酶活测定方法

酶活测定方法

还原法

酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。在此反应体系中添加化学试剂 ,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。通过在特定的波长下 比色 ,即可求 出还原产物的含量 ,从而计算出酶活力的大小 。 色原底物法

通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。该底物与酶发生反应后 ,生色基团可被释放出来 ,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后 ,即可求出待测酶的活力。 粘度法

该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶 的活力。木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大 为降低。基 于Poiseuille定律我们知道 ,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。 高压液相色谱法

酶与其底物在特定的条件下充分反应后 ,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量 ,从而换算出酶活力的数值。 免疫学方法

常用 于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法 、免疫凝胶扩散法。这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应 ,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。 琼脂凝胶扩散法

将酶作用的底物与琼脂混合熔融后 ,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径 的小孔。在点加酶样并培养24h以后 ,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。

蛋白酶活力的测定

随着生物技术的发展及环保要求的提高，越来越多的酶制剂应用于制革生产中。比如浸水，脱毛，软化，脱脂等工序都用到大量的酶制剂，从酶的作用性质来看制革生产中用到的主要是蛋白酶和脂肪酶。酶的本质是蛋白质，所以酶在出厂后的长途运输及存放过程中，由于条件的变化、振荡、阳光等的作用，其活力要有所改变，故在使用之前必须测定其活力。作为计算酶制剂用量的依据，以达到预期的脱毛效果。即现测现用。

酶的活力是指酶催化底物进行反应的本领。即酶催化底物反应在一定时间内生成物越多或消耗的底物越大，则催化速度越快，活力越高。

酶活力的大小用酶活力单位（U，active unit）来表示。1961年国际酶学会议规定：1个酶活力单位是指在特定条件（25℃，其它为最适条件）下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。1979年国际生物化学协会为了使酶活性单位与国际单位制（SI）的反应速率相一致，推荐用Katal单位（也称催量，Kat）。规定为：在最适条件下，1秒钟能使1摩尔底物转化的酶量。Kat和U的换算关系：1 Kat=6×107U，1U=16.67nmol.s-1=16.67nKat。

把酶制剂的量和活力联系在一起，即为酶的比活力，它表示单位质量的蛋白质中所含的某种酶的活力单位的多少。是用来度量酶纯度的指标。在实际生产中所说的酶活力一般是指酶的比活力大小。 另外在实际的生产应用中，由于酶的性质不同，测定方法不同，很多酶的活力都有各自的惯用单位。 1、Folin法（第一法）测定蛋白酶活力

目前所用到的蛋白酶的种类比较多。根据每种酶作用的条件不同，主要是最适PH值不同而分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。其中酸性蛋白酶可用于毛皮的软化。在制革上则主要选用中性和碱性蛋白酶来脱毛。

定义：lg 固体酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度和pH值条件下，l min水解酪素产生lμg酪氨酸为一个酶活力单位，以U/g(U/mL)表示。

具体测定方法见《QB/T 1803-1993 工业酶制剂通用试验方法》及《SB/T10317-1999 蛋白酶活力测定法》。

表1 几种酶促反应最佳条件

2、胰酶活力测定

胰酶系从各种动物胰脏制取的混合物，主要是蛋白酶，脂酶和淀粉酶。白色或淡黄色无定形粉末，有微弱的肉类物臭味。溶于水呈微浑溶液，不溶于醇和醚。遇酸、碱及热即丧失活力，pH＝7.8~8.7活性强。水溶液遇酸、热、重金属或单宁酸时产生沉淀，经煮沸则迅速分解而变性。

胰酶用于原料皮脱灰后进行软化。胰酶中所含的弹性蛋白酶，可以分解弹性蛋白质，防止成革粒面出现碎玻璃花纹，提高产品质量。胰酶软化时，对皮内一些蛋白质进行不同程度的消解，可除去皮内残存的脏物、毛根分解产物、纤维间质等，有利于皮纤维进一步分散，促进躁剂与皮胶原的结合，以使成革具有柔软性、丰满性和良好的透气性。

酶软化是制造软革很重要的操作，但胰酶浓度过高，皮内胶原纤维损失大，致使成革松面。为了达到正常的软化目的，必须在软化之前，测定其活力，以便确定其含量。

[醋酸盐指示剂法]

