法”进行，使用的稀释度为10－4、 10－5、10－6三个，各做3个重复。

⑵涂抹法：按“稀释平板测数法”中的“涂抹平板测数法”进行，使用的稀释度为10－3、 10－4、10－5三个，各做3个重复。

以上两法又统称为稀释平板分离法，可同时用于所分离菌的计数。

⑶划线法：用灭菌接种环沾取10-1稀释液1环于已凝固的平板上进行划线（图示）。划线可按以下两种方式进行，一种为交叉划线法，是在平板的一边做第一次“Z”字形划线。转动培养皿70°角，将接种环在火上烧过并冷却后，通过第一次划线部分，做第二次“Z”字形划线。同法进行第三次、第四次划线。另一种为边疆划线法，是从平板边缘的一点开始，连续作紧密的波浪式划线，直至平板中央。转动培养皿180°，再从平板另一边（不烧接种环）同样划线至平板中央。划线法实质上属于一种“由点到线”的稀释法，较适用于含菌比较单一的材料的纯化，对于土壤这类微生物高度混杂的样品则较少使用。

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以上各种分离法，都应按无菌操作进行。所用的培养基若在倒平板前，按50μg/m L 的量加入用乙醇溶解的制霉菌素或放线菌酮（起抑制霉菌的作用），效果会更好。 3、培养

将上述接种过土壤悬液的平板倒置，于28～30℃培养，至长出菌落为止（24～36h）。 4、挑菌纯化

在平板上选择分离较好的有代表性的单菌落接种斜面，同时作涂片检查，若发现不纯，应挑取此菌落做进一步划线分离，或制成菌悬液再做稀释分离，直至获得纯培养体。 5、计数

选取混菌法和涂抹法中每皿菌落数30～300的平板，分别按“稀释平板测数法”中的“混合平板测数法”和“涂抹平板测数法”中的公式计数。这样求得的是每克原始土样中的活菌数，若要折算为每克干土的含菌数，还应将此数值除以干土在土样中所占的质量分数(烘干土的质量/原土样的质量)。

注：土壤含水量的测定是将一定质量的土壤在105～110℃下烘干至恒重，再称干重。 （三）、土壤中放线菌的分离与计数 1、 土壤稀释液的制备

按实验“稀释平板计数法”中的方法进行，将菜园土稀释至10－5。在稀释时，可在盛无菌水的三角瓶中加10滴100g/L的石炭酸溶液和50μg/m L 的制霉菌素以抑制细菌和霉菌的生长。 2、 分离方法

采用稀释平板分离法，又可分为两种方法。

⑴混菌法：按“稀释平板计数法”中的“混合平板培养法”进行，所不同者是稀释度，应采用10－3、10－4、10－5三个稀释度，各做3个重复。

⑵涂抹法：按“稀释平板计数法”中的“涂抹平板计数法”进行，应采用10－2、10－3、10

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三个稀释度，各做3个重复。

3、 培养

将上述接种过土壤悬液的平板倒置于28～30℃培养4～5d。 4、 挑菌纯化

从平板中选择分离较好的放线菌菌落（应与细菌菌落区别开）较接斜面，并制片作纯度检查，若不纯，应进一步将该菌作稀释平板分离或划线分离，直至获得纯培养。 （四）、土壤中真菌的分离纯化与计数 1、 土壤稀释液的制备

按实验“稀释平板计数法”中的方法进行，将土样稀释至10。 2、 分离方法

采用稀释平板分离法。又可分为两种方法。

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⑴混菌法：按“稀释平板计数法”中的“混合平板培养法”进行，所不同的是稀释度，应选10、10、10三个稀释度进行接种。

⑵涂抹法：按“稀释平板计数法”中的“涂抹平板计数法”进行，所不同的是稀释度，应选10-1、10－2、10－3三个稀释度进行接种。 3、 培养

将上述接种土壤悬液的平板倒置于28℃培养3～5d。 4、 挑菌纯化

从长有单菌落的平板中选取典型的真菌菌落（包括酵母菌菌落）转接斜面，并同时制片作纯度检查。若不纯，应进一步挑取该菌落采用划线分离，或制成菌悬液进一步作稀释分离，直至获得纯培养体为止。 5、 计数

