三个MADS盒基因类似于来自白桦（微生物学鸭蹠草）的APETALA1和FRUITFULL基因 - 图文

本科生毕业设计（外文翻译）

三个MADS盒基因类似于来自白桦（微生物学鸭蹠草）的APETALA1和FRUITFULL基因

Annakaisa Elo*, Juha Lemmetyinen, Marja-Leena Turunen, Liisa Tikka and Tuomas

Sopanenf

芬兰，FIN - 80101约恩苏，约恩苏大学，生物系，邮政信箱111

*通讯作者，电子邮件：annakaisa.elo joensuu.fi 2000年1月24日收到；2000年6月29日修订

尽管在花发育的基因调控方面有了深入的研究但在多年生植物早期阶段的研究仍然很少,例如树。 本研究的目的是确定白桦树(微生物学罗斯鸭蹠草)花序发育初期的基因调控以及解释在白桦单性花序发育中这些基因的表达。 在这里我们描述3个cDNAs克隆和特征来代表MADS-box基因命名为BpMADS3,BpMADS4和BpMADS5,所有属于植物MADS-box基因AP1 / SQUA组。 根据RNA核酸杂交分析，,所有这3个基因在雄性和雌性花序发育过程中都是活跃的。 然而,不同的表达模式表明它们发挥不同的作用。 BpMADS3在序列上与AP1和SQUA最为相似,但它似乎在后期发展阶段具有最高表达量。 BpMADS4在序列上与拟南芥FRUITFULL基因最为相似,但表达在除了花序发育外的芽与根。 BpMADS5与FRUITFULL也相似,其表现似乎在果实发育的花序特殊性与连续性上。在烟草无论BpMADS3,BpMADS4或BpMADS5与CaMV 35 S启动子的异位表达将会引起非常早期的开花。 所有的这些桦木基因似乎都影响早期阶段和生殖过渡期，可能参与确定身份的花序或花分生组织。 他们在各种植物物种中显然能够被用来促进开花的。

前言

早期阶段生殖发育的基因调控已经主要在对拟南芥和金鱼草的研究中阐明（Yanofsky 1995）。在拟南芥中，最早的基因表达于诱导开花后的茎尖分生组织，包括FRUITFULL （FUL,formerly AGL8），和拟南芥的近亲属芥中的SaMADSA ，B和D（Mandel and Yanofsky 1995a, Menzel et al. 1996, Bonhomme et al. 1997）。花序分生组织已经形成后，花的分生组织的形成需要一些基因的参与，如LEAFY (LFY), APETALA1 (AP1) 和CAULIFLOWER (CAL)(Mandel et al. 1992, Weigel et al. 1992,Kempin et al. 1995)。AP1和CAL也和FUL一起在形成花序架构过程中有很多的参与，如FUL，通过调控LFY的表达(Ferrandiz et al. 2000)。这些基因也参与其中，包括在拟南芥中的APETALA2 ， PISTILLATA ， APETALA3和AGAMOUS，无论是直接或间接的激活的同源基因，它们决定花器官的特征（Yanofsky 1995年）。

多数基因调节花发育的早期阶段，包括MADS-BOXS基因家族的成员AP1, CAL and FUL(Yanofsky 1995)。除了高度保守的MADS域含有57个氨基酸外，在一个典型的植物MADS蛋白包含一个I区（30-40个氨基酸），跟随于一个适度保守的K区（约66个氨基酸）和相对较低保守的?末端区域。该MADS域蛋白可作为转录因子激活或抑制其他基因(Schwarz-Sommer et al. 1992, Riechmann and Meyerowitz 1997)。一般来说，植物MADS - box基因可分为几个不同的亚科，

1

本科生毕业设计（外文翻译）

在成花过程中成员有着相似的功能(Purugganan et al. 1995, Thei?en et al. 1996)。

我们已经了对白桦树（微生物学鸭蹠草）成花发育的研究。从系统发育角度，桦木家族在主要双子叶植物核心分支下属于高级金缕梅纲的次级分支(Manos and Steele 1997, Magallo′n et al. 1999)，“高等”金缕梅纲的代表有典型的风媒花和高度退化的花。桦木有雌雄分离的单性花序。雄性花有一个简单的花被和两个雄蕊组成，而雌花则只由一个子房和两个心皮构成(Atkinson 1992, Dahl and Fredrikson 1996)。雄性花序发育在开花之前开始于一年中的早春期，在芬兰，大致出现在盛夏，有2-4mm长(Sarvas 1952)。雌性花序的发育在6月到7月之间；位于芽内越冬，并于5月开花。

