重组E.coli生产类人胶原蛋白发酵调控策略与500L中试规模放大方法优化

西北大学

博士学位论文

重组E.coli生产类人胶原蛋白发酵调控策略与500L中试规模放

大方法优化

姓名：薛文娇

申请学位级别：博士

专业：生物化工

指导教师：范代娣

20090610

西北大学博士学位论文

中文摘要

本研究旨在建立一套完整的重组Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ生产类人胶原蛋白（ｈｕｍａｎ．１ｉｋｅｃｏｌｌａｇｅｎ．ＨＬＣ）的中试规模生产工艺，并通过对各单元操作从实验室规模到中试规模的放大研究，为进一步将该工艺放大到工业生产奠定基础。

重组Ｅｃｏｌｉ的高密度培养是ＨＬＣ生产过程的核心单元，其放大的成功与否直接关系到整个工艺过程。为了明确影响发酵过程的关键因素，从而选择合适的放大准则和方法，本文对发酵过程中二氧化碳和乙酸的影响进行了系统研究。

尽管有大量文献表明，二氧化碳对重组Ｅｃｏｌｉ发酵有负面影响，然而关于二氧化碳对重组Ｅｃｏｌｉ，特别是重组蛋白表达方面的定量研究却未见报道。本研究采用二氧化碳脉冲法首次考察了重组Ｅｃｏｌｉ生长不同阶段二氧化碳浓度对重组蛋白生产的影响。研究结果表明，当在分批培养阶段施加浓度为２０％（ｖ／ｖ）二氧化碳脉冲时，细胞生长明显受到抑制；而在补料阶段引入该脉冲时，却引起了比生长速率的小幅上升；二氧化碳对ＨＬＣ表达的抑制只发生在ＨＬＣ的表达阶段，即在蛋白表达诱导阶段引入浓度为２０％（ｖ／ｖ）二氧化碳脉冲３小时，则最终ＨＬＣ浓度下降３３．９％。尽管二氧化碳脉冲的浓度越高，作用时间越长，其相应的抑制或促进作用也越明显，但当二氧化碳脉冲浓度小于等于１０％时，对发酵过程却几乎没有影响。

然后，针对重组Ｅｃｏｌｉ发酵过程的关键问题一乙酸抑制作了系统研究。研究结果表明，在分批培养阶段乙酸对Ｅｃｏｌｉ细胞有明显的抑制作用，但在补料培养阶段，其影响却并不明显；而乙酸对ＨＬＣ表达的抑制只发生在ＨＬＣ的表达阶段。本文首次建立了这一评价重组Ｅｃｏｌｉ细胞生长不同阶段乙酸影响的方法。而建立该法的理论依据就是在葡萄糖饥饿阶段，重组Ｅｃｏｌｉ细胞可以利用乙酸。为此，本研究也首次讨论了在细胞生长不同阶段，利用葡萄糖饥饿以诱导乙酸吸收对发酵过程的影响。

在发酵放大过程中，合适的种子扩大培养过程的建立对于成功的放大也至关重要。为了建立最优的种子扩大培养过程，本研究考察了三级种子不同移种阶段和不同种子培养基浓度对发酵过程的影响。结果表明：在对数期后期移种，ＨＬＣ产率最高；另外，当种子培养基葡萄糖浓度为２０∥Ｌ时，其后发酵过程所需的培养时间较短，ＨＬＣ表达量较高，ＨＬＣ平均产率最高，达到０．５１８９／Ｌ／ｈ。

由乙酸的相关研究可知，乙酸对本表达体系具有较强的抑制作用，因而本研究建立了以控制乙酸产生为根本目的的溶氧探测补料技术，该技术具有很强的适应性，可在不

中文摘要

同的环境中迅速得到发酵过程的最佳补料方案。采用溶氧探测补料技术，在实验室规模获得的最终细胞干重和ＨＬＣ浓度分别为６９．１９／Ｌ和１３．］ｇ，／Ｌ，该值与以前根据比生长速率优化的结果基本一致。而放大到中试规模时，尽管乙酸浓度和实验室规模基本相同，优化诱导时机后获得的ＨＬＣ表达水平也基本相同，但最终细胞干重和ＨＬＣ浓度有一定程度下降，分别为５１．７９／Ｌ和９．６９／Ｌ。

直接放大后ＨＬＣ产量下降的原因之一可能是不同规模发酵罐氧传递能力不同所致。针对该问题，通过测定不同规模发酵罐的体积氧传递系数，并建立了体积氧传递系数对操作参数（通气量、搅拌速度和装液量）的关联方程，使得不同规模的发酵罐在氧的传递方面具有可比性。实验室小规模发酵罐ｋＬａ值对操作参数的经验关联式为：

（ｋＬａ）Ｌ＝０．０１１１Ｑｎ３１８５ＮＬ５１３１ＶＬ以４８０３

中试规模发酵罐ｋＬａ值对操作参数的经验关联式为：

（ｋＬａ）Ｐ＝０．２６９０Ｑ０．２９８３Ｎ１．２７２７ＶＬｎ枷

最后，根据体积氧传递系数的关联方程，分别以ｋＬａ和ｐ＊ｋＬａ为放大基准进行放大。由于本发酵体系对二氧化碳较不敏感，中试规模（５００Ｌ）中加压操作得到了成功应用。即以ｐ＊ｋＬａ为放大基准进行放大规模的不诱导的分批．补料培养，最终获得的细胞干重为７７．９９／Ｌ，略低于实验室规模培养获得的细胞干重（８０．３９／Ｌ），也低于以ｋＬａ为放大基准获得的中试规模培养的最终细胞干重（９０．ｏｅｃｔ，）。但以ｐ＊ｋＬａ为基准放大，初始装液量（２８５Ｌ）远高于以ｋＬａ为基准放大时的初始装液量（１０５Ｌ）；诱导培养后，最终细胞干重达到６８．４９／Ｌ，最终ＨＬＣ浓度为１３．０９／Ｌ，基本同实验室规模。