选取每皿菌落数在10～100之间的平板用于计数。不应遗漏酵母菌的菌落，必要时可制片检查，以免误为细菌菌落，具体方法见土壤中好气性细菌的分离与计数。 6、 菌种保存

将分离到的真菌转接到PDA斜面上培养，待长好后，置于冰籍中保存，必要时进行深入研究。

九、作业与思考题 （一）作业

1、将稀释平板测数实验结果填入下表中

稀释平板测数结果表

稀释度 菌落数 1g样品活菌数 计算结果时，常按下列标准从接种后的3个稀释度中选择一个合适的稀释度，求出每克菌剂中的含菌数。

（1）同一稀释度各个重复的菌数相差不太悬殊。

（2）细菌、放线菌、酵母菌以每皿30～300个菌落为宜，霉菌以每皿10－100个菌落为宜。★你能解释原因吗？

选择好计数的稀释度后，即可统计在平板上长出的菌落数，统计结果按下式计算。 混合平板计数法

每g样品的菌数＝同一稀释度几次重复的菌落平均数×稀释倍数 涂抹平板计数法

每g样品的菌数＝同一稀释度几次重复的菌落平均数

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-2

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10 1 2 3 平均 1 －710 2 3 平均 1 －810 2 3 平均 －9

2、计算每克干土中好气性细菌的数量；

3、挑选有代表性的细菌菌落涂片，做革兰氏染色，记录细菌的形态和革兰氏染色的反应性； 4、选取每皿放线菌菌落数为30～300的平板进行计数，应注意剔除混在其中的细菌菌落和霉菌菌落；

5、菌种保存 挑取典型放线菌菌落接种于高氏一号斜面上，在28～30℃下培养5～7d后，置于4℃冰箱中保存；

6、 计算每克干土中真菌的数量。 （二）思考题

1、 在分离真菌时为什么需加链霉素（庆大霉素或氯霉素），而不加青霉素？ 2、 如何确定平板上某个单个菌落是否为纯培养？

3、 你所做的涂布平板法和划线法是否较好地得到了单菌落？如果不是请分析原因并重做。

附：微生物菌种的保藏

一、实验目的与要求

了解菌种保藏的基本原理，掌握菌种保藏的常用方法。 二、重点与难点

根据实验过程中所用到的菌种情况选择合适的菌种保藏方法。 三、教学方法与手段

本次实验课主要采取讲授法和演示法,辅以视频影象资料进行教学。 四、实验内容

1、斜面传代保藏法； 2、液体石蜡保藏法； 3、沙土管保藏法； 4、冷冻干燥保藏法。 五、实验原理

微生物菌种保藏的基本原理就是使微生物的生命活动处于半永久性的休眠状态，即使微生物的新陈代谢作用限制在最低的范围内。干燥、低温、缺氧是保证这种状态的主要措施。 六、实验材料和器皿

细菌、酵母菌、放线菌和霉菌的斜面菌种。

牛肉膏蛋白胨培养基斜面，麦蚜、芽汁培养基斜面，高氏1号培养基斜面，马铃薯培养基斜面。

无菌水、液体石蜡、P2O5、脱脂奶粉、10%HCI、干冰、95%乙醇、食盐、河沙、瘦黄

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土（缺乏有机质）。

无菌试管、无菌吸管（1mL 及5mL）、无菌滴管、接种环、40目及100目筛子、干燥器、安瓿瓶、冰箱、冷冻干燥装置、酒精喷灯、250mL三角烧瓶等。 七、实验过程

