生化，分子，细胞试验汇总

主要培养基的配制

LB液体培养基

胰蛋白胨 10 g，酵母浸出物 5 g，氯化钠 10 g，蒸馏水 1000 ml，用 1 mol/L HCl 调节 pH 至 7.4，121℃高压灭菌 20 min。如果需要加抗生素，则待灭过菌的培养基温度降到 55℃以下后加入适量的抗生素储存液。

LB 固体培养基

在LB液体培养基中加入2%琼脂。

DMEM细胞培养基

DMEM溶液90%(v/v)，FBS 10%(v/v)，青霉素100U/ml，链霉素100 ?g/ml

McCoy’s 5A细胞培养基

McCoy’s 5A溶液90%(v/v)，FBS 10%(v/v),青霉素100 U/ml，链霉素100 ?g/ml

实验试剂及药品的配制

1 mol/L Tris-HCl (pH8.0)

在800 ml的双蒸水中溶解Tris(三羟甲基氨基甲烷)121.1 g，用浓盐酸调pH至8.0，用双蒸水定容至1000 ml。121℃高压灭菌15 min，备用。

TE 缓冲液(pH8.0)

1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)10 ml和500 mmol/L EDTA(pH8.0)溶液2 ml，用双蒸水定容至1000 ml。121℃高压灭菌15 min，备用。

500 mmol/L 乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液(pH8.0)

在 800 mL 的双蒸水中加入18.6 g 乙二铵四乙酸二钠，充分溶解后，用10 mol/L NaOH 溶液调pH 至8.0，用双蒸水定容到1000 ml。121℃高压灭菌 15 min，备用。

溴化乙锭(EB)

1 g EB，加入100 ml 灭菌双蒸水中，磁力搅拌数h以确保其完全溶解，然后转入棕色瓶中，4℃保存。

TAE 电泳缓冲液(50×)

242 g Tris碱，57 ml冰乙酸，100 ml 0.5M EDTA，加灭菌去离子水定容至 1000 ml，使用时稀释50倍。

10% SDS

将10 g高纯度的SDS置于烧杯中，加入约 80 ml的ddH2O，68℃加热溶解，滴加盐酸调节pH值至7.2，定容至100 ml后，室温保存。

G418 (Neomycin)

用PBS (pH 7.4) 配成浓度为50 mg/ml的原液，0.22 ?m滤膜过滤除菌，分装储于-20℃备用。

基因组DNA提取液

1 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)1 mL和0.1 mol/L EDTA (pH8.0)溶液20 ml， 0.5% (m/v) SDS，加灭菌去离子水定容至100 ml，备用。

蛋白提取液

1M Tris-HCl (pH7.6) 5 ml，5 M NaCl 3 ml，10%SDS 1 ml，100% NP-40 1 ml，加灭菌去离子水定容至100 ml，备用。

100 mM 姜黄素

用DMSO配成浓度为100 mM的储存液，分装避光储存于-20℃备用。

100 mM CPT-11

CPT-11原装瓶为50 mg，加入802 ?l DMSO溶解，分装储存于-20℃备用。

100 mM DHA

DHA原装瓶为50 mg，加入1758 ?l DMSO溶解，配成浓度为100mM的储存液，分装避光储存于-20℃备用。

100 mM 5-Fu

用DMSO配成浓度为100 mM的储存液，分装避光储存于-20℃备用。

实验方法

细胞冻存（HEK293细胞为例）

1. 消化细胞并700rpm离心5min收集细胞；

2. 吸除上清，沉淀用冻存培养基（80% DMEM，10?S，10%DMSO，现配现用）充分重悬；

3. 将细胞悬液分装至冻存管中，1ml/管，标注细胞名称/型号、代数、日期、操作者，并迅速放于室温的冻存盒内； 4. -80℃过夜，然后转移至液氮罐中冻存。

细胞复苏（HEK293细胞为例）

1. 将冻存的细胞迅速从液氮罐中取出，放入37℃水浴中进行溶解至无冰晶；

2. 将细胞悬液转移至15ml无菌离心管中。逐滴加入5ml完全培养基，边滴加边充分摇动； 3. 700rpm离心5min收集细胞；

4. 吸除上清以2ml完全培养基来重悬细胞沉淀并转移到6孔板中进行培养。

总RNA提取

1) 2)

弃12或6孔板中的原Medium后，PBS 500 ul/孔洗两次.