此外，本文还建立了ＨＬＣ中试纯化工艺，并对其中影响蛋白收率和蛋白纯度的主要工艺单元：高压匀浆、沉淀、超滤及离子交换层析进行了放大研究。结果表明，高压匀浆不用改变任何操作参数可直接放大；超滤过程仅改变和膜面积相关参数也可得到满意的放大结果；对于沉淀单元，由于搅拌釜装置变化，在中试规模重新优化了沉淀时间：即沉淀７０ｍｉｎ后纯化效果最好；保持线速度恒定进行层析单元的放大也获得了较好结果。中试规模纯化工艺得到ＨＬＣ的纯度为９５．４％，收率为６５．４％，与实验室规模纯化结果相比（ＨＬＣ纯度与收率分别为９６．４％，７１．７％）仅略有下降。

关键词

重组大肠杆菌，类人胶原蛋白，二氧化碳脉冲，乙酸，氧传递，中试放大

英文摘要

髓猃ａｉｍｏｆｔｈｉｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎＷｉｌｌｓｔｏｄｅｖｅｌｏｐａｐｒｏｃｅｓｓｆｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ

ｏｎｈｕｍａｎ－ｌｉｋｅｃｏｌｌａｇｅｎ（ＨＬＣ）ｂｙｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ

ｌａｙａＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｐｉｌｏｔ－ｓｃａｌｅ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅｓｔｕｄｙｗｏｕｌｄｓｏｕｎｄｂａｓｉｓｆｏｒｓｃａｌｉｎｇ－ｕｐｔｏｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｓｃａｌｅｆｕｒｔｈｅｒ，ｔｈｒｏｕｇｈｓｃａｌｅ—ｕｐｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓｆｏｒｕｎｉｔｏｐｅｒａｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓ．

ＨｉｇｈｃｅｌｌｄｅｎｓｉｔｙｃｕｌｔｕｒｅｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＥｃｏｌｉｉｓｔｈｅｋｅｙｕｎｉｔｆｏｒＨＬＣｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｉｔｓｓｃａｌｅ－ｕｐｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｗｏｕｌｄｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｗｈｏｌｅｐｒｏｃｅｓｓｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｔｏｆｉｎｄｔｈｅｋｅｙ

ｃｈｏｓｅｔｈｅｓｃａｌｅ－ｕｐｃｒｉｔｅｒｉａｆａｃｔｏｒｓｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓａｎｄｔｈｕｓ

ａｎｄａｃｅｔａｔｅＯｉｌａｎｄｍｅｔｈｏｄｐｒｏｐｅｄ５ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃａｒｂｏｎｄｉｏｘｉｄｅ

ＣａｒｂｏｎｄｉｏｘｉｄｅｐｌａｙｓａＨＬＣｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｗａｓｓｔｕｄｉｅｄｆｉｒｓｔｌｙ．ｍａｊｏｒｒｏｌｅｉｎｂｏｔｈａｅｒｏｂｉｃａｎｄａｎａｅｒｏｂｉｃｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，

ｃｕｌｔｕｒｅｆｅｗｌｉｔｅｒａｔｕｒｅｓｆｏｃｕｓｅｄｏｎ氇ｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃａｒｂｏｎ

ｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎｄｉｏｘｉ如ｏｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ互ｃｏｌｉａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ａｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓｔｕｄｙｗａｓｉｎｉｔｉａｌｌｙｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｗｉｔｈｔｈｅ

ｍｅｔｈｏｄｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｃａｒｂｏｎｄｉｏｘｉｄｅ

Ｃ０２ｏｎｃａｒｂｏｎｄｉｏｘｉｄｅｐｕｌｓｅｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｆｉｎｊｅｃｆｉｏｎｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ置ｃｏｌｉ．ｍｐｕｌｓｅ蠲ｅｃｔｉｏｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ：

ｌ＿）ａ２０％Ｃ０２ｐｕｌｓｅｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｈｅｂａｔｃｈｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｐｈａｓｅｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈｏｂｖｉｏｕｓｌｙｗｈｉｌｅｔｈａｔｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｈｅｆｅｄ－ｂａｔｃｈｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｐｈａｓｅｓｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈ

ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｏｆＣ０２ｏｎｓｌｉｇｈｔｌｙ；ａｎｄ２）ＨＬＣｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｃｃｕｒｒｅｄｏｎｌｙｉｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｈａｓｅ，ｗｈｅｒｅｔｈｅ

ｂｙ３３。９％ｕｎｄｅｒａｆｉｎａｌＨＬＣｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｄｅｃｒｅａｓｅｄ３－ｈ２０％Ｃ０２ｐｕｌｓｅ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｔｈｅ

ｈｉｇｈｅｒｔｈｅＣ０２ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄ／ｏｒｔｈｅｌｏｎｇｅｒｔｈｅｄｕｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＣ０２ｐｕｌｓｅｓ，ｔｈｅｓｔｒｏｎｇｅｒｔｈｅｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙｏｒｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅＣ０２ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｂｅｌｏｗ

ｈａｄｌｉｔｔｌｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｎｏｒｅｑｕａｌｔｏ１０％ｔｈｅＨＬＣｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．

Ｔｈｅｎ，ａｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓｔｕｄｙｗａｓｃａｒｄｅｄｏｕｔｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｃｅｔａｔｅｏｎｔｈｅｈｉｇｈｃｅｌｌｄｅｎｓｉｔｙｃｕｌｔｕｒｅｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＥｃｏｌｉｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＨＬＣｍＲＮＡ．Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｃｅｔａｔｅａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈａ番ｕｃｏｓｅ

ａｓｔａｒｖａｔｉｏｎｐｅｒｉｏｄａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈｐｈａｓｅｓｗｅｒｅｉｎｉｔｉａｌｌｙｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｉｎｆｅｄ－ｂａｔｃｈｃｕｌｔｕｒｅｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＥｃｏｌｉ。Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ

ｏｎａｃｅｔａｔｅａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｗｉｔｈｏｕｔｎｅｇａｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｓ

ｓｔａｒｖａｔｉｏｎｐｅｒｉｏｄｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｄｕｒｉｎｇａｇｌｕｃｏｓｅｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄａｔａｌｌｄｅｆｉｎｅｄｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈｐｈａｓｅｓｅｘｃｅｐｔｆｏｒｔｈｅｐｏｓｔ－ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｐｈａｓｅ。Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ａｎｅｗｍｅｔｈｏｄｆｏｒｅｖａｌｕａｔｉｎｇｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｃｅｔａｔｅＷａｓｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｂａｓｅｄｏｎｔｈｅａｂｏｖｅｆｉｎｄｉｎｇｓ：ｔｈｅａｃｅｔａｔｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗａｓｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｂｙａｄｄｉｎｇａｃｅｔａｔｅｉｎｔｏｃｕｌｔｕｒｅ

Ｆｉｎａｌｌｙ，ｔｈｅｓｃａｌｅ—ｕｐｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓｂａｓｅｄＯｉｌｋＬａａｎｄｐ＊ｋＬａｗｅｒｅｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｆｏｒｋＬａｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ．ＢｅｃａｕｓｅｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓｙｓｔｅｍｗａｓｌｅｓｓｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｏｔｈｅＣ０２，ｐｒｅｓｓｕｒｉｚｅｄｃｕｌｔｕｒｅｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｆｏｒｔｈｅＨＬＣｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｔｈａｔｉｓ，ｆｏｒｔｈｅｎｏｎ．ｉｎｄｕｃｅｄｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ

ｔｈｅｆｉｎａｌｏｎｔｈｅｐｉｌｏｔ—ｓｃａｌｅｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｃｏｎｓｔａｎｔｐ＊ｋＬａｓｃａｌｅ－ｕｐｃｒｉｔｅｒｉａ，ｏｎＤＣＷ

ａｎｄｗａｓ７７．９ｇ／Ｌ，ｗｈｉｃｈＷａｓｓｉｍｉｌａｒｔｏｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｅｔｈａｔ（８０．３ｇ／Ｌ）ｏｂｔａｉｎｅｄｔｈｅｌａｂ－ｓｃａｌｅｏｎｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｖａｌｕｅ（９０．０ｇ／Ｌ）ｏｂｔａｉｎｅｄｉｎｔｈｅｐｉｌｏｔ－ｓｃａｌｅｂａｓｅｄｔｈｅ

ｃｏｎｓｔａｎｔｋＬａｓｃａｌｅ－ｕｐｃｒｉｔｅｒｉａ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｉｎｉｔｉａｌｍｅｄｉｕｍｖｏｌｕｍｅｆｏｒｔｈｅｆｏｒｍｅｒ（２８５Ｌ）ｗａｓｍｕｃｈｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｅｌａｔｔｅｒ（１０５Ｌ）．ＴｈｅｆｉｎａｌＤＣＷａｎｄＨＬＣｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗｅｒｅ６８．４ｇ／Ｌａｎｄ１３．０ｇ／Ｌｒｅｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｃｈｗｅｒｅｓｉｍｉｌａｒｔｏｔｈｏｓｅｏｂｔａｉｎｅｄｏｎｔｈｅｌａｂ－ｓｃａｌｅ，ｆｏｒｔｈｅｉｎｄｕｃｅｄｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｏｎｔｈｅｐｉｌｏｔ—ｓｃａｌｅ．

ｏｎＴｈｅｐｒｏｃｅｓｓ

ｍａｊｏｒｆｏｒＨＬＣｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｕｎｉｔｓｔｈｅｐｉｌｏｔ－ｓｃａｌｅｗａｓａｌｓｏｄｅｖｅｌｏｐｅｄｉｎｔｈｉｓｒｅｃｏｖｅｒｙａｎｄｓｔｕｄｙ．ＴｈｅｏｐｅｒａｔｉｏｎｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇＨＬＣｐｕｒｉｔｙｗｅｒｅｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ，ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎａｎｄＣＭ５２ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｔｈｅｓｃａｌｅ—ｕｐｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓｈｏｗｅｄ

ｌａｒｇｅｒｓｃａｌｅｆｏｒｔｈｅ

ａｒｅａｔｈａｔ，１）ｔｈｅｏｐｅｒａｔｉｏｎｐａｒａｍｅｔｅｒｓｃｏｕｌｄｂｅｄｉｒｅｃｔｌｙｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｔｏｔｈｅｍｅｍｂｒａｎｅｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ；２）ｔｈｅ

ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌｌｙｆｏｒｏｐｅｒａｔｉｏｎｐａｒａｍｅｔｅｒｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｗｅｒｅ，ｉｎｃｒｅａｓｅｄｗａｓｓｃａｌｉｎｇ—ＵＰｔｈｅｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ；３）ｔｈｅｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｔｉｍｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄ

ｔｈａｎｔｈａｔｏｎｔｈｅｐｉｌｏｔ－ｓｃａｌｅａｎｄｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｗ．ａｓ７０ｍｉｎ，ｗｈｉｃｈｉｓｌｉｔｔｌｅｈｉｇｈｅｒｔｈｅｌａｂ－ｓｃａｌｅ；４）ＣＭ５２ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｓｃａｌｉｎｇ—ｕｐｂａｓｅｄｏｎｏｎｃｏｎｓｔａｎｔｌｉｎｅａｒｖｅｌｏｃｉｔｙｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ．ＴｈｅｐｕｒｉｔｙａｎｄｒｅｃｏｖｅｒｙｏｆＨＬＣｒｅａｃｈｅｄ９５．４％，６５．４％，ｒｅｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｃｈｗｅｒｅｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｌｉｇｈｔｌｙｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｔｈｏｓｅ（ｔｈｅｐｕｔｉｔｙａｎｄｒｅｃｏｖｅｒｙｗｅｒｅ９６．４％，７１．７％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）ｏｂｔａｉｎｅｄｏｎｔｈｅｌａｂ—ｓｃａｌｅ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ

ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＥｃｏｌｉ，ｈｕｍａｎ—ｌｉｋｅｃｏｌｌａｇｅｎ，Ｃ０２ｐｕｌｓｅ，ａｃｅｔａｔｅ，ｏｘｙｇｅｎｔｒａｎｓｆｅｒ，ｓｃａｌｅ－ｕｐ

英文摘要

ｍｅｄｉａａｎｄ／ｏｒｅｍｐｌｏｙｅｄａｇｌｕｃｏｓｅｓｔａｒｖａｔｉｏｎａｎｄｔｈｕｓｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｃｅｔａｔｅａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｅｌｌ

ｏｎｇｒｏｗｔｈｐｈａｓｅｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｔｈａｔｏｂｖｉｏｕｓａｃｅｔａｔｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ

ｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈｏｃｃｕｒｒｅｄｉｎｔｈｅｐｈａｓｅｓｏｆｂａｔｃｈｃｕｌｔｕｒｅｗｈｉｌｅｉｔｓｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｏｎＨＬＣｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｃｃｕｒｒｅｄｏｎｌｙｉｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｈａｓｅ．

Ｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｓｕｉｔａｂｌｅｉｎｏｃｕｌｕｍｉｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ．Ｔｏｏｐｔｉｍｉｚｅｔｈｅｉｎｏｃｕｌｕｍｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ，ｔｈｅｔｈｉｒｄｉｎｏｃｕｌｕｍｔｒａｎｓｆｅｒｓｔａｇｅａｎｄｍｅｄｉｕｍｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｔｈｅ

ＷａｓｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＨＬＣｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙＷａｓｈｉｇｈｅｓｔｗｈｅｎｔｈｅⅡｌｉｒｄａｔｌａｔｅｌｙｅｘｐｏｎｅｎｔｉＭｉｎｏｃｕｌｕｍｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｓｔａｇｅ；ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｗｈｅｎｔｈｅｇｌｕｃｏｓｅ

ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎＷａｓ２０ｇ／Ｌ，ｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｉｍｅＷａｓｓｈｏｒｔｅｓｔａｎｄｔｈｅｆｉｎａｌＨＬＣｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ

０．５１８ｗａｓｈｉｇｈｅｓｔ，ａｎｄｔｈｕｓｔｈｅＨＬＣａｖｅｒａｇｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｈｉｇｈｅｓｔ（ａｃｈｉｅｖｅｄｇ／Ｌ／ｈ）．

ａＡｃｅｔａｔｅｈａｄ

ＳＯａｓｔｒｏｎｇｎｅｇａｔｉｖｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｎｔｈｅＨＬＣｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｉｓｗｏｒｋ，ｔｏｃｏｎｔｒｏｌｆｅｅｄ－ｂａｃｋ

ａｃｅｔａｔｅｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｍｅｔｈｏｄｔｈａｔｔｈｅｐｒｏｂｉｎｇｆｅｅｄｉｎｇｓｔｒａｔｅｇｙＷａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄＷａｓｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄ

ｏｎｅｍｐｌｏｙｅｄｔｏｍａｉｎｔａｉｎｄｉｓｓｏｌｖｅｄｏｘｙｇｅｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｔｔｈｅｓａｍｅｌｅｖｅｌ

ｆｉｎａｌｂｏｔｈｌａｂｏｒａｔｏｒｙｓｃａｌｅａｎｄｐｉｌｏｔｓｃａｌｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ．ＴｈｅｏｎＤＣＷｏｆ６９．１ｇ／ＬａｎｄＨＬＣｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ１３．１ｇ／Ｌｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ

ｒｅｓｕｌｔｓａｒｅｔｈｅｌａｂｏｒａｔｏｒｙｆｉｎａｌｓｃａｌｅ．ａｎｄｔｈｅ

５１．７ｇ／Ｌｓｉｍｉｌａｒｔｏｔｈａｔｏｐｔｉｍｉｚｅｄｉｎｔｈｅｐｒｅｖｉｏｕｓｏｆ９．６ｇ／Ｌｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｓｔｕｄｙ．ＴｈｅｏｎＤＣＷｏｆａｎｄＨＬＣｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｔｈｅｐｉｌｏｔ－ｓｃａｌｅｕｐｏｎｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｉｎｄｕｃｔｉｏｎｔｉｍｉｎｇ．

ＴｈｅｒｅａｓｏｎｆｏｒｔｈｅｄｅｃｒｅａｓｅｉｎｔｈｅＨＬＣｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｎｔｈｅｐｉｌｏｔｓｃａｌｅｍａｙｂｅｔｈｅｌｏｗｅｒ

ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃｍａｓｓｔｒａｎｓｆｅｒｏｘｙｇｅｎｔｒａｎｓｆｅｒｒａｔｅｆｏｒｔｈｅｐｉｌｏｔ ｓｃａｌｅ

ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｋＬａ

ｋＬａｏｎｆｅｒｍｅｎｔｏｒ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｃａｌｅｆｅｒｍｅｎｔｏｒｓｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄａｎｄｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｒａｔｅａｎｄｏｐｅｒａｔｉｏｎｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（ａｅｒａｔｉｏｎ，ｓｔｉｒｒｅｒ

ｏｘｙｇｅｎｔｒａｎｓｆｅｒａｎｄｉｎｉｔｉａｌｍｅｄｉｕｍｖｏｌｕｍｅ）ｗｅｒｅｃｏｕｌｄｂｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄ．Ａｎｄｔｈｕｓｔｈｅｃａｐａｃｉｔｉｅｓｆｏｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｅｒｍｅｎｔｏｒｓ

ｃｏｍｐａｒｅｄ．ＴｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｆｏｒｋＬａｏｎｔｈｅｌａｂ－ｓｃａｌｅｆｅｒｍｅｎｔｏｒｉＳ，

（ｋＬａ）Ｌ＝０．ＯｌｌｌＱ０．３１８５Ｎ１’５”１ＶＬｎ４舳３

ＡｎｄｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｆｏｒｋＬａｏｎｔｈｅｐｉｌｏｔ－ｓｃａｌｅｆｅｒｍｅｎｔｏｒｉｓ，（ｋＬａ）Ｐ＝０．２６９０Ｑ０．２９Ｓ３Ｎ他７２７ＶＬｍ４０４

西北大学学位论文知识产权声明书

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学位论文作者签名：簦玺蝰学位论文作者签名：藿立酶１指导教师签名：ｉ墨丛翌翌ｉ竺笪：墅：型指导教师签名：

）矿矿７）年多月，矿日≥口∥尹年多月，口日

西北大学学位论文独创性声明

本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢二ｆ巴思。

学位论文作者签名：薛文畸≥口ｏ＇年参只汨日

西北犬学博士学位论文

第一章文献综述

｛。｛生物产品生产过程放大

生物产ｌｉｉｌ是指在生产过程的篥一阶段，应用生纯反应制得的产品。它包括传统的生物技术产品（如用发酵生产的有机溶剂、氨基酸、有机酸及抗生素等）和现代生物技术产品（如用重组ＤＮＡ技术生产的医疗性多肽和蛋白质）［严希康２００１］。其中，由重组微生物培养获得的生物分子近年来由于在安全性、选择性、质量和均一性等方面的技术进步，其应用范围迅速扩大。

用于制造生物产品的大部分细胞培养都采用重组细胞，特别是重组层ｃｏｌｉ和重组酵母，这些体系经过优化，可以高产量生产复杂的蛋自质，而且相对易于放大。其他表达系统如昆虫细胞、植物细胞以及转基因动物和植物尽前正在进行峻床前评价及临床试验阶段［Ｌｅｖｉｎｅｌａ１．２００１］。

显然，生物产懿生产过程放大的主要原因就是满足市场需求。通常，当一个生物制品作早期评估时，就会生产小批燕的产鼯。当开始进入试用阶段时，需要有更多的产品，因而就会扩大规模增加产量或／和优化过程提高产率［Ｌｅｖｉｎｅｔａ１．２００１３。

除了基本的工程设计原则，生物技术产物的放大需要对影响细胞生理、产物的生物物理和生物化学特性的细胞学机制和调节机制有着深入的理解。成功地将一个过程从开发过程转移到生产过程，对过程操作和过程限制因素的深入完全的理解是必要的。对于重组产品的生产过程来说，细胞培养过程是其核心单元，细胞培养过程放大是否成功直接关系到产晶的质量与成本。因戴，对细胞培养过程盼深入理解对于反馥器豹成功放大至关重要。

１．２重组￡ｃｏｌｉ高密度发酵

最ｃｏｌｉ是第一个被用于工业生物技术的生产菌，由于其生产成本低，Ｅｃｏｌｉ仍然被广泛用于工业生物技术［Ｍｅｙｅｔａｌ．２００７］。利用鼠ｃｏｌｉ生产的重组蛋白大多数是胞内表达的，因此，产物产率和最终细胞密度以及比产率（即单位时间单位细胞质量形成的产物的量）成正比［Ｌｅｅ１９９６３。增加产物产率，曼｜】提高最终细胞密度和重组蛋自比产率，可使产物生产成本降低。Ｅｃｏｌｉ高密度培养技术不仅可提高产率，还有如下优点：降低培养体积；提升下游操作效率：降低废水等的排放；生产成本较低以及设备投入成本较低