（一）斜面传代保藏法

1、贴标签 取各种无菌斜面试管数支，将注有菌株名称和接种日期的标签贴上，贴在试管斜面的正上方，距管口2-3 ㎝ 处。

2、斜面接种 将待保藏的的菌种用接种环以无菌操作法移接至相应的试管斜面上，细菌和酵母菌宜采用对数生长期的细胞，而放线菌和丝状真菌宜采用成熟的孢子。

3、培养 细菌37℃恒温培养18-24h ，酵母菌于28-30℃培养36-60 h，放线菌和丝状真菌置于37℃恒温培养4-7d 。

4、保藏 斜面长好后，可直接放入4℃冰箱保藏，为防止棉塞受潮长菌，管口棉花应牛皮纸包扎好，或换上无菌的胶塞，亦可用熔化的固体石蜡熔封棉塞或胶塞。

保藏的时间依微生物的种类而不同，酵母菌、霉菌、放线菌及有芽孢的细菌可保存2-6个月移种一次，而不产芽孢的细菌最好每月一次，

此法的特点是容易变异，杂菌污染的机会多。 （二）液体石蜡保藏法

1、液体石蜡灭菌 在 250 mL 三角瓶中装入 100mL 液体石蜡，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，121℃湿热灭菌 30 min ,然后于40℃恒温箱中放置14d ，或置于105-110℃烘箱中1h ，除出石蜡油中的水分，备用。

2、接种培养 同斜面传代保藏法。

3、加液体石蜡 用无菌滴管吸取液体石蜡以无菌操作加到已长好的菌种斜面上，加入量以高出斜面顶端1cm 为宜。

4、保藏 棉塞外包牛皮纸，将试管直立放置于4℃冰箱中保存。

利用这种保藏方法，霉菌、放线菌、有芽孢的细菌可保藏2年左右，酵母菌可保藏1-2年，一般无芽孢细菌也可以保藏1年左右。

5、恢复培养 用接种环从液体石蜡下挑取少量菌种，在试管壁上轻靠几下，尽量使油滴净，再接种于新鲜培养基上培养。由于菌体上粘有液体石蜡，生长较慢且有粘性，故一般须转接2次才能获得良好菌种。 （三）沙土管保藏法

1、沙土处理

（1）沙处理 取河沙经40目筛，去除大颗粒，加10%HCI浸泡（用量以浸没沙面为宜）2-4 h ，或煮沸30 min，以除去有机杂质，然后倒出盐酸，用清水冲洗至中性，烘干或晒干，备用。

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（2）土处理 取非耕作层瘦黄土（不含有机质），加自来水浸泡洗涤数次，直至中性，然后烘干，粉碎，用100目筛子过筛，除去粗颗粒后备用。

2、装沙土管 将沙与土按2∶1，3∶1或4∶1（W/W）比例混合均匀，装入试管中（10mm ×100mm ），装置约7cm 高，加棉塞，并外包牛皮纸，121℃湿热灭菌 30 min ,然后烘干。

3、无菌试验 每10支沙土管任抽一支，取少许沙土放入牛肉膏蛋白胨或麦芽汁培养液中，在最适宜的温度下培养2-4d ，确定无菌生长时才能使用。若发现有杂菌，经重新灭菌后，再作无菌试验，直到合格。

4、制备菌液 用5 mL无菌吸管分别吸取3 mL无菌水至待保藏的菌种斜面上，用接种环轻轻搅动，制成悬液。

5、加样 用1 mL吸管吸取上述菌悬液0.1-0.5mL加入沙土管中，用借重环拌匀。加入菌液量以湿润沙土达2/3高度为宜。

6、干燥 将含菌的沙土管放入干燥器中，干燥器内用培养皿盛P2O5做干燥剂，可再用真空泵连续抽气3-4h ，加速干燥。将沙土管轻轻一拍，沙土呈分散状即达到充分干燥。