TRIzol 1 ml/孔（组织经匀浆处理后每100 mg加入1ml的Trizol）。吹打混匀后转移到相应的做好标签的好的1.5 ml的离心管中，并立即放在冰上以防RNA降解，5 min. 3)

氯仿 200 ul/管，剧烈震荡15 s （Don’t Vortex！），使细胞充分裂解,室温静止3 min. 4) 5)

4℃，12000 rcf，15 min.

转移500 ul上清到相应的做好标记的1.5 ml的离心管中，加入500 ul/管异丙醇，颠倒混匀，室温静止10 min。4℃，12000 rcf，15 min. 6)

弃上清，加入用DEPC水配好的75%的乙醇1 ml/管，颠倒两次后，放4℃离心机，7500 rcf，5 min. 7)

弃上清，等RNA干燥透明后加入30 ul的DEPC水，吹打混匀使得RNA溶解后，1% 凝胶电泳分析（100V 15-20 min），置于-80℃冰箱保存。

基因克隆

1. 查找目标基因的基本信息，查找相关文献，设计克隆基因方案。利用DNA处理软件和引物设计软件设计引物，将引物序列送公司合成，根据合成引物的退火温度确定PCR退火温度。

2. 查询该基因有表达的细胞株，培养细胞，采用Trizol法提取总RNA。 3. 反转录。

4. PCR：首先进行预实验，跑胶初步判断大小，摸索最佳退火温度和体系。然后进行回收目标片段。

5. 连接18T vector：载体和插入片段的比例为1:3。 6. 转化感受态细胞，筛选单克隆。

7. 挑取单克隆至1ml LB液体培养基（含抗生素）中，37℃，300rpm，约10~12 h，小抽并且进行酶切验证。

8. 测序：挑取酶切验证正确的阳性克隆送测序。

9. 根据测序结果，将测序正确的片段连接入真核表达载体。实验室有多种表达载体，根据需要选择。连接体系参考T4Ligase 说明书。

10. 连接产物转化感受态，挑选阳性克隆进一步酶切验证，挑取阳性克隆中抽质粒并纯化，瞬转真核细胞（根据课题的方向选择细胞株），Western Blot验证所构建的表达载体是否在该细胞株中表达。 11. 大抽，操作步骤详见说明书。

中抽质粒（基因克隆时酶切验证时所用方法）

1）6000 rpm，离心5 min（4℃），弃上清;

2）重复步骤1），收集3~4ml菌液至1个EP管中；

3）加入2.5 ml 预冷的solution Ⅰ，吹打混匀，充分悬浮细菌； 4）加入2.5 ml 现配的solution Ⅱ，轻柔颠倒几次，充分混匀 （solution Ⅱ配置：0.4 M NaOH：2% SDS=1：1）；

5）加入3.5 ml预冷的solution Ⅲ，轻柔颠倒几次，充分混匀，中和裂解液的碱性；

6）冰浴10 min，使杂质充分沉淀；

7）12,000 rpm 离心10 min（4℃），轻轻吸取上清800 μl/管，转移至干净的1.5 ml离心管中；

8）加入2/3 体积的异丙醇（530 μl），混匀后冰浴5 min； 9） 12,000 rpm离心10 min，弃上清；

10）预冷的70% 乙醇溶液 750μl/管洗涤DNA沉淀，12,000 rpm离心10 min（4℃）；

11）弃上清，晾干，每管加入30 μl TE(含20μlg/ml RNase)，65 ℃，5 min；去除RNA；

12）将几管合并至一管，加等体积酚、氯仿混合液(成品)，剧烈振荡10 s； 13） 12,000 rpm离心10 min，取上清；

14）加入1/10体积的3 M NaAc 和2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，即1ml； 15）12,000 rpm 离心10 min，弃上清；

16）70% 乙醇水溶液洗涤DNA沉淀，12,000 rpm离心10 min，弃上清； 17）用适量ddH2O或者TE溶解DNA沉淀，得比较纯净的DNA，测浓度。

琼脂糖凝胶电泳

1) 2)

配制足量的电泳缓冲液（1xTAE 或0.5xTBE）用以灌满电泳槽或配制凝胶； 根据欲分离DNA片段的大小用电泳缓冲液配适宜浓度的琼脂糖溶液：准确称量琼脂糖干粉加到盛好电泳缓冲液的玻璃瓶中； 3) 4)

玻璃瓶松松盖住，沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖溶化；

用隔离手套转移玻璃瓶到55℃箱内后，待溶化的凝胶稍冷却后加入EB，终浓度为0.5 ug/ml,轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液； 5)

