兽医生物制品作业

免疫佐剂及其研究进展

摘要： 免疫佐剂是指与抗原同时或预先应用，能增强机体针对抗原的免疫应答能力或改变免疫反应类型的物质。1925年，法国兽医免疫学家Ramon首先观察到在疫苗中加入某些与之无关的物质可以特异地增强机体抵抗反应。1926年，Glenny最先将铝化合物作为免疫佐剂应用于白喉外毒素疫苗。1951年，Freund将液体石蜡与羊毛脂（乳化剂）按一定比例混合后，加入抗原研制成油包水的乳胶，免疫动物后效果极佳，可产生高效而持久的抗体。1956年，Johnson发现革兰氏阴性细菌的内毒素具有佐剂活性。此后, 许多国家都不同程度地开展了这方面的研究。 目前正在开发的新型疫苗有合成肽疫苗、基因工程疫苗、核酸疫苗、转基因植物口服疫苗等，这些新型疫苗具有良好的抗原特异性和低毒性。但由于其抗原分子小，纯化程度高，疫苗的免疫原性较差，所以需要安全有效的佐剂来增强疫苗的效力。近年来佐剂的发展迅猛，多种新型佐剂层出不穷，人们对佐剂的作用机理亦有更深入的认识。 关键词：佐剂；免疫应答反应；疫苗；免疫原性

1 免疫佐剂作用机理

Cox 等提出佐剂增强免疫应答5种可能的机制：免疫调节，抗原提呈，诱导CTL，靶向传递和抗原储存。佐剂增强免疫应答的机制尚未完全阐明，其作用机制包括：①在接种部位形成抗原贮存库，使抗原缓慢释放，延长抗原在局部组织内的滞留时间，较长时间使抗原与免疫细胞接触并激发对抗原的应答。②增加抗原表面积，提高抗原的免疫原性，辅助抗原暴露并将能刺激特异性免疫应答的抗原表位递呈给免疫细胞。③促进局部的炎症反应，增强吞噬细胞的活性，促进免疫细胞的增殖与分化，诱导细胞因子的分泌。

2 佐剂的种类

2.1 铝佐剂

铝作为疫苗佐剂已使用 70余年 ,它为疫苗的免疫效率等诸多方面问题的解决起到了重要的作用. 铝佐剂的作用是在组织中形成抗原贮藏库;产生颗粒性抗原来促进抗原提呈给免疫细胞 ;使抗原滞留 ,缓慢释放 ,从而吸引活性淋巴细胞 ,激活补体系统. 铝佐剂是目前应用最为广泛的一类佐剂 ,已批准的含铝佐剂疫苗包括 DTP、 无细胞百日咳疫苗 DTP (DTaP)、 b型流感杆菌 (H I B)疫苗 (不是所有的 )、 乙型肝炎 (HB)疫苗 ,以及所有的 DTaP、 HI B或 HB的联合疫苗.还包括甲型肝炎疫苗、 莱姆病疫苗、 炭疽疫苗和狂犬病疫苗. 铝佐剂的缺点是它不能诱导产生 Th1型反应 ,干扰细胞免疫 ,并阻断 CD8 + CT L的激活 ,使得疫苗的免疫保护不全面 ,不持久 ,并且也有一些毒副作用.尽管不断的有报告认为铝佐剂由于其自身的缺陷可能会引起局部的不良反应. 但由于铝佐剂的应用已经有具有几十年的历史 ,就安全性而言相对于其它的新型佐剂还是较为安全可靠的.

2.2 油乳佐剂

油乳佐剂中含有油和乳化剂, 它的作用机制是抗原包被在油相形成的微结构内, 使之形成贮存库而缓慢释放, 刺激机体免疫细胞产生抗体。油乳佐剂主要有弗氏佐剂、 佐剂 -65、 白油Span 佐剂、 MF -59 等。弗氏佐剂(Freunda djuvant, FA)分为弗氏完全佐剂(Freund complete adjuvant, FCA) 和弗氏不完全佐剂( Freundin complete adjuvant, FIA) 两种。FIA 是由低黏度的矿物油及乳化剂组成的一种贮藏性佐剂; FCA 是在不完全佐剂的基础上加一定量的分枝杆菌而成。FCA 是细胞免疫的强刺激剂, 而FIA 则仅能刺激体液免疫。FCA 和 FIA 主要不足之处: 可引起局部肉芽肿和无菌性脓肿; 使用矿物油佐剂的小鼠曾发生肿瘤, 因此可能有致癌问题; 稳定性差, 难以长期保存; 有对结核菌素致敏等毒副作用, 故仅限用于兽用。佐剂 -65 在体内可被代谢或分泌, 用于人的流感疫苗安全有效, 但较弗氏佐剂效果稍差。白油 Span 佐剂是用轻质矿物油作油相, 用 Span -80 或Span -85 及