7、保藏 沙土管可选择下列方法之一来保藏： （1）保存于干燥器中；

（2）用石蜡封住棉花塞后放入冰箱保存；

（3）将沙土管取出，管口用火焰熔封后放入冰箱保存；

（4）将沙土管装入有CaCI2 等 干燥剂的大试管中，塞上橡皮塞或木塞，再用蜡封口，放入冰箱中或温室下保存。

8、恢复培养 使用时挑取少量混有孢子的沙土，接种于斜面培养基上，或液体培养基内培养即可，原沙土管仍可保藏。

此法适用于保藏能产生芽孢的细菌及形成孢子的霉菌和放线菌，可保藏2年左右。但不能用于保藏营养细胞。 （四）冷冻干燥保藏法

1、准备安瓿管 选用内径5mm ，长10.5cm 的硬质玻璃试管，用10%的HCI浸泡8-10h 后用自来水冲洗多次，最后用去离子水洗1-2次，烘干。将印有菌名和接种日期的标签放入安瓿管内，有字的一面朝向管壁。管口加棉塞，121℃灭菌30min 。

2、制备脱脂牛奶 将脱脂奶粉配制成20%乳液，然后分装，121℃灭菌30min，并做无菌试验。

3、准备菌种 选用无污染的纯菌种，培养时间，一般细菌24-48 h，酵母菌为3d ，放线菌与丝状真菌7-10 d。

4、制备菌液及分装 吸取3m L 无菌牛奶直接加入斜面菌种管中，用接种环轻轻搅动菌落，再用手摇动试管，制成均匀的细胞或孢子悬液。用无菌的长滴管将菌液分装于安瓿管底部，每管装0.2 m L。

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5、预冻 将安瓿管外的棉花剪去并将棉塞向里推至离管口约15 mm处（图示），再通过乳胶管把安瓿管连接于总管的侧管上，总管则通过厚壁橡皮管及三通短管与真空表及干燥瓶、真空泵相连接（图示），并将所有安瓿管浸入装有干冰和95%乙醇的预冷槽中，此时，槽内温度可达-40—-50℃，只需冷冻1 h左右，即可使悬液冻成固体。

6、真空干燥 完成预冻后，升高总管使安瓿管仅底部与冰面接触，此时温度约-10℃，以保持安瓿管内的悬液仍呈固体状态。开启真空泵后，应在5-15 min内使真空度达66.7 Pa 以下，使被冻结的悬液开始升华，当真空度达到26.7-13.3 Pa时，冻结样品逐渐被干燥成白色片状，此时使安瓿管脱离冰浴，在室温下（25-30℃），升温可加速样品中残余水分的蒸发。总干燥时间应根据安瓿管的数量，悬浮液装置及保护剂性质来定，一般3-4 h。

7、封口 样品干燥后继续抽真空达1.33Pa时，在安瓿管棉塞的稍下部位用酒精喷灯火焰灼烧，拉成细颈并熔封（图示），然后置4℃冰箱中保藏。

8、恢复培养 用75%乙醇消毒安瓿管外壁后，在火焰上烧热安瓿管上部，然后将无菌水滴在烧热处，使管壁出现裂缝，放置片刻，让空气从裂缝中缓慢进入管内后，将裂口端敲断，这样可以防止空气因突然开口而进入管内使菌粉飞扬。将合适的培养液加入冻干样品中，使干粉充分溶解，再用无菌水的长颈滴管吸取菌液至合适培养基中，放置在最合适温度下培养。