第一章文献综述

等［Ｌｅｅ１９９６］。

大多数Ｅｃｏｉｌ重组过程都采用分批．补料培养模式来达到高密度培养［Ｌｉｎ２０００］。分批．补料培养，就是在培养过程中补加限制性的营养物质，以控制生长条件，如代谢溢出、有毒代谢产物的积累以及氧的可获得性。原则上，分批．补料过程是一个分批过程，但过程中补加浓缩底物，而这种浓缩的底物通常是葡萄糖。当分批阶段初始葡萄糖被消耗完时，接下来过程的第二个阶段就是将营养物连续补入反应器中，并使补加的量很低，以控制生长速率，从而控制细胞的生长状态。

通过分批．补料发酵，重组Ｅｃｏｌｉ细胞密度一般可达到５０到１００９／Ｌ细胞干重［Ｌｅｅ１９９６；Ｒｉｅｓｅｎｂｅｒｇ１９９９］，Ｈｕ等［２００３］采用ｐＨ—ｓｔａｔ反馈控制最终细胞密度达到１８３９／Ｌ。

ｅｔ使用渗析反应器，重组Ｅｃｏｌｉ细胞密度可达到１９０９／Ｌ［Ｎａｋａｎｏ

理论最高细胞密度（～２００９／Ｌ）［Ｌｅｅ１９９６］。

１．２．１乙酸对重组￡ｃｏｌｉ高密度发酵的影响ａ１．１９９７］，该值已接近

Ｅｃｏｌｉ高密度发酵生产重组蛋白过程最大的问题就是乙酸的生成［Ｌｅｅ１９９６；Ｅｉｔｅｍａｎ＆Ａｌｔｍａｎ２００６；Ｍｅｙｅｔａ１．２００７］。乙酸浓度高于１．０到１．Ｓｇ／Ｌ时，不仅抑制细胞的生长，

ｅｔａ１．１９８８；Ｊｅｎｓｅｎ＆Ｃａｒｌｓｅｎ１９９０；Ｌｕｌｉ＆Ｓｔｒｏｈｌ１９９０；而且抑制重组蛋白的表达［Ｓｈｉｍｉｚｕ

Ｓａｎｅｔａ１．１９９４】。此外，乙酸的产生也代表了碳源的分流，即使得细胞及重组蛋白的得率

ｅｔ降低［Ｍｅｙａ１．２００７］。

乙酸在中性ｐＨ环境中以离子化（ＣＨ３ＣＯＯ‘）和质子化（ＣＨ３ＣＯＯＨ）两种形式存在。当这种亲脂性的弱酸为非解离形式时，可以穿过细胞质膜进入细胞内，使膜两侧的ｐＨ梯度失去偶联。一旦穿过膜，在细胞内（ｐＨ７．５）它就解离为一个质子（ｉ－Ｉ＋）和一个阴离子（ＣＨ３Ｃ００’）。这个质子可酸化细胞质，这样就降低了膜内的ｐＨ值，使膜内外的ｐＨ差（Ａｐｎ）减小，减弱了质子推动力，从而干扰ＡＴＰ的生成；而阴离子增加了细胞内部渗透压并干扰甲硫氨酸的合成［Ｗｏｌｆｅ２００５］。应该注意到，培养时ｐＨ越低，乙酸未解离形式含量越高，乙酸抑制作用就越强［吴军等１９９６；周涟等２００３］。

此外，研究表明，乙酸影响数种蛋白和基因，特别是那些涉及Ｅｃｏｌｉ转录及翻译机制、一般应激反应和调节的蛋白和基因［Ｅｉｔｅｍａｎ＆Ａｌｔｍａｎ２００６］。而且，乙酸对产重组蛋白的细胞抑制作用比对野生型的细胞抑制作用更强［Ｋｏｈｅｔａｌ．１９９２］，同时细胞诱导表达蛋白后产生乙酸的临界比生长速率更低［Ａｋｅｓｓｏｎ

Ｅｃｏｌｉ培养体系中达到高细胞密度非常重要。ｅｔａ１．１９９９］。因此，乙酸的控制对于。

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１．２．２重组Ｅｃｏｌ，高密度发酵过程乙酸的控制

近年来，为了控制Ｅｃｏｌｉ高密度发酵过程中乙酸的形成，并最终提升目标蛋白的产量，在过程控制及基因修饰方面做了大量的研究［Ｅｉｔｅｍａｎ＆Ａｌｔｍａｎ２００６；Ｍｅｙｅｔａ１．２００７】。过程控制优化方法涉及到抑制或降低乙酸的培养基的设计和培养条件的优化。而基因工程的方法是通过改变微生物自身的基因以减少乙酸的生化合成。

乙酸形成的速率与细胞生长的速率及细胞消耗葡萄糖的速率直接相关。在分批．补料过程常见的操作模式中，培养物的生长速率由限制性底物的补料速率决定。具体来讲，当细胞生长超过葡萄糖的比消耗速率时，Ｅｃｏｌｉ培养物就会产生乙酸，而不管培养中供氧情况如何：当葡萄糖为限制性底物时，产物得率与比生长速率直接相关，细胞生长速率超过临界生长速率时，Ｅｃｏｌｉ产生乙酸（图１．１）。