Tween -80 作为乳化剂制成的油乳佐剂, 是当前兽医生物制品中最常用、 最有效的佐剂之

一。MF -59 为水包角沙鲨烯乳剂配方, 由角鲨烯、 Tween -80、 Span -85 等组成, 已广泛用作于各种亚单位疫苗佐剂, 可增强体液免疫应答和细胞免疫应答, 副反应轻微。油乳剂刺激局部产生肉芽肿或炎症反应, 吸引巨噬细胞等聚集, 这些细胞产生大量活性物质, 这些活性物质又增强了体液免疫和细胞免疫。

2.3 脂质体

脂质体是一类以提高抗原输送和递呈为主要作用的佐剂。脂质体由磷脂和固醇类组成的含双层脂质分子的脂质球，其表面为疏水性结构，而内部为亲水性结构。其主要优点是脂质体膜对细胞膜具有很好的亲和性，容易将包被在脂质体上或内部的抗原(或编码抗原的DNA)成分输入到细胞内。目前可以根据要求制备直径不同的脂质球，也可以根据抗原分子的理化特性将抗原分子包被在脂质体的不同部位，如将含疏水性氨基酸较多的抗原插入脂双层中，而将含亲水性基团较多的抗原包裹在脂质球的中间区。脂质体疫苗可经黏膜免疫。脂质体膜与细胞膜的亲和性，非常有利于将包被的抗原递呈给抗原递呈细胞(Antigen presenting cells， APC)，并使抗原被溶酶体所降解，进而通过MHCⅠ和MHCⅡ途径递呈给免疫系统，同时激发细胞和体液免疫应答反应。脂质体在制备过程中要求一定的技术性，其费用也较其他免疫佐剂高，目前对脂质体的应用研究还主要集中在医学研究方面，在兽医疫苗研究上的应用前景还具有一定的不确定因素。

2.4 微生物来源佐剂 CpG DNA

CpG DNA是指一类序列中大部分以非甲基化胞嘧啶核苷酸和鸟嘌呤核苷酸(CpG)为基元的寡聚体。可激活T细胞、B细胞、NK细胞等多种免疫效应细胞，又称为免疫刺激DNA序列(ISS)。CpG DNA主要存在于细菌源性的DNA中，能促进B细胞增殖分化并分泌IL-6，从而诱导IgM的分泌，也可激活单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等抗原递呈细胞，分泌多种细胞因子(如IL-12、IFN和TNF)，间接促进CTL和NK细胞的活性，从而诱导对细胞内病原体产生细胞免疫。

CpG DNA 能增强机体的特异性和非特异性免疫效应。CpG DNA序列作为免疫佐剂有如下特点：①与常用的氢氧化铝佐剂具有协同作用，CpG DNA可以纠正氢氧化铝诱导Th2类型应答的缺点。②一些不能与铝混合的减毒活疫苗或多价疫苗则可单独使用CpG DNA以增强其免疫原性。③应用范围广：CpG DNA作为疫苗佐剂，能增强鸡蛋溶菌酶、卵白蛋白、肿瘤抗原、乙肝疫苗和流感疫苗等抗原的免疫效果，能加强不同DNA疫苗的免疫反应。CpG DNA的免疫佐剂作用在小鼠和灵长类中均已得到证实。据报道，目前CpG DNA作为人乙肝疫苗佐剂已进入临床试验。

虽然CpG DNA具有安全、有效的优点，但还是有许多问题有待解决，如它的免疫激活机制、免疫剂量（实验表明，高剂量CpG DNA及重复给药可能导致毒性效应）和最适免疫途径还需要进一步研究。