冷冻干燥保藏法综合利用了各种有利于菌种保藏的因素，如低温、干燥和缺氧等，是目前最有效的菌种保藏方法之一。保存时间可达10年以上。 八、注意事项

1、从液体石蜡封藏的菌种管中挑菌后，接种环上带有油和菌，故接种环在火焰上灭菌时要首先在火焰旁边烤干再直接灼烧，以免菌液四溅，引起污染。

2、在真空干燥过程中安瓿管内样品应保持冻结状态，以防止抽真空时样品产生泡沫而外溢。

3、熔封安瓿管时注意火焰大小要适当，封口处灼烧要均匀，若火焰过大，封口处易弯斜，冷却后易出现裂缝而造成漏气。 九、作业与思考题 （一）作业

1、按以下项目列表记录菌种保藏方法和结果： 2、试述各种保藏方法的优缺点。 （二）、思考题

1、如何防止菌种管棉塞受潮和杂菌污染？

2、冷冻干燥装置包括哪几个部件？各个部件起什么作用？

3、试举例说明，如何设计一个实验方案，选用一种保藏方法保藏某一优良高产菌株。

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菌种保藏方法和结果

接种日期 菌种名称 中文名 学名 培养条件 培养基 培养温度 保藏方法 保藏温度 操作要点

实验四十 微生物鉴定中常用的生化反应

一、实验目的与要求

1、学习点接法接种，检测细菌能否产生淀粉酶和利用淀粉的能力； 2、 检测细菌对油脂的水解能力；

3、学习穿刺接种的方法，了解细菌对明胶的分解和利用情况； 4、检测细菌对牛乳的分解和利用情况。 二、重点与难点

在做明胶液化试验过程中对于培养温度的控制是实验能否顺利进行的一个关键因素，因为明胶在低于20℃时会凝固，高于25℃时会自行液化。若要在高于20℃下培养细菌，观察时应放在冰浴中。但是如果明胶被细菌液化，即使在低温下明胶也不会再凝固。 三、教学方法与手段

本次实验课采取讲授法与演示法相结合的方式进行教学。 四、实验内容 1、 淀粉水解试验； 2、 油脂水解试验； 3、 明胶液化试验； 4、 石蕊牛乳试验。 五、实验原理

有些细菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶。淀粉酶可以使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不再变蓝色。

细菌产生的脂肪酶能分解培养基中的脂肪生成甘油及脂肪酸。脂肪酸可以使培养基pH下降，可通过在油脂培养基中加入中性红做指示剂进行测试。中性红指示范围为pH6.8

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（红）～8.0（黄）。当细菌分解脂肪产生脂肪酸时，则菌落周围培养基中出现红色斑点。

某些细菌分泌蛋白酶分解明胶，产生小分子物质。如果细菌具有分解明胶的能力，则培养基可由原来固体状态变成液体状态。

牛乳中主要含有乳糖、酪蛋白等成分。细菌对牛乳的利用主要是指对乳糖及酪蛋白的分解和利用。牛乳中常加入石蕊作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。石蕊中性时呈淡紫色，酸性时呈红色，碱性时呈蓝色，还原时则部分或全部脱色。细菌对牛乳的利用可分三种情况：

（1）酸凝固作用：细菌发酵乳糖后，产生许多酸，使石蕊牛乳变红，当酸度很高时，可使牛乳凝固，此称为酸凝固。

（2）凝乳酶凝固作用：某些细菌能分泌凝乳酶，使牛乳中的酪蛋白凝固，这种凝固在中性环境中发生。通常这种细菌还具有水解蛋白质的能力，因而产生氨等碱性物质，使石蕊变蓝。

（3）胨化作用：酪蛋白被水解，使牛乳变成清亮透明的液体。胨化作用可以在酸性条件下或碱性条件下进行，一般石蕊色素被还原褪色。 六、实验材料

1、活材料：大肠杆菌（E. coli）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、黏乳产碱杆菌（Alcaligenes viscolactis）、铜绿假单胞菌（Psudomonas aeruginosa）、普通变形杆菌（Proteus vularis ）。

2、培养基：淀粉培养基：牛肉膏蛋白胨培养基加0.2%的可溶性淀粉；油脂培养基：牛肉膏蛋白胨培养基加花生油10mL、0.6%中性红水溶液1mL；明胶液化培养基：蛋白胨5g，明胶100～150g，水1000mL, pH7.2～7.4，115℃灭菌20min。石蕊牛乳培养基：牛奶粉100g、石蕊0.075g、水1000 mL、pH6.8，121℃灭菌15 min 。