，图１．１

Ｆｉｇ．１－１葡萄糖为限制性底物比生长速率、乙酸形成速率、比氧吸收速率的关系

ｔｈｅＲｅｌａｔｉｏｎｓｂｅｔｗｅｅｎｓｐｅｃｉｆｉｃｇｒｏｗｔｈｒａｔｅ．ｓｐｅｃｉｆｉｃｏｘｙｇｅｎｕｐｔａｋｅｒａｔｅａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃａｃｅｔａｔｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｒａｔｅ，ｕｓｉｎｇｇｌｕｃｏｓｅａｓｌｉｍｉｔｉｎｇｎｕｔｒｉｅｎｔ－［Ｅｉｔｅｍａｎ＆Ａｌｔｍａｎ２００６】

另一方面，乙酸生成与氧的消耗速率直接相关，与细胞可得到的氧的多少并无关系。也就是说，不管生物反应器的供氧多快，Ｅｃｏｌｉ消耗氧的能力有限。该氧消耗的极值对应于乙酸开始生成的细胞生长速率（图ｌ一１）。这样，大多数过程设计或基因修饰以最终降低甚至完全抑制乙酸分泌的目标就是让细胞生长速率和氧的消耗速率达到一个更好的平衡。

１．２．２．１培养基成分和配比的选择

培养基的组成对培养过程及乙酸形成影响很大。葡萄糖会引起乙酸生成，而用甘露糖和果糖代替葡萄糖可降低乙酸积累量。例如，有报道在分批培养采用果糖取代葡萄糖作为碳源，可有效降低乙酸生成量，蛋白产量增加６５％［Ａｒｉｓｔｉｄｏｕ

ｅｔａ１．１９９９］。而文献中

第一章文献综述

关于复合培养基对发酵过程乙酸形成的影响却相当复杂，研究使用的培养体系不同其结果也大不相同。有报道补入酵母粉或甲硫氨酸会减少乙酸的形成，同时提出酵母粉减低葡萄糖比摄取速率，但不影响呼吸活性；甲硫氨酸不干扰葡萄糖比摄取速率，但增强了呼吸活性。酵母粉含有大量游离氨基酸，因而减少合成代谢需求量，其表现结果是减少葡萄糖比摄取速率；加入甲硫氨酸能扩大氧化代谢的最大容量，从而增加呼吸活性【冯尔玲于公义１９９５］。最近的一项研究也指出，利用包含氨基酸的葡萄糖脉冲补料可有效防止乙酸高速形成［Ｚａｗａｄａ＆Ｓｗａｒｔｚ２００５］。但Ｍｅｙｅｒ等人的研究却表明在合成培养基中大肠杆菌比生长速率＞ｏ．３５ｈｑ，在复合培养基中炉０．２ｈ。时，培养基中就可以测到乙酸，且乙酸的产生随“增加呈指数增加，同时菌体得率下降［冯尔玲于公义１９９５，Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅｔａ１．２００２］。Ｇｅｏｒｇｅ等人［１９９２］也证明了重组大肠杆菌删１０９的产酸量在合成培养基中显著低于复合培养基，但其表达产物ＴＧＦ。ＰＥ４０融合蛋白的表达水平却在复合培养基中更高，表明复合培养基对ＴＧＦ—ＰＥ４０表达起到了“缓冲作用”，复合培养基不能减少培养基中乙酸积累，而是缓减了乙酸对目的产物表达的负效应。

与葡萄糖培养基相比，在分批．补料培养中采用甘油培养基培养ＥｃＤ矗，尽管最大比生长速率会降低，但乙酸生成量也会降低，从而可增加重组蛋白形成［张彩等２００７］。由于近来甘油成本急剧降低，对于Ｅｃｏｌｉ发酵过程，将甘油作为碳源与葡萄糖相比变得更有竞争力。然而，培养基组成的改变往往会增加成本，并对下游纯化过程产生影响［Ｅｉｔｍａｎ＆Ａｌｔｍａｎ２００６］。

１．２．２．２降低乙酸生成的补料策略．

（１）非反馈补料控制乙酸生成

在重组工程菌高密度发酵培养过程中，乙酸的产量随比生长速率增加而增加。因此，为了防止重组工程菌高密度培养过程中代谢副产物乙酸大量积累，常常通过流加葡萄糖以控制细胞的比生长速率较低，最终达到控制乙酸形成的目的。

常用的非反馈流加补料模式有三种：恒速流加补料、变速流加补料和指数流加补料［Ｌｅｅ１９９６］。在恒速流加补料培养中，发酵液体积呈线性增长。而作为限制性基质的葡萄糖是以恒定的速率流加，因此相对于发酵罐中的菌体来说，营养物的供应是逐渐降低的，菌体的比生长速率也慢慢下降，但总的菌体量在培养过程中是线性增加的。变速流加补料可以在菌体密度较高的情况下通过加入更多的营养物质促进细胞的生长，并对产物的表达有利。指数流加补料培养可使细菌以一恒定的比生长速率生长，并且能使所控制的比生长速率低于乙酸产生的临界比生长速率，从而可以避免乙酸的产生。若细胞对

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底物的得率系数维持不变，那么根据物料衡算可以求出补料速率方程：

Ｆｓ（ｔ）篇ｌ告＋ｍｌＸ（ｔｏ）Ｖ（ｔｏ妒飞）＼‘Ｘ／Ｓ／

其中糕是碳源的质量流加速率，／２是预先设定的比生长速率，ＹＸ，。是细菌对碳源的得率系数，ｍ是细菌的维持系数，Ｘ是细菌浓度，Ｖ是发酵液体积，ｔ。是补料开始时刻。指数流加补料技术是一个简单而又有效的补料技术，已被广泛地应用于大肠杆菌的高密度培养过程中［Ｌｅｅ１９９６】。