2.5 免疫刺激复合物

免疫刺激复合物( ISCOM) 是一种有较高免疫活性的脂质小体,由极性抗原、植物皂甙(Quil A) 和胆固醇按1 ∶1 ∶1 的比例混合而成。它通过表面疏水作用将极性抗原分子和脂质分子交联成直径约为35 nm 的微粒,呈笼状结构,类似膜表面抗原构型。这种结构既固化了抗原,又模拟了体内识别抗原的微环境,从而增强抗原的黏附性和机体的吞噬作用,有利于和抗原递呈细胞(APC) 膜相互作用,诱导辅助性T 细胞的克隆和细胞毒性T 淋巴细胞(CTL)的应答。ISCOM 对细胞免疫和体液免疫都有增强作用,能诱导产生高效价抗体,且出现时间早,持续时间长, 诱导的特异性抗体多为IgG1 、IgG2a 、IgG2b 及IgG3 ; 提高MHC Ⅰ分子在APC 中的表达,诱导产生IL221 、IL222 及IFN2γ。除了增强细胞免疫和体液免疫作用外, ISCOM 还具有黏膜免疫活性增强作用。存放和动物试验结果表明ISCOMs 的稳定性

和免疫原性均优于铝佐剂疫苗。

2.6 细胞因子佐剂

细胞因子是具有重要生物学活性的细胞调节蛋白，它包括淋巴因子和单核因子。细胞因子在许多动物模型系统中都是有效的免疫佐剂，能增强和保护机体免受病毒、细菌和寄生虫的侵袭，对肿瘤免疫和临床应用也有增效作用。虽然大多数情况下细胞因子没有FCA和皂苷有效，但它可用于人体，佐剂效率也有望得到改进。细胞因子作为免疫佐剂的研究主要集中在白细胞介素(IL)、干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)及转移生长因子(TCF)。免疫缺陷是由于某些细胞因子减少而引起的，因此，细胞因子用于增强免疫缺陷者的免疫能力有特别重要的意义。

2.7 纳米粒子佐剂

纳米粒子是指直径一般在 10～1000nm之间的聚合物形成的微粒 ,它具有独特的小尺寸效应和界面效应.

抗原物质或能编码免疫原多肽的 DNA或 RNA可被包裹于纳米粒子内部或是吸附在纳米粒子表面 ,也可通过化学连接作用与纳米粒子结合 ,纳米粒子佐剂可有效提高细胞免疫、 体液免疫和黏膜免疫。

2.8 天然来源佐剂

蜂胶具有广谱的生物学活性，是一种天然的免疫增强剂。应用蜂胶或配合抗原引入机体，既能引起特异性免疫应答，又能启动非特异性防御机制，能刺激免疫机制和丙种球蛋白活性，增加抗体产量，增强补体活性和吞噬细胞的吞噬能力。用蜂胶制成的禽霍乱菌苗，具有安全可靠、保护率高（95.5%）、免疫期长（6个月）、产生坚强免疫力的时间早（注射后第5天）和无毒副作用等优点。蜂胶所含的成分极其复杂。研究表明，蜂胶本身无明显抗原性和过敏性，毒副作用较小。天然来源佐剂还有多糖香菇多糖、云芝多糖、黄芪多糖、芦荟多糖、淫羊藿等。

3 存在的问题和展望

3.1 存在的问题及安全性

当前使用的各类佐剂，尚有许多不够理想之处，如某些佐剂接种引起局部炎症、罕见的肉芽肿或无菌性脓肿。在实验动物中观察到的对佐剂的全身反应包括不适、发热、佐剂性关节炎等。这些不良反应可能由佐剂与抗原本身的相互作用而引起，也可能由佐剂引起的对特定抗原的应答类型所致。因此，必须对佐剂进行更加深入的了解，阐明其免疫效应机理，合理利用，尽量使佐剂的应用安全高效。

3.2 展望

开发研制新型的免疫佐剂以增强疫苗的免疫效力并减少疫苗的毒副作用将是未来的发展趋势，新型疫苗佐剂是研究其免疫性与毒性的最佳平衡。它是生物反应调节剂中免疫调节剂，非特异性免疫刺激作用是发挥其免疫佐剂性，使机体产生保护性免疫应答所必需的基本条件。