琼脂糖冷却时，用一合适的梳子形成加样孔，梳齿的位置应在托盘底面上0.5-1.0 mm,这样琼脂糖浇灌到托盘时将形成符合要求的加样孔； 6) 7) 8) 9)

浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具；

让胶完全凝结，室温下30-45min,小心拔出梳子，将凝胶安放到电泳槽中； 向电泳槽中加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶1 mm；

混合DNA样品和0.2倍体积的6xloading buffer,用微量移液器将样品混合液缓慢加至加样孔中；

10) 1关上电泳槽盖子，接好电极插头，设好电压和时间，按Run键，DNA应

向阳极移动；

11) 当DNA样品或染料在凝胶中迁移了足够距离时，关上电源、拔下插头和打

开电泳槽盖，取出胶放入凝胶成像仪中拍照。

RT-PCR

1)

根据所测的RNA的浓度，计算上样500 ng的RNA样品所需的体积，用DEPC 水补至5 ul，加入1 ul的6xloading buffer进行电泳：120V、15 min。

2) 根据所测的RNA的浓度，计算上样2 ug RNA样品所需的体积，用DEPC

水补至5 ul

随机引物 dNTP RNA 1 ul 4 ul 5 ul

65℃ 5min

5 x buffer Inhibitor RTase DEPC水

30℃ 10min 42℃ 50min 70℃ 15min 4℃ forever

4 ul 0.5 ul 1 ul 4.5 ul

PCR产物胶回收

1)

按照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书步骤，制备含大加样孔的1%琼脂糖凝胶电泳，将PCR产物加入加样孔。 2)

电泳结束后，在320nm波长紫外灯下根据Marker指示快速切取目的片段，用纸巾转移至Ep管，秤取其重量。 3)

加入相应体积的溶胶液Buffer DE-A，水浴锅75℃加热至凝胶完全融化（约6-8min）。 4) 5) 6) 7) 8) 9)

加入Buffer DE-B，混合均匀。

将上步骤的所得液体加入DNA制备管中12,000×g离心1min，弃滤液。 加入500ul Buffer W1，12,000×g离心30s，弃滤液。 加700ul Buffer W2，12,000×g离心30s，弃滤液。

以同样的方法再用700ul Buffer W2洗涤一次，12,000×g离心1min。 将制备管置于洁净的1.5ml离心管，在制备膜中央加25-30ul Eluent Buffer，室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱DNA。

感受态细胞的制备

1. 准备LB培养基和LB平板。

2. 取冻存的Ecoli,37 ℃融解后接种于LB平板上，37 ℃培养16-20h。 3. 在平板上挑取单菌落（2-3mm）,转到含有100mlLB培养基的1L的烧瓶中，37 ℃剧烈振荡培养（250-300r/min）3h。

4. 去1.5mlEp管，加入1mlLB培养基，再加入200ul菌液，37 ℃振荡孵育过夜（300rpm/min）。

5. 在无菌的500ml烧瓶中加入50mlLB培养基，加入0.5-1 ml 培养过夜的的菌液（即稀释50-100倍），然后与37 ℃ 300r/min 振荡孵育OD600=0.6(0.4-0.6)(约2h)。

6. 当菌液密度达到0.6以后，将菌液在冰上放30min.。

7. 将菌液在转入50ml离心管，4 ℃ 2500rpm, 离心20min,弃上清。 8. 将沉淀用25ml预冷的0.1M Cacl2 重悬，按步骤7重复一次，弃去Cacl2 溶液。

9. 用2ml 预冷的0.1M Cacl2 重悬沉淀（轻柔），然后在冰上放置1h.。 10.在重悬的菌液中加入丙三醇（甘油）（15% v/v）(即857ul 50%灭菌甘油)，充分混匀后分装，200ul或100ul每管（1.5mlEp管），-80℃保存。

感受态细菌的转化

1) 2) 3) 4) 5) 6)

-80℃中取出已制备好的感受态菌，冰上放约20 min。 去1 ul质粒加入1个感受态管中，混匀，放冰上约30 min。

将混合液放入已加温至42℃的循环水浴中，90 s（其间，不要摇动管子） 快速转到冰浴中，3 min。

加800 ul不含任何抗生素的培养基于每管，37℃，120 r/min，摇1h。 取100 ul菌涂板于含有相应抗生素的LB培养板上，37℃培养箱中倒置平板培养12-14 h，出现菌落。

SDS碱裂解法制备质粒DNA（小抽）

1)