我们的目的是了解一些在很多北方区域的经济重要林木白桦花发育的遗传调控的方面。另外一个目的是利用获得的知识研发不开花桦树。因为所有的基因蔓延在自然种群中的后果是难以预测的，所以在它们被测试到在自然中生长之前需要防止转基因树木的开花(Strauss et al. 1995)。论另一方面，加速开花，这将是可取的，例如，加快育种计划。

本研究的目的是在桦树中确定花序和花发育早期阶段的基因调节。我们描述这3个cDNA的克隆与性征，它们都表现出与AP1和FUL的相似性。我们想要找出这些基因是否在雌性和雄性花序中表达，它们什么时候处于活跃以及它们与其他未知的植物MADS-box基因有怎样的联系。我们也希望通过它们在烟草植物中的表达初步探知它们的功能。

材料与方法

植物材料

在用不同发育阶段的几种野生白桦树（微生物学鸭蹠草）雌雄花序或花序（雄）芽。最早的雄性柔荑花序采自六月份的并采2–4毫米长，下一阶段（7毫米）收集在七月而第三阶段（约20毫米）在八月。雄蕊的似乎在花序长7毫米时发育的很好， 并在秋天几乎完全发育完成。处于休眠状态的雄性花序采于一月份。当雄性花序约50毫米长，开花期发生在5月初。在九月收集第一个样品的雌花序，它们处于萌芽状态约4毫米长。在这个阶段，心皮的芽清晰可见。在冬天休眠期间，心皮发育良好，并在春季，心皮增大。休眠期雌花序的样本是在一月采集，接着进一步样品采于它们在四月出芽（长度10毫米），和在5月的开花时期（约20毫米长度）。最后的样本收集于花序发展成种子的六月。营养器官（根、叶及约5毫米的顶芽，有紧密的植物分生组织）分离自长在试管内的约为10厘米长的生长茎。样品进行了液氮冷冻和储存在??-80°C环境中。

RNA的分离和RNA的凝胶印迹分析

用Friemann et al. (1992).的方法分离得到白桦组织的总 RNA。对RNA样品的量和纯度进行分光光度计和凝胶溴化染色电泳进行检测。本样品（10毫克）在甲醛琼脂糖凝胶进行粒度分级电泳，转移到尼龙膜（MSI）并在缓冲液中在42°C下与标记有P32的探针进行杂交（5 SSPE，50%甲酰胺，5????Denhardt 溶液，0.2%十二烷基硫酸钠，100毫克每毫升??1变性脱氧核糖核酸）。然后用0.2SSPE和0.5%十二烷基硫酸钠在65°C清洗。探针基因具有特异性，BpMADS3有480-nt

2

本科生毕业设计（外文翻译）

片段，BpMADS4有290-nt片段和BpMADS5有350-nt片段从cDNA克隆基因的3'端包括部分C区的3'末端和整个3'的非编码区。所有的探针标记使用随机引物标记程序（试剂溴酚蓝，瑞典乌普萨拉）。转基因烟草植物中总RNA的分离使用总RNA提取试剂盒(Qiagen GmbH, Hilden,Germany).。

聚合酶链反应(PCR)扩增

逆转录酶（RT）-聚合酶链反应用于分离部分基因克隆相应的白桦MADS - box基因。用Friemann et al. (1992)的方法从雌性（2–4毫米）和雄性（2–10毫米）花序中分离得到总RNA。第一链cDNA的合成使用第一链合成试剂盒（蛋白质纯化手册生物技术）。部分基因对应到BPMADS3，4

和

5

得到了

RT - PCR

使用部分简并寡核苷酸

MX2U,

5%-GTI(TC)TITG(TC)GA(TC)GCIGA(AG)GT-3%成相应的肽序列到MADS盒肽序列VLCDAE的地区连同寡D（T）（18 - MER）。聚合酶链反应的条件如下：初始变性在96°2分钟，其次是35个周期的94°为1分钟，45℃1分30秒和72℃为1分30秒。最后延伸温度72℃5分钟。所有的PCR反应采用TBR聚合酶(Dynazyme, Finnzymes Inc., Espoo, Finland）。扩增产物克隆入质粒pUC 18载体，并测序。

构建及筛选文库

从雌性柔荑花序开花前（约15毫米长）和早期发育的雌性柔荑花序（2–4毫米长）用poly(A)??RNA分离构建2个cDNA文库。文库的构建ZAPII制成使用基因合成试剂盒（蛋白质纯化手册和生物技术）和GigapackII黄金克隆试剂盒（Stratagene, La Jolla, CA,USA)。用部分cDNA特性反应制成探针用以对上述基因的筛选。显然，全长cDNA克隆对应的BpMADS3和5从成熟雌性柔荑花序的筛选文库中获得而cDNA克隆对应的BpMADS4是从幼嫩雌花序的筛选文库中得到。含有目cDNA的pbluescript质粒基因利用F1辅助噬菌体从噬菌体中被成功分离（Stratagene)。