3、试剂：卢哥氏碘液。 七、实验用品

平皿、接种环、酒精灯、试管、接种针等。 八、实验方法 （一）淀粉水解试验

1、准备淀粉培养基平板：将熔化后冷却至50℃左右的淀粉培养基倒入无菌平皿中，待凝固后制成平板。

2、接种：用记号笔在平板底部划成两部分，在每部分分别写上菌名，用接种环取少量的待测菌，点接在培养基表面的相对应部分的中心，其中一个菌种应是枯草杆菌做对照菌。★你能解释原因吗？

3、培养：将接种后的平皿置于28℃恒温箱培养24h。

4、检测：取出平板，打开平皿盖，滴加少量的碘液于平板上，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板。菌落周围如出现无色透明圈，则说明淀粉已经被水解，表示该细菌具有分解淀粉

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的能力。可以用透明圈大小说明测试菌株水解淀粉能力的强弱。 （二）油脂水解试验

1、将装有油脂培养基的三角瓶置于沸水浴中熔化，取出并充分振荡，使油脂均匀分布，再倾入无菌平皿中，待凝固成平板。

2、接种：于同一平皿的两边接种，其中一种是金黄色葡萄球菌作为对照菌。置于37℃恒温箱培养24h，取出后观察平板菌苔颜色，如果出现红色斑点，即说明脂肪被水解了，此反应为正反应。红色斑点大小说明测试菌株水解脂肪能力的强弱。 （三）明胶液化试验

1、接种：用穿刺接种法接种大肠杆菌或产气肠杆菌于明胶培养基中。

2、培养：放20℃恒温箱中培养48h。若细菌在20℃下不长，则应放在最适温度下培养。 3、观察结果：观察培养基有无液化情况及液化后的形状。

因明胶在低于20℃时凝固，高于25℃时自行液化，若是在高于20℃下培养的细菌，观察时应放在冰浴中观察，若明胶被细菌液化，即使在低温下明胶也不会再凝固。 （四）石蕊牛乳试验

1、接种：将黏乳产碱杆菌和铜绿假单胞菌接种入石蕊牛乳培养基中。

2、培养：将接种后的试管于37℃恒温培养7d，另外保留一支不接种的石蕊牛乳培养基作为对照。

3、结果观察：取出培养物，以不接种任何细菌的试管为对照，观察接种不同细菌生长后的变化情况。 九、作业与思考题 （一）作业

1、绘图表示淀粉水解试验的实验结果； 2、绘图表示油脂水解试验的实验结果； 3、绘图表示明胶液化试验的实验结果； 4、将石蕊牛乳试验的结果填入下表中；

石蕊牛乳试验的结果

培养基变化 产酸及酸凝固 产碱及碱凝固胨化 （二）思考题

黏乳产碱杆菌 铜绿假单胞菌 47

1、 你怎样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？ 2、 不利用碘液，你怎样证明淀粉水解的存在？

3、 接种后的明胶试管可以在35℃培养，在培养后你必须做什么才能证明水解的存在？ 4、 试解释在石蕊牛奶中的石蕊为什么能起到氧化还原指示剂的作用？ 5、 将上述几个实验结果填入下表中，“+”表示阳性，“—”表示阴性。

微生物鉴定中常用的生化反应结果表

菌名 淀粉水解试验 枯草芽孢杆菌 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 普通变形杆菌

油脂水解试验 明胶液化试验 石蕊牛奶试验

附：微生物自动鉴定仪鉴定

一、实验目的与要求

了解微生物自动分析系统的工作原理和基本操作流程。

二、重点与难点

英国先德荧光快速微生物鉴定/药敏系统主要是通过检测荧光的增加间接地测定MIC值。

三、教学方法与手段

本次实验课采取讲授法和演示法进行教学。

四、实验内容

利用英国先德荧光快速微生物鉴定/药敏系统进行微生物快速鉴定。

五、实验原理

要鉴定一种微生物，用传统的方法需进行大量的工作，其中微生物的生理生化反应是重要的内容之一，但所需时间很长。近几十年来，根据微生物的主要生理生化特性相应建立了许多自动鉴定卡或板。目前，借助计算机的快速发展又创建了不少的微生物自动鉴定系统，