取1 ml LB培养液加入1个1.5ml的EP管中，挑一个单菌落于该管中，37℃，300r/min，摇过夜，800ul用于提取质粒，200ul保留。 2) 3) 4)

6000 rpm，5min，弃上清。

加入250 ul预冷solutionI/管，充分混匀，重悬细菌。

加入新配制的solutionII 250 ul/管，反复颠倒(轻轻5-10次)混匀5次，以混合内溶物，室温静止3-5 min。 5)

加入350 ul/管的solutionIII，快速反复颠(轻轻5-10次)倒混匀后，冰浴10 min。 6) 7) 8) 9)

12000 rpm，5 min，取上清750 ul转移到新的1.5 ml的EP管中。 加入500 ul(2/3)体积的异丙醇，充分混匀后冰浴5min,沉淀DNA。 12000 rpm，10 min，弃上清。

加入预冷的70%乙醇润洗除盐，12000 rpm，3min，弃上清。

10) 加入10 ul含RNase的TE融解DNA，65℃反应10min(37℃反应1 h) 11) 质粒检测。

中抽质粒

1)

取小抽剩下的200 ul菌液转入50ml的含Amp+的LB培养基中，37℃，300rpm,摇约16h。 2) 3) 4)

6000 rpm，5min,弃上清，收集菌体。 加入2.5ml预冷solutionI/管，重悬菌体。

加入新配制的solutionII 2.5ml /管，反复颠倒混匀5次，以混合内溶物，室温静止3-5min。 5) 6) 7) 8) 9)

加入3.5ml /管的solutionIII，快速反复颠倒混匀后，冰浴10min。 12000rpm,10min,取800ul/管上清于新的1.5 ml的EP管中。 加入2/3体积（533.3ul）的异丙醇，充分混匀后室温放5min。 12000rpm，3min，弃上清。

加入预冷的70%乙醇700ul/管，润洗除盐，12000rpm，10 min，弃上清。

10) 质粒DNA晾干透明后，加入300ul/管含RNase的TE融解DNA（65℃反应

5min）

11) 加入等体积300 ul的（苯酚:氯仿=1:1）剧烈震荡10s，然后4℃，12000rpm，

10min。

12) 吸取上清于另一管中，加入1/10体积的3M NaAC,两倍体积的无水乙醇，

混匀后室温放置3min。

13) 4℃，12000rpm，10min，弃上清，加入预冷的70%乙醇润洗除盐。 14) 加入合适体积的含RNase的TE融解DNA（200ul）。 15) 质粒检测

质粒纯化

1）质粒酶切后加入200 ul ddH2O，然后加入100 ul 酚/氯仿，剧烈震荡混匀； 2) 4℃, 12000 rpm, 15 min；

3)转移上清至一新EP管中，加入1/10体积的3 M NaAC和2倍体积的无水乙醇，充分混匀（直接从大抽质粒纯化时，100 ul质粒（不够，ddH2O补齐）+30 ul 3 M NaAC + 200 ul无水乙醇）； 4) 4℃, 12000 rpm, 10 min；

5)用预冷的75%乙醇洗3次（4℃, 12000 rpm, 5 min每次）；

6)用75%乙醇装满，拿进细胞房，倒掉乙醇，风干5-6 min（不超过10 min，否则难溶）；

7)加入20-40 ul 1xTE buffer（已过滤除菌）充分溶解； 8)测浓度，分装，-20℃保存。

细胞DNA抽提

1) 吸弃去培养液，用PBS洗两次（6孔板中）；

2) 加1 ml细胞裂解液、40 ul 20 mg/ml的蛋白酶K、10ul的10mg/ml的RNaseA，

用封口膜封好，再用保鲜膜包好后，55℃烘箱过夜；

3) 2 ml异丙醇沉淀DNA，摇匀后，用枪将DNA 挑起放入新的1.5 ml EP管中； 4) 75%酒精沉淀两次，12000 rpm，5min，再用100%的酒精洗一次； 5) 晾干后，加入1xTE 100 ul 溶解过夜。

鼠尾中DNA的提取

1) 在含有约0.5 cm 小鼠尾巴的EP管中加入600 ul 50 mM的NaOH； 2) 在金水浴中90-100℃煮1 h；

3) 加入50 ul pH 8.0的Tris/HCl后，颠倒混匀； 4) 12000 rpm，20 min；

5) 取上清500 ul于另一做好标记的管中。

Real-time PCR

1. SYBR检测方法：

（请注意2.5xRealMasterMix和20xSYBR solution避光保存） 1) 20xSYBR solution在室温下平衡并彻底混匀。

2) 将125 ul 20xSYBR solution 加入至1.0 ml 2.5x RealMasterMix中。

（加入20xSYBR solution的2.5xRealMasterMix溶液在-20℃可以保存三个月。在使用前务必彻底混匀RealMasterMix/SYBR solution。如果解冻后并没有使用，一定要注意在再次冷冻前彻底混匀。 反应体系