随着研究的深入，今后对免疫佐剂的研究则主要集中在以下几个方面：①进一步开展对免疫佐剂构效关系及其活性分子结构改造的研究，研制出化学结构明确、分子质量低、低毒、高效的新型免疫佐剂。②在整体水平、细胞水平及分子水平上，探讨新型免疫佐剂的作用机制，为进一步安全、有效、合理地使用免疫佐剂提供理论依据。③开展抗原-载体-免疫佐剂的药剂学研究，包括优化免疫佐剂配方的研究，为制备低毒、高效、速效、长效的新免疫佐剂制剂开辟新途径；④开展诱导黏膜免疫的口服佐剂的研究。⑤天然药物免疫佐剂的开发研究。⑥免疫佐剂新用途研究。免疫佐剂的应用范围不断扩大，包括了免疫治疗药物、肿瘤疫苗，增强机体对细菌、病毒、真菌、寄生虫及一些转移瘤的抵抗力和免疫应答。⑦开展宿主内源性免疫调节剂用作免疫佐剂及其诱生剂的研究，特别是T细胞对抗原识别的分子基础

和控制T细胞活化和功能专职应答的研究进展，使免疫佐剂的作用不再局限于增强免疫应答，而更着重于诱导机体选择性地产生有效防御相应病原体感染的特异性免疫应答，减少抗原的副作用。

现在，由于高度纯化的新型疫苗的生产技术不断取得突破，而常规佐剂由于其自身的缺陷很难适应新型疫苗的开发，所以新佐剂的研究已经逐渐引起科研工作者的注意。随着科技的进步，研究的不断深入，相信上述诸多问题将逐一被解决，将有更多的佐剂用于疫苗制造，佐剂的有效应用会在人类和动物疾病的预防过程中，发挥更大的作用。

参考文献：

[1 ] Dotsika E, Karagouni E, Sundquist B, et al. Influence of Quillaja saponaria triterpenoid content on the immunomodulatory capacity of Epstein -Barr virus ISCOMs[ J] . Scand J Immunol, 1997,45:261- 268.

[2 ] 李忠明.当代新疫苗 [M ]. 北京:高等教育出版社 , 2001: 79 - 103.

[3] Vegel F R improving vaccine perfor mance with adjuvants [J ]. Clin Infect D is, 2000, 30

(13) : 266

[4 ] 栗克喜 疫苗中的铝佐剂专题讨论会 [ ] 国外医学 ,预防、 诊断 、 治疗用生物制品分册,2003,1(26):27-30

[5 ] Donnelly JJ. Ne w development in adjuvants[J]. Mechanisms of Ageing and Development . 1997, 93(1):171 - 177.

[6 ] Haagan DT,Mackichan ML , Singh M. Recent developments in adjuvants for vaccines against infectious diseases[J]. Biomolecular

Engineering, 2001, 18 (3) :69 - 85.

[7 ] 徐冰 ,史久华. 黏膜途径疫苗接种的免疫调节剂和送递系统(上) [J ]. 国外医学 ,预防、 诊断、 治疗用生物制品分册 , 2002, 25.

[8 ] 胡北侠 ,黄艳艳 ,任素芳 ,等. 兽医常用免疫佐剂的研究概况与发展趋势 [J]. 中国畜牧兽医 , 2005, 32(3):4 - 6.

[9 ] 许洪林 ,王世峰 ,郭斐 ,等. CpG寡脱氧核苷酸作为人用疫苗佐剂的初步研究 [J].中华医学杂志 , 2002, 82(8): 553 - 556.

[10 ] SasakiS, SuminK, Hamaji maK, etal Induction of systemic and mucosal immune respo ses to human immune ode ficiency viustypel by a DNA vaccine for mulated with QS21 saponin adjuvant viaint ramuscular and intransal routes [J]. JV irol, 1998, 72 (6) :4931.

[11 ] 动物细胞因子研究进展. 中国生物信息网 http: //www. b iotechwo rld. cn /nongye_main. aspx

[12 ] 潘杭君 ,孙红祥. 免疫佐剂的研究进展 [ J]. 中国兽药杂志 , 2004, 38 (1): 32 - 37.

[13 ] 吕凤林 ,何凤慈. 利用纳米材料做多肽疫苗佐剂的思考 [J]. 生物化学与生物物理进展 , 2001, 28(6):832 - 835.

[14 ] 李连奋 ,杨洪举. 免疫佐剂的发展情况 [ J]. 微生物学免疫学进展 , 1997, 25(2): 57 - 61.