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包括自动鉴定板（卡）、和数据库两大部份，这样能很方便地将鉴定卡插入计算机，判别实验结果，并将其结果与数据库中所收集的微生物信息进行比较，很快便确定待测菌株的分类地位。SENSITITRE MICROBIOLOGY SYSTEMS ARIS英国先德荧光快速微生物鉴定/药敏系统工作原理：通过检测荧光的增加间接地测定MIC值。SENSITITRE系统采用传统生化反应，8进位数码鉴定及荧光分析相结合，荧光分析是用荧光标记细菌表面特异酶的底物，经细菌水解底物产生荧光判断结果，不同的细菌作用于不同的底物，激发出不同强度的荧光，即可鉴定不同的细菌。Sensititre的96孔鉴定板中共有32个生化反应，每4项生化反应阳性值“8”，第二项反应阳生值为“4”，第三项反应阳性值为“2”，第四项反应阳性值为“1”，各项反应阴性记为“0”。将每组4项反应的阴、阳性结果转换成数值并相加，如2、3项生化反应的阴、阳性结果转换成数值并超过9，则以字母代表，如第1、3项生化反应为阳性，组值应为“10ˊ”，此时就以“A”表示，若组值为11，则以“B”表示，以此类推。将各组反应的组值相加，32项生化反应可得到一组8位数的生物数码。

MIC测定原理：采用NCCLS推荐改良的微量肉汤稀释2-8点，在每一反应孔内掺入荧光底物，若细菌生长，表面特异酶系统水解荧光底物，激发灾光，反之无荧光。以最低药物浓度仍无荧光产生的浓度为最低抑菌浓度（MIC），分析时间明显缩短。

六、结构组成

1、硬件

模块式组成：手动、自动、全自动可自由组合，易于升级。在ARIS的孵育箱有可盛放64板的转盘，鉴定实验中无需添加试剂和加测试验。本实验选择C。

A．Sensitouch（手动装置） B．ARIS（全自动装置） C．AutoReader（自动装置）

D．AutoInoculator（全自动加样器） 2、软件

采用功能强大的UNIX工作站系统软件平台，可直接进入全院网络同应用，软件适用于各种组合的硬件系统。根据NCCLS标准设定强大的流行病学统计功能。可随时通过软件升级来增强系统功能

3、耗材

96孔国际标准板，独创3个样本/每块板、鉴定板、全值药敏板、阈值药敏板、鉴定/药敏组合板、自由设定板。超过500种革兰氏阴性致病菌及革兰氏阴性菌。全世界最多最新的（300多种）抗生素药敏分析。各种板有效期为18-24个月。全部消耗品常温保存，避免

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预升温过程。

4、性能特点

（1）首创荧光快速鉴定/药敏分析

（2）95%的革兰氏阴性菌鉴定在5h 内完成。 （3）独创每块板上分析3个样本

（4）干燥试剂技术使各板有效期为18-24个月 （5）全部消耗品常温保存，避免预升温过程 （6）符合NCCLS标准的全值药敏分析技术 （7）半自动组合可升级为全自动装置。

七、实验过程

实 验 操 作 过 程 简 图

培养出新鲜纯菌

革兰染色

选板（G-选AP80板；G+选AP90板；其他选IDS板）

配置一定浓度的菌悬液

板条加样

35℃孵育一定时间（全自动仪器培养和读数不需要人为干涉）

读数 报告结果

八、作业与思考题 （一）作业

将实验结果写成书面报告，分析并确定被鉴定的微生物种类。 （二）思考题

微生物自动分析系统与传统的微生物分析鉴定过程相比，各自的优缺点在哪里？根据自己的理解说明在哪些方面需要进一步改进？

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/aftr.html