组成成分 50 ul体系 25 ul体系 11.25 ul 20 ul体系 9 ul 终浓度 1x 2.5xRealMasterMix 22.5 ul /20xSYBR solution 正向引物 反向引物 DNA模板 超纯水

2．PCR检测 反应步骤（建议） 循环 1x 步骤 1 2 35-45x 3 4 至50 ul 至25 ul 至20 ul 100-300nM 100-300nM -ng-pg 温度 94-95℃ 94-95℃ 50-60℃ 68℃ 时间 1-2min 10-20s 10-30s 10-60s 内容 起始模板变性 PCR循环中模板变性 退火 延伸 （解链时间的长短与模板的长度和GC含量有关）

2. 引物稀释：

引物总浓度为1 ?M，体积：200 ?l

ddH2O Primer 1 (20 uM) Primer 2 (20 uM) Total

3. SYBR mixture与template的混合：

SYBR mixture DNA template Total

4. 操作流程：

1）加人10 ul 稀释好的primer至管底

2）加入10 ul SYBR mixture与template的混合物 3）Vortex and Spin down 4）放入仪器检测

5. PCR程序 95℃ 2 min 95℃ 15 s 60℃ 30 s 68℃ 30 s 95℃ 15 s 60℃ 1 min 95℃ 15 s 60℃ 15s **68℃收集荧光

6. 仪器的使用

溶解曲线 40x

40x

9 ul 1 ul 10 ul 180 ul 10 ul 10 ul 200 ul

(1) 建立文件 1）打开7300 software 2）点击Create New document 3）Next 4）Next

5）点击Create New File

6）Add files （e.g. Actin, PDE4DIP）to the right box 7）Next 8）Select wells 9）Finish 10) Name 11) Done (2) 检测

1）打开菜单栏中的Instrument

2）Edit program （将默认program的后两项删除->add step->输入数值->add step…->program输入完成，点击add dissociation stage->下方下拉框中选择Data collection为68℃） 3）Save file至指定文件夹 4）放入样品 5）点击Start

6）程序完成后关闭software和仪器

注意事项：

1）先开仪器，设好program再开始配制试剂 2）使用SYBR mixture一定要先恢复到室温 3）配制试剂尽量避光（超净工作台操作）

4）检测用的PCR管盖不能标记、及用手碰触，带手套操作 5）冰上配制，PCR管先预冷

6）荧光产物很容易污染，不能随便打开盖子，要丢弃指定位置 7）使用无RNA酶的耗材操作

Western blot检测

1) 2)

配制分离胶和浓缩胶；

加样电泳：向凝固好的加样孔中加入等量的蛋白，在电泳槽中进行电泳，采用恒压模式，初始电压为50 V，待样品进入分离胶后电压增至100 V，根据蛋白大小决定电泳时间； 3)

转膜前准备：提前10 min将PVDF膜浸泡在甲醇中，滤膜和海绵浸泡在转膜液中； 4)

转膜：按照以下顺序装配转膜装置：负极→海绵→滤纸→凝胶→PVDF膜→滤纸→海绵→正极，将转膜装置放入电转槽中，将电转槽置于4℃冰箱，40 V恒压12 h (蛋白>250 kDa，50V，16 h)； 5)

封闭：转膜结束后取出PVDF膜，在正面做好标记，将膜置5%脱脂奶粉中室温封闭1-3 h； 6) 7) 8) 9)

一抗孵育：加入稀释好的一抗，室温孵育2-3 h； TBST洗膜 洗3次，15/5/5/5；

二抗孵育：二抗用5%封闭液按1：1000-5000稀释，室温孵育2-3 h； TBST洗膜 洗3次，每次10 min；

10) 曝光显影：将膜蛋白面与荧光混合液充分接触；孵育10 min，使用镊子将

膜轻轻转移到另一保鲜膜上，将残存的底物吸干，包好，放入X-光片夹中固定好，取大小适中的感光片盖在膜上，曝光15 s/1 min/3 min； 11) 定影：将X-光片从光片夹中取出，在显影液中浸泡30s，取出，浸入定影液