[15 ] 王武军 ,黄一帆. 免疫调节剂研究进展 [ J]. 福建畜牧兽医 , 2001, 23(6): 1112.

反向疫苗学在疫苗研制生产中的作用

摘要： 随着基因组学和蛋白质组学技术的发展和应用， 疫苗学的研究也随之进入了一个新的时期， 以基因组序列为设计基础的 “反向疫苗学” 逐步形成。反向疫苗学是通过对某一病原体的基因组测序分析， 预测出候选抗原决定簇， 通过高通量表达和免疫学分析， 筛选和鉴定出具有一定免疫原性特征的蛋白质， 作为疫苗的免疫抗原。这不仅提高了候选疫 苗的筛选成功率， 还开辟了一条新的疫苗研制途径， 同时还有助于预测和发现以往所不知的各种免疫原， 具有十分重要和深远的意义。

关键词： 反向疫苗学； 基因组序列； 病原体； 免疫原性

1796年, 英国医生琴纳首先成功地接种牛痘苗来预防人类天花, 从此, 疫苗接种被认为是预防各种细菌和病毒感染的最佳选择。传统制备疫苗的方法是通过培养病原微生物来制备各种死疫苗, 减毒活疫苗以及亚单位疫苗。这些疫苗到目前为止已经成功地用于预防很多传染病的发生和流行。尽管这些传统方法制备疫苗取得了显著的效果, 但是并非所有的病原体都能成功地通过传统的方法来制备其疫苗, 而且一些采用传统方法制备的疫苗存在不良副反应严重、 安全性没有足够保障、 制备工艺复杂成本较高等缺点。目前, 随着越来越多的细菌全基因组测序工作的完成和生物信息学的发展, 为开发研制新型的、 安全有效的疫苗提供了一种新的方法) 反向疫苗学(Reverse vaccinology)。 它采取大规模、 高通量、 自动化和计算机分析的研究方法, 可以在短期内同时完成大量候选抗原的克隆表达和提纯, 为过去用传统疫苗学方法研究失败而不得不放弃的那些疑难疫病的疫苗发展提供了一条新的途径, 成为当前预防医学研究的前沿和热点领域。

1反向疫苗学

进入 21 世纪， 随着基因组学和蛋白质组学技术的发展和应用， 研究人员开始从全基因水平来筛选具有保护性免疫反应的候选抗原， 这就形成了一个崭新的疫苗设计策略， 即 “反向疫苗学” （reverse vaccinology）， 它通过对某一病原体的基因组测序分析， 筛选出抗原决定簇， 通过高通量技术， 在短期内完成大量候选抗原的克隆、 表达和纯化， 鉴定出具有一定免疫原性特征的蛋白质， 为一些不能用传统疫苗研究方法获得有效疫苗的疑难疫病的防控开辟了一条新的途径， 同时还有助于预测和发现以往所不知的各种免疫原， 为深入研究它们的特征及功能提供了可能。相对于常规或传统的疫苗研究方法， 反向疫苗学具有如下优势： ①便捷， 整个过程从分析基因组序列开始， 不需要培养微生物； ②宽泛， 基于将所有的蛋白质看做是潜在的具有免疫原性的思路， 适用于所有微生物疫苗的研究； ③安全， 可以对一些危险的病原微生物进行操作， 避免病原微生物的扩散； ④不受 病原微生物致病机理和免疫应答的限制。

2反向疫苗学的研究方法

目前， 用于反向疫苗学研究的方法主要有基因组的数据库分析、 基因产物的蛋白质组学研究、高通量表达、免疫学检测。 这些方法的设计思路和操作步骤大致相同，即通过计算机软件分析， 在病原体基因组中筛选抗原决定簇；利用基因芯片技术对选出的基因进行高通量克隆表达；然后通过体内、 外实验鉴定有效的抗原蛋白， 进行相关免疫效果的评价。

2.1 基因组的数据库分析

利 用 国 际 互 联 网 上 丰 富 的 数 据 库 资 源 和 BLASTX、BLASTN、 TBLASTX 等计算机程序， 对病原微生物基因组中DNA 片段的编码能力进行筛选， 对所有预测的开放阅读框架（open reading frame,ORF） 进行同源性搜索， 鉴定有潜在编码蛋白能力的 DNA 片段， 并对相关编码蛋白进行定位。