（1）测定原理 胰酶能催化酪蛋白水解，而且胰酶量越多，被水解的酪蛋白就越多。一定量的胰酶，催化的酪蛋白越多或生成的分解产物越多，其胰酶的活力越大。与福林法蛋白酶活力不同的表示是，胰酶活力是用在一定条件下底物的消耗量来表示。即在一定的pH值和时间内1g胰酶能使酪蛋白完全水解的质量(g)，即胰酶能使酪蛋白转化的能力，又称酪蛋白转化力，以倍数来计量。控制胰酶的最适条件pH＝8~9、T＝(40±1)℃，用定量的酪蛋白和不同量的胰酶作用，水解一定的时间后，用醋酸盐(或醋酸)指示剂调节反应液pH值达到酪蛋白的等电点(pH＝4.6)附近，末被水解的酪蛋白呈白色沉淀析出，而水解产物则不沉淀。据此，则可找到恰好使定量的酪蛋白完全水解的最小胰酶用量。根据胰酶的体积和浓度，即可计算出胰酶对酪蛋白的转化倍数，即胰酶的活力。

（2）试剂 1.24:50硼酸水溶液；0.1mo1/L。NaOH水溶液；硼酸盐溶液，即1.24:50的H3BO4 20mL+2mL 0.1mo1/L NaOH；13.6％醋酸钠水溶液；60％醋酸溶液；醋酸盐缓冲液，即l 3.6％ NaAc与60％ HAc等体积混合。

（3）操作

① 配制底物酪蛋白 称取(精确至0.0001g)0.2g细酪蛋白于小烧杯中，加20mL蒸馏水，移取5mL 0.1mo1/L NaOH，40℃水浴上加热约30min，搅拌使之溶解，移人100mL容量瓶，加5mL H3BO4溶液，并定容到刻度(pH＝8.5)。

② 胰酶溶液的配制 在研钵中称取(精确至0.0001g)胰酶0.1g(先加3~5滴研磨，再补加15~17滴)，加1mL硼酸盐溶液，浸泡3~5min，研磨到无大块胰酶，转移定容到500mL容量瓶，用H2O定容。 ③ 粗测 取5支带刻度的干燥试管，按表1-2所示进行。依次滴加醋酸盐缓冲液0.5mL(10滴)，边滴边观察刚加人时是否产生白色沉淀，若缓冲溶液到了试管底部还不出现沉淀，说明酪蛋白已水解完全，有沉淀产生，证明酪蛋白没有全部水解，找出刚不产生沉淀的胰酶体积(mL)。即是5mL酪蛋白完全水解的最少胰酶量。

表2 胰酶活力粗测步骤

④ 精确测定 在粗测刚不沉淀至刚沉淀之间移取酶液量，梯度为0.1mL。例如表1-2中2.0mL刚沉淀，则取2.5~2.0mL。按表1-3所示进行。操作同上，找出刚好不产生沉淀胰酶的量，记为V。

表3胰酶活力精确测定步骤

（4）计算 胰酶活力X按照下式计算。

式中 ml —— 酪蛋白的质量，g； m2 —— 胰酶的质量，g；

V —— 终点时管中胰酶溶液的体积，mL。 （5）注意事项：

① 酪蛋白、胰酶、水按比例加入以后一定要使其混合均匀，否则将造成试管底部的酪蛋白没有水解，使测定结果不准确。 ② 水浴加热，使整个液面都进入到水中。

③ 试管的粗细程度。试管不可太粗或太细，既好摇匀又好观察，且粗细一致。

④ 配制好的胰酶和酪蛋白溶液在室温20℃以下存放24h有效，室温高于20℃时胰酶4h有效，酪蛋白8h有效。

⑤ 产生白色沉淀必须是现加现看，不能放置过久，否则酪氨酸也沉淀出来了。

3.l 还原糖法(Reducing sugar release)

这种方法是采用化学合成或从自然界提取的酶的底物来进行的。酶与底物在特定的条件(温度、PH值和底物浓度)下反应。反应产物是还原糖，通过比色确定还原糖的数量，同时制作标准曲线。酶的活性表示为每分钟产生lmmol的产物所需要的酶量(mg或ml)。 3.2 比色法(Colorimetric assays Ⅰ)

这种方法是对底物进行化学修饰，使其带有特定的可溶性生色基团物质，该生色基团能够产生特定颜色。在酶与底物发生反应后，生色基团就被释放出来，用分光光度计可以测定颜色的深度，并制作标准曲线。与已知标准酶的活性进行比较，计算出该酶的活性。这种方

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