中，以胶片透明为止，用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。

显影和定影的具体步骤及注意事项（要点：均匀、快速）: 1) 2) 3) 4) 5) 6)

将底物（Bio-Rad）按1:1混合（1.5 ml + 1.5 ml）；

二抗孵育洗膜后将膜至于面巾纸中，快速轻压一下，取出至于底物混合液中； 将膜快速浸湿其中一面，然后镊子提取翻转，浸湿另一面； 室温避光放置5 min；

将膜取出沾一下面纸以吸走多余底物； 将膜置于保鲜膜上，包好，放置于暗夹中；

7) 8) 9)

暗房中，取出X-光片，抵住暗夹一侧，快速连同暗夹盖子一起合上； 曝光时间结束，将暗夹倒转放置，打开盖子，快速取出X-光片置于显影液中； 均匀充分显影后将X-光片至于定影液中；

10) 定影结束用自来水清洗轻柔漂洗X-光片。

Transfection（Lipofectamine 2000）

1）Seed 8x105 HEK293 cells to 6-well plate and culture overnight;

2) Change medium to pre-warmed Opti-MEM 1 h (or medium with PS 3 h) before transfection;

3) Prepare following solution:

A: 4 ug DNA plasmid + 250 ul Opti-MEM B: 10 ul lipofectamin + 250 ul Opti-MEM Incubate for 5 min at RT;

4) Mix A and B gently, and incubate for 20 min at RT; 5) Add DNA/lipo mixture onto cells;

6) After incubation for 4-6 h, change medium without PS.

划痕实验

1）用marker笔在6孔板背面用尺子比着划5道横线； 2）铺适量细胞于6孔板中；

3）细胞密度达95%用200 ul进口枪头比着直尺划3道垂直直线（贴壁不牢的细胞可改用10 ul的枪头）；

4）PBS洗3遍以去除漂浮细胞；

5）加入1 ml培养基，拍照（取样点为交叉点的上下位置）；

6）加入含10?S培养基继续培养（FBS的量可根据不同细胞调整）； 7）每12 h或24 h拍照。

Transwell assay

1) Cell cultured to 80-90% confluence; 2) Starve the cells overnight (12 h);

3) Equilibrium the transwell insert with medium without FBS at 37℃ for at least 1 h or overnight;

4) Trpsinize the cells and adjust the density to be 1 x106/ml with medium containing 0.1% BSA and no FBS;

5) Add 100 ul cells (1x105) to transwell insert in medium containing 0.1% BSA and no FBS;

6) Add 600 ul medium containing 10% FBS to lower chamber; 7) Incubate for 24 h; 8) Wash the cells with PBS;

9) Fix the cells with pre-chill methanol (-20℃);

10) Stain the cells with 0.5% crystal violet diluted in 20% methanol for 10 min; 11) Wash the inserts with PBS 3x (Plate the insert in wells containing PBS); 12) Carefully remove the cells on upper site of the membrane with cotton sticks; 13) Count the cells under microscopy.

Note: Medium used in this assay without PS!

裸鼠成瘤实验

实验动物：4-5周龄nu /nu裸鼠购于维通利华；裸鼠长至6-8周龄进行肿瘤接种。

所需细胞量：

5 x 106 x 8只x 2=8 x 107 约8个10 cm plates (2倍的细胞量) 细胞处理： 1) 2) 3) 4)

小心吸去培养基，10 ml PBS洗一次；

每个10 cm 盘加入1.5 ml 0.25%的胰蛋白酶消化，RT 5 min； 用新鲜培养基重悬细胞，转至50 ml离心管，800 rpm离心5 min；

吸去培养基，用30 ml PBS重悬细胞，充分吹成单个细胞(先加4 ml PBS吹散细胞，再加26 ml PBS上下颠倒混匀)； 5) 6)

细胞计数，计数完成后算出细胞总量，800 rpm 离心5 min，

用PBS调整细胞密度为为5×107个/ml，吹打成单细胞悬液，细胞放置于冰上(避免冰中有水，快速低温半小时之内接种于裸鼠体内)； 7)

裸鼠接种： 1)

皮下麻醉注射，酒精棉球消毒皮肤，针头刺入，进针4/5，即可注射，注射完成快速抽出针头，镊子轻镊注射口10 s，以防细胞因压力而溢出； 2)

肿瘤的测量: 1)

接种后每天定时观察与记录裸鼠精神、饮食及排便等状况，用电子天平称量裸鼠体重； 2)