Xiang 等根据反向疫苗学，创建了以网络为基础的疫苗设计系统，称为 Vaxign。Vaxign

将微生物基因组和蛋白序列作为输入数据，根据不同疫苗的设计标准，来预测可能的疫苗靶位。在 Vaxign 程序的主要预测特征包括蛋白质的亚细胞定位、跨膜区、黏附率、基因组中的保守序列、与宿主 (人或小鼠) 蛋白质组序列相似性及主要组织相容性复合物 (major histocompatibility complex，MHC) Ⅰ和Ⅱ表位的黏附性。用户可以从一个基因组查询到经 Vaxign 程序预测的一个蛋白序列结果，或是完成输入蛋白序列的动态分析。Vaxign 已经存储了 40 多种病原体 (例如布鲁氏菌) 的计算机处理结果，分析结果说明 Vaxign 能特异和敏感地预测已知的疫苗靶位，也能提供新的疫苗靶位模型。

2.2 利用蛋白组学对预测蛋白进行功能分析

首先对蛋白质数据库 （SWISS-PROT、 TrEMBL、 PIR 等） 进行 BLAST 检索， 寻找同源蛋白。再利用二级数据库多序列比对结果寻找序列模式、 基序、 序型、 蛋白质指纹等结构功能特征。再使用 ProSite、 Prnt-S、 PFam、 Smart、 Blocks+、 InterPro、 MetaFam 等软件工具来预测表面相关蛋白的典型特征， 对蛋白质进行亚细胞定位的方法。

2.3 高通量表达

通过芯片技术和PCR技术将筛选出的有价值的ORF快速、大量的克隆和表达， 根据 ORF 设计引物， PCR 扩增， 将每个扩增产物克隆并在外源系统中表达， 一般都选择大肠杆菌表达系统； 再利用 His-Tag 和 GST 融合表达技术快速纯化重组蛋白，最后免疫小鼠， 进行相关的免疫学研究。

除了常规的 PCR 方法，Liang 等介绍了一种高通量的表达方法，即有转录功能的多聚酶链反应( transcriptionally active polymerase chain reaction，TAP) 方法。该方法合成具有转录功能的 PCR 片段，可以直接进行体内和体外表达实验。将获得的 TAP片段通过肌肉注射入小鼠体内，可诱导产生针对编码该抗原的超螺旋质粒相同的抗体。同时 TAP 不需要常规的克隆，可通过体内重组转移到表达载体中，既不需要限制性内切酶、也不需要胸苷腺嘌呤互补。该方法可以快速的、高通量的产生大量具有转录活性的基因。表达基因最常用的方法是将它们的融合物连接到组氨酸标签或是谷胱甘肽 S- 转移酶上，这样用简单的亲和层析柱层析就可以快速的纯化重组蛋白。对于不溶性抗原，用变性试剂 (例如尿素) 纯化，然后在精氨酸、甘油存在的情况下，两步透析法复性。而对于有二硫键的蛋白，则可加入少量氧化谷胱甘肽。对于产生和纯化的抗原可溶性的增加，可通过洗涤剂或是改变微生物的生长温度来达到。

2.4 免疫学检测

对重组蛋白免疫小鼠后的血清进行免疫学分析， 进一步确定多肽的表面定位和免疫原性。首先应用免疫血清进行免疫印迹， 确定蛋白质的定位， 进一步利用酶联免疫吸附试验法和流式细胞仪测定血清的抗体滴度和抗血清结合于活菌表面的能力。

3 反向疫苗学在疫苗研发中的应用

3.1 反向疫苗在细菌疫苗研发中的应用

3.1.1 B 群脑膜炎球菌（neisseria meningitidis serogroup B，MenB）B 群脑膜炎球菌， 为流行性脑脊髓膜炎 （流脑） 的病原菌， 可引起儿童和青少年急性化脓性脑膜炎和败血症。由于MenB 表面蛋白基因序列存在变异性以及荚膜多糖与人类组织存在交叉反应， 一直没有有效的疫苗用于预防。Pizza M 等首次应用反向疫苗学原理， 研制了 B 型脑膜炎球菌疫苗， 这是反向疫苗学运用的第 1 个例子。其研制方法是通过基因组数据库和应用分子生物学软件对 MenB 的全基因组进行筛选分析， 从 2158 个 ORFs 中预测出有 570 个基因编码表面暴露蛋白或分泌蛋白， 通过高通量表达和免疫原性评价后， 筛选出 29种能刺激机体产生抗体的抗原， 通过基因组序列比对分析、 抗异性攻击试验， 筛选出具有血型代表性的的 MenB 候选抗原，据此成功研制出多价 MenB 疫苗。