测序和序列分析

所有测序反应用双脱氧链终止法进行使用T7测序试剂盒（蛋白质纯化手册生物技术）。两股孤立的cDNA单链分别测序。核酸和氨基酸序列分析使用采用图文影像包发布10.0（遗传学电脑集团，公司，麦迪逊，威斯康星州，美国）。序列数据库用来与序列BpMADS3，4和5进行比对。氨基酸和核苷酸序列的比对都由CLUSTAL W程序来完成，清晰精致的视图使得以氨基酸和核苷酸序列能够做很好的分析。距离计算进行了使用Tajima and Nei (1984)的分子进化遗传算法分析软件包版本1.02(Kumar et al. 1994)。距离计算是采用只有第一和二密码子的位置。进化树构建是500个辅助重复实验的结果，使用邻接方法(Saitou 和Nei，1987)与云杉基因DAL 1（tandre等人，1995）和核桃基因PrMADS3（mouradov等人，1998）作为外类群。

烟草转化

cDNA克隆基因在质粒pHTT602中CaMV 35S启动子的控制下包含有BpMADS3，4和5的整个编码区。质粒PHTT602类似于PHTT370 （Elomaa et al. 1993）。除了已经加入npt-II 基因插入

3

本科生毕业设计（外文翻译）

（T. H. Teeri）。嵌合质粒通过三亲交配（Van Haute等人，1983）被转移到含有Ti质粒pgv2260（Deblaere等人，1985）的农杆菌菌株c58（Van Larebeke 等人，1974)中。烟草叶盘（Nicotiana tabacum L. cv. Petit Havana SR1)转化的标准方法（Horsch等人，1985），选择利用卡那霉素进行转基因植物。在标准温室条件下培养转基因植物。

结果

分离及BpMADS3，BpMADS4和BpMADS5序列分析

利用RT - PCR方法，3种来自桦木的不同的MADs-box包含的部分基因克隆进行分离和测序。从2个cDNA筛选文库中获得了相应的全长基因克隆。相互分离的基因克隆代表命名为BpMADS3，BpMADS4和BpMADS5（微生物学鸭蹠草MADS）。3个克隆都含有一个有3'和5'的测区和侧翼ployA尾巴的开放阅读框。所有克隆都有MADs盒的一个ATG密码子近端。核苷酸序列的cDNA克隆有以下的EMBL登录号：BpMADS3, X99653; BpMADS4, X99654; BpMADS5, X99655。在氨基酸水平的序列比较（图1）显示高度的相似性。一致性介于68-72%，相似性为78–79%。所有3个序列与AP1有66-74%的一致性以及77–83%的相似性，与FUL有60–71%一致性69–77%相似性（图1）。在分类学上，桦木属于一个主要rosid分支，但与拟南芥属（十字花科；白花菜目）在不同的亚分支，而例如，烟草和金鱼属于其他双子叶植物的主要分支（magallo等，1999）。在这个条件比较下，桦木和苹果（海棠；蔷薇科）基因被认为有相当高的相似性，BpMADS3与Md

—MADS5相似（85%相似）和BpPMADS5和MdMADS2相似（84%的相似性，如图2所示），两

种物种都属于核心Rosids。

图1 BpMADS3，BpMADS4和BpMADS5与AP1和FUL的同源氨基酸比对图。这比对是使用PILEUP 和PRETTYBOX程序包的图文影像。相同的氨基酸是描为黑色，相似的氨基酸为深灰色，有点相似序列为浅灰色。点表示空白。

4

本科生毕业设计（外文翻译）

图2 不同植物蛋白序列的进化树

建立3个不同桦木基因和来自其他植物物种的已报告基因的相关性，并预测不同桦木基因可能的功能同源性，我们制作了一个属于AP1:SQUA 分支和AP1:AGL9亚家族的序列比对(Purugganan 等，1995）。需要用到整个编码序列。这个比对是用来指导构建进化树的（图2）。

AP1分支包含有像AP1，CAL，FUL等来自拟南芥和SQUA等从金鱼草以及相关其他物种的基因。所有AP1分支的成员 在I区留有61–77个编码一个假定高度保守的共识蛋白序列的SCMEK:RILERYERYSYAE’（图1）。这个序列甚至在AP1和AGL9分支都有很大的不同的，它们都被认为属于MADS - box基因的同一家族（Purugganan等人，1995）。因此，这个模似乎是处于

5

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/a5xd.html