用游标卡尺测量移植瘤的最大直径(L)和最小直径(W)，肿瘤体积用公式V = L ×W2×0.5326 计算，从第4天开始测量，之后2天测量一次，同时测量体重； 3)

接种20-28天后，肿瘤体积达1000-1500 mm3，裸鼠处死，取瘤称重，肿瘤放置液氮或-80oC保存。

将细胞接种于裸鼠左臀大肌背侧，100 ?l/只 (即5×106细胞/只)。

裸鼠接种后放回笼子做好标记裸鼠均给予自由饮水、饮食，SPF饲养。

细胞周期实验

1.细胞准备

1）铺3.5x105细胞于6孔板，培养24 h； 2）血清饥饿24 h；

3）用含10?S血清继续培养24 h； 4）加入400 ul Trypsin消化细胞；

5）加入含10?S血清终止消化，1000 rpm，5min； 6）用1 ml PBS重悬细胞，1000 rpm，5min；

7）小心吸走全部PBS，再准确加入1 ml PBS重悬细胞（吹打30下左右）； 8）转移细胞悬液至2.5 ml预冷的无水乙醇中，充分混匀（吹打30下左右）； 9）-20°C固定过夜（我们做到此部；打包好用干冰快递至上海营养所）；

2.染色与检测（上海营养所完成）： 1）1500 rpm，5 min离心收集细胞；

2）用500 ul PI-solution（用PBS将2.5 mg/ml的PI stock solution稀释成50 ug/ml PI-solution工作液）重悬沉淀；

3）加入0.1 mg/ml RNase A和0.05%Tritin X-100，37°C孵育40 min； 4）加入3 ml PBS，1500 rpm，5 min； 5）弃上清，500 ul PBS重悬沉淀并检测。

细胞免疫荧光染色

盖玻片的处理：酒精擦拭干净→2% HCl 12 h→流水冲洗→蒸馏水冲洗3遍→95%酒精→灭菌→烘干

除非特别说明，否则操作均在室温进行： 1) 2)

Place sterilized coverslips into the 6-well plate.

Add 500 μl of the gelatin-coating solution (0.1% in ddH2O) onto the coverslips and incubate for 10 min. 3) 4) 5) 6) 7)

Remove the gelatin-coating solution and air dry the coverslips for 15 min. Wash the coverslips with PBS Plating the cells onto the coverslips. Transect the cells and culture for 24 h-48 h.

Wash the cells with PBS once and fixed them with 1 ml 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS for 20 min. 8) 9)

Wash the cells briefly with ice cold PBS, 3 times.

Block excess aldehyde groups of the cells with 1 ml 0.1 M glycin for 10 min.

10) Wash briefly with PBS, 3 times.

11) Permeablize the cells with 1 ml PBS-0.5% TX-100 for 10 min. 12) Wash 3 times with PBS-0.1% TX-100, 5 min each.

13) Block the cells with 1 ml 2% BSA in PBS-0.1% TX-100 (ABDB) for 10 min. 14) Add 200 ?l diluted primary antibody (0.5-5 ?g/ml) in ABDB and incubate in a

humidified chamber for 1 h at RT or at 4°C overnight. 15) Wash 3 times with PBS-0.1% TX-100, 5 min each.

16) Add 200 ?l diluted secondary antibody (1-5 ?g/ml) in ABDB to the wells and

incubate for 2 h in the dark.

17) Rinse 3 times with PBS-0.1% TX-100, 5 min each.

18) DAPI staining: add 500 μl of the 0.5 μg/ml DAPI solution (碧云天C1002, 1 ul

stock+1 ml ddH2O+9 ml PBS) to each well and incubate for 1 min. 19) Rinse once with PBS and once with water.

20) Carefully take out the coverslips from the wells and blot to remove any excess

water.

21) Give 10 ?l of 抗荧光淬灭封片液(碧云天 P0126) onto the glass slide. 22) Mount the coverslip with the cells facing towards the microscope slide and leave

it overnight at 4°C.

23) Visualize using a fluorescence microscope. Slides can also be stored in a slide

box at < -20 °C for later examination.