3.1.2 肺炎链球菌 （streptococcus pneumoniae） 肺炎链球球菌主要引起儿童的败血病、 肺炎、 脑膜炎及中耳炎等疾病。目前, 美国有一种有效的多联疫苗可防治肺炎链球菌感染, 但是这种有效的多联肺炎球菌疫苗也只包含了肺炎链球菌 70 多个血清型中 7 个血清型的多聚糖荚膜, 所以它并不是对所有血清型的链球菌都有效。最近, 韩国的研究人员测出了肺炎链球菌的全基因组, 为我们利用反向遗传学技术鉴定众多的潜在抗原基因奠定了基础。通过对所有的 2687 个阅读框架的综合评价, 最终确认了 130个阅读框架。用其中的 108 种编码产物接种实验动物, 发现有 6 种蛋白能产生有效的抗体以对抗肺炎链球菌的感染。应用其他技术手段也证明这 6 种蛋白存在于病原体表面, 并呈现出免疫原性。因此, 这些鉴定出的蛋白都可以作为研制肺炎链球菌的有效候选抗原蛋白。

3.1.3 肺炎衣原体（chlamydia pneumoniae）肺炎衣原体是一种人类专性胞内病原体， 感染后可引起肺炎、 动脉粥样硬化和心血管病等。由于肺炎衣原体有原体和网状体两种不同的发育阶段， 人们很难用现有的基因操作手段对其表面蛋白进行分析。2002 年， Montigiani S 等应用反向疫苗学的研究方法来鉴定衣原体表面蛋白， 通过分析肺炎衣原体的基因组序列，预测出157种可能的表面蛋白， 克隆表达后通过免疫检测技术，成功地定位原体期的肺炎衣原体表面蛋白， 为研制新型的肺炎衣原体疫苗奠定基础。

3.1.4 炭疽杆菌 （bacillus anthracis）炭疽杆菌是炭疽病的病原体， 由其胞内的大质粒 pXO1 所编码的保护性抗原 （PA）是目前制备炭疽杆菌疫苗的主要免疫原， 该类疫苗需多次免疫， 且有时会引起过敏反应。Ariel N 等通过运用功能基因组学分析筛选出 11 种抗原， 用炭疽杆菌抗血清评价其免疫原性， 结合生物信息学分析， 发现 3 种蛋白具有保护性抗原特征。这些新的蛋白可作为研制第 2 代炭疽杆菌疫苗的抗原。

3.2 反向疫苗学在病毒疫苗研发中的应用

3.2.1 人类免疫缺陷病毒 （human immunodeficiency virus，HIV）人类免疫缺陷病毒是获得性免疫缺陷综合征， 即艾滋病的病原体。传统 HIV 疫苗的研究， 主要研究包膜蛋白和核心蛋白， 但由于 HIV 病毒的高度变异性， 该类疫苗难以产生有效的中和抗体和诱导特异性细胞免疫反应。Osterhaus AD 等研究发现， HIV 病毒基因组可提供一些非结构的早期蛋白抗原，它们在病毒生活周期中含量少且短暂， 难以用传统的方法作为抗原研究， 而通过基因组提供的潜在抗原信息， 将这些早期蛋白作为抗原显示了很好的结果。

3.2.2 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV) 的外膜蛋白( S) 携带有 B和T 淋巴细胞表位, 能刺激机体产生保护性免疫应答反应, 是引起宿主产生保护性应答反应的免疫学 表位。通过基因工程手段获得这一免疫原性蛋白,进而可研制成基因工程疫苗。目前重组乙型肝炎疫苗(HBV) 已成功应用于乙型肝炎病毒感染, 也是迄今应用最成功、 最广泛的基因工程疫苗。

3.3 反向疫苗学在寄生虫疫苗研发中的应用

疟疾 （malaria）是通过蚊叮咬传播的寄生虫病， 其病原体为疟原虫。疟原虫在不同的生活周期中表达不同抗原， 使疫苗的研制非常困难。尽管已从疟原虫中鉴定出 20 多种抗原， 但没有一种适合做疫苗。应用反向疫苗学有望获得突破。从全基因组序列预测了 6000 个基因信息， 以重组蛋白形式表达或以 DNA 疫苗形式表达， 基因表达产物具有免疫原性。相信最终会研制出有效的疫苗防治疟疾。