免疫组化实验

玻片的处理：洗干净→泡酸→水洗→95%乙醇→烘干→0.05%多聚赖氨酸处理（用10 ul枪头涂片，干了再涂，共3遍） 1）组织福尔马林固定12 h；

2）组织经组织处理机处理过夜（12-13 h）； 3）石蜡包埋；

4）切片机切片（4-6 um）；

5）切片放进50°C水浴，完全伸展后捞片； 6）65°C固定 2 h或55°C过夜；

7）脱蜡：二甲苯I 30 min→二甲苯II 30 min→100%乙醇15 min→95%乙醇→75%乙醇15 min； 8）ddH2O清洗1 min；

9）抗原修复：将切片放入煮沸的枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）10 min，自然冷却到室温（A液：枸橼酸三钠·2H2O 29.41 g + ddH2O 1000 ml；B液：枸橼酸 21g + ddH2O 1000 ml；工作液：A液41 ml + B液 9 ml + ddH2O 450 ml）； 10）ddH2O洗3遍，每次2 min（轻摇）；

11）用纸巾把边缘水分吸干，滴一滴过氧化氢封闭液，封闭5 min（避光）； 12）PBS洗1次，2 min（轻摇）； 13）二抗同源血清封闭20 min（1滴）； 14）一抗（封闭血清稀释），2 h（1滴）； 15）PBS洗2遍，每次2 min（轻摇）； 16）生物素化二抗，30 min（1滴）； 17）PBS洗2遍，每次2 min（轻摇）； 18）加HRP-亲和素，30 min

19）PBS洗2遍，每次2 min（轻摇）；

20) 显色：加反应底物，室温孵育10-30 min至棕色沉淀产生（底物配制：1.6 ddH2O + 5 drop 10x Substrate buffer + 1 drop 50x Peroxidase Substrate）； 21）ddH2O洗1遍，每次2 min（轻摇）； 22）复染：苏木素复染10 s，流水轻柔冲洗;

23）脱水：85%乙醇 15 s→95%乙醇I 15 s→95%乙醇II 15 s→100%乙醇I 5 min→100%乙醇II 5 min→二甲苯I 10 min→二甲苯II 10 min； 24）封片：用中性树脂封片。

石蜡切片的HE染色

1. 组织块浸泡在福尔马林中 12 h (overnight)。 2. 处理机包埋:

提前6 h预热机器，看看程序怎么设置的；脱水后的组织块置于白色小匣子中，标记好，放进机器中进行包埋。

3. 切片机切片(4 ?m)后放入50oC水浴中完全伸展，捞片，65oC固定 2 h 或 55oC 过夜。

注意事项：石蜡块固定好后，在4°C放置一段时间再切片。

4. 脱蜡：二甲苯I，30 min；二甲苯II，30 min；100%乙醇，15 min； 95% 乙醇，15 min；75%乙醇，15 min。 5. ddH2O清洗1 min。

6. 苏木精染色 5 min (在小白盒里，放上架子，放好片子，出水入水时要小心，不要产生大的水花，不能让组织掉下来)。

7. 自来水轻柔冲洗(细流水轻柔冲洗，放好水管的方向，尽量让片子被冲的均匀，10 min)。 8. 95%乙醇5秒。 9. 伊红染色：30 s~2 min。 10. 自来水轻柔冲洗。 11. 用70%乙醇洗涤2次。

12. 脱水： 85%乙醇，15 s；95% 乙醇，30 s；100%乙醇，5 min；100%乙醇，5 min；二甲苯I，10 min；二甲苯II，10 min。 13. 中性树脂（溶于二甲苯的）封片。

BSP and MSP

1． Genomic DNA was isolated from cell lines and primary tissues using a Cell/Tissue DNA

extraction kit (Bioteke, Beijing, China) 。

2． Genomic DNA was modified using EZ DNA methylation-gold kit (ZYMO RESEARCH

CORP, Murphy Ave, USA) following the manufacturer’s directions.

1) Bisul?te modi?cation of genomic DNA was done using primers for BSP and MSP

designed by using the Methyl Primer Express v1.0 software.

2) Primer sequence, annealing temperature, and product size for BSP and MSP assays are

listed in Table 2.The PCR products of BSP were cloned into pMD18-T vector and sequenced.

3) Then results of sequencing were analyzed by Quantification tool for methylation analysis

software.

4) For MSP, the DNA modified by sodium bisul?te was subjected to MSP with primers

speci?cally recognizing the unmethylated or the methylated sequence of RSPO2. Each PCR reaction mix consisted of a total volume of 20 μl

2×GC buffer Taq dNTP (10 mM) bisulfite DNA each primer (10 μM)

The thermo cycler conditions were in general as follows:

94℃ 94℃ specific annealing temperature 72℃ 72℃

3 min 30 sec 45 sec 30 sec 10 min 10 μl 0.5 μl 2 μl 50 ng 1 μl 37 cycles

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/a9g7.html