4 展望

20世纪 90年代末是基因组时代开始的标志, 基因组测序和分析正处于飞速发展的时期。越来越多的病原微生物完成了基因组序列的测定, 为研究新型的有效疫苗和攻克各种感染性疾病开辟了道路。反向疫苗学的特点是大规模、 高通量、 自动化, 可在短期内完成大量候选疫苗抗原的筛选和鉴定, 而且还可发现具有保护性免疫反应的新抗原。 因此, 人们都寄希望于用它来解决传统疫苗学长期不能解决的某些重要传染病的疫苗预防问题。但是反

向疫苗学作为传统疫苗学的发展，本身还存在着一些不足之处。首先，基因组学可以预测大部分阅读框，但却不能预测所有的阅读框，而且预测基因的起始密码子也并非没有缺点，同时预测表面或分泌性蛋白的各种算法本身也存在不足之处。其次，一些阅读框在实际自然感染中表达的蛋白，与在实验室培养的细菌感染中表达的蛋白有明显差别，因此，出现抗血清与重组蛋白有强烈反应，但是与实验室培养细菌没有反应这种情况也不足为奇。最后，反向疫苗学方法目前只能应用于蛋白质抗原，不能鉴别非蛋白质抗原，如多糖、糖脂等。

尽管反向疫苗学存在着局限性和困难，但是在疫苗发展的道路上，仍起巨大的推动作用。在目前的研究中，已经运用这种方法从大量抗原中筛选出了一些候选疫苗，弥补了传统疫苗学的不足，今后也越来越成为疫苗开发中的重要手段,对疫苗的研制生产将会起到越来越重要的作用。

参考文献：

[1] Rappuoli R.Reverse vaccinology [J]. Curropin Microbio l2000,3 : 445-450 .

[2] Rappuoli R. Reverse vaccinology,a genome-based approach to vaccine development [J]. Vaccine 2001, 19 : 2688 -2691.

[3] Wizemann TM,Heinrichs JH,Adamou JE,et e of a whole genome approach to identify vaccine molecules affording protection against streptococcus pneumoniae infection[J].Infect Immun,2001,69(3):1593-1598.

[4] Mora M， Veggi D， Santini L， et al． Reverse vaccinology ［J］． Drug Discover Today， 2003， 10(8): 459-464．

[5] Xiang Z S， He Y Q． Vaxign: a web- based vaccine target design program for reverse vaccinology ［J. Procedia in Vaccinology， 2009， 1(1): 23- 29．

[6］ Liang X，Teng A，Braun D M，et al． Transcriptionally active polymerase chain reaction ( TAP): high throughput gene expressionusing genome sequence data ［J］ ． Gene Therapy Systems，2002， 277(5): 3593- 3598．

[7] Pizza M,Scarlato V,Masignani V,et al.Identification of vaccine candidates against serogroup B meningococcus by wholegenome

sequencing[J].Science,2000,287(5459):1816-1820.

[8] Wizemann TM,Heinrichs JH,Adamou JE,et e of a whole genome approach to identify vaccine molecules affording protection against streptococcus

pneumoniae infection[J].Infect Immun,2001,69(3):1593~1598.

[9] Montigiani S,Falugi F,Scarselli M,et al.Genomic approach for analysis of surface proteins in chlamydia pneumoniae[J].Infect Immun,2002,70(1):368-379.

[10] Ariel N.Search for potential vaccine candidate open reading frames in the Bacillus anthracis virulence plasmid pXO1： in silicon and in vitro screening[J]. Infect Immun,2002,70:6817-6827.

[11] Osterhaus AD,Van Baalen CA,Gruters RA,et al.Vaccination with Rev and Tat against AIDS[J].Vaccine,1999,17(20/21):2713-2714.

[12] Hoffman SL,Rogers WO,Carucci DJ,et al.From genomics to vaccines:malaria as a model system[J].Nat Med,1998,4:1351-1353.

[13] Zagursky R． Vaccine discovery research by reverse engineering［ J］． Drug Discovery Today， 2003， 21(8): 972- 973．

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