～般，重组分批．补料过程多数都按照至少两个不同的补料策略依次进行［Ｋｒ差ｍｅｒ，１９９６］。多数碳源限制的用于重组蛋白生产的分批．补料过程都是对浓缩的料液采用预定的补料速率限制生长。这种料液补加可以采用指数型补料［Ｈａｒｄｅｒｅｔ

ｃｔａ１．１９９４；Ｒｉｅｓｅｎｂｅｒｇａ１．１９９０，１９９１］，也可以采取步进的补料方式［Ｆｉｅｓｃｈｋｏ＆Ｒｉｔｃｈ１９８６；Ｌｅｅｅｔａｌ。１９８９］，以维持一个特定的生长速率。如果补料增加到这样一个水平，即在最大通气速率和搅拌速率下，ＤＯ下降到允许的最低ＤＯ水平时，补料速率转向恒定。考虑到细胞的生产能力，诱导前的泌生长速率速率应维持在０．１至）Ｊ０．２之闻［Ｈｅｌｌｍｕｔｈ

１９９３］。诱导后，也许需要再次改变补料策略。ｅｔａ１．１９９４；Ｆｌｉｃｋｉｎｇｅｒ＆Ｒｏｕｓｅ

（２）反馈补料控制乙酸生成

在分批辞｜、料过程中，溶氧和ｐＨ的改变容易被在线检测，因此被广泛雳于反馈补料，以控制乙酸生成。

ｐＨ恒定控制法（ｐＨ—ｓｔａｔ）：ｐＨ恒定控制法；躺ｐＨＪ２升时开始补加营养物质［蒙健宗等２００６；Ｈｕｅｔａ１．２００４］。大肠杆菌代谢葡萄糖产生的有机酸、Ｃ０２将导致ｐＨ的降低，医此ｐＨ的下降在一定程度上反映了菌体消耗葡莓糖的快慢；当培养基中的葡萄糖耗尽时，ｐＨ值上升，这可能是葡萄糖降解后，细菌以氨基酸为碳源和能源进行分解代谢，并以氨形式释放氨基氮所致。另外，乙酸的再利用也导致ｐＨ回升。故可以通过ｐＨ变化控制、调节誊｝糖速率｝冯尔玲予公义１９９５］。

该法趋向于保守，它使生长速度远远低于乙酸产生的临界比生长速率［Ｅｉｔｍａｎ＆Ａｌｔｍａｎ２００６］。对标准ｐＨ恒定控制法的一个改进就是脉冲补加更多的营养物。在这种方式下，培养过程经过一个震荡性更强的盛宴然后饥饿的生长，而这种生长皇身可降低培养液中乙酸的积累量［Ｎｅｕｂａｕｅｒｅｔａ１．１９９５１。而且，这种周期性的变化可以增加质粒的稳定性，并以其他综合的方式（依赖于其变化频率），影响熏组蛋白生产［Ｌｉｎ＆Ｎｅｕｂａｕｅｒ

第一章文献综述

２０００］。ｐＨ恒定控制法的本质的缺陷在于它检测到的是细胞的饥饿状态，而不是直接检测乙酸的生成［Ｅｉｔｍａｎ＆Ａｌｔｍａｎ２００６］。

溶氧恒定控制法（ＤＯ．ｓｔａｒ）：高补糖速率不是产生乙酸的唯一原因，供氧不足也会发生此现象，缺氧可迫使糖进入混合酸发酵途径［Ｘｕｅｔａ１．１９９９］。因此如发酵过程中供氧能力成为限制因素，以溶氧浓度作为控制参数以确保溶氧不成为限制因素，即保证设备的供氧能力大于摄氧能力［冯尔玲于公义１９９５１。

菌体利用营养物生长代谢时，会消耗氧气，当耗氧速率大于反应器的供氧速率时，发酵液中溶氧会下降。反之亦然。因此，溶氧的变化间接反映了细菌生长的旺盛程度。当葡萄糖浓度降低到一定程度时，茵体代谢强度下降，所消耗氧气的量下降，在反应器供氧水平不变时反映为溶氧的上升，因此根据溶氧曲线补加葡萄糖，保持溶氧恒定，可以使葡萄糖浓度控制在较低的水平［李民等１９９８；郑志勇２００４；沈林南等１９９９；Ｃａｓｔａｎ＆Ｅｎｆｏｒｓ２０００］。

在化学合成培养基中，恒溶氧法对葡萄糖耗尽的响应比恒ｐＨ法灵敏，但在天然培养基中（如添加酵母抽提物、蛋白胨时），当碳源耗尽时，溶氧值的变化并不明显，这是由于细胞在继续利用其它底物，因此对于半合成或天然培养基，ｐＨ—ｓｔａｔ法ＬＩ＇，ＤＯ—ｓｔａｔ法更为合适［Ｌｅｅ１９９６】。

溶氧探测补料法：采用脉冲补糖并监测溶氧对于这些脉冲的响应来确定补料速率［Ａｋｅｓｓｏｎｅｔａ１．１９９９，２００１；Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅｔａ１．２００２，２００３］。由于该法不受菌株和发酵过程中代谢变化的影响，因而被认为是最有前途的补料方式［Ｅｉｔｍａｎ＆Ａｌｔｍａｎ２００６］。其理论基础是，比氧吸收速率的最大值刚好对应于乙酸产生的临界比生长速率［图１．１］，因而，溶氧对脉冲补料做出反应的变化表明过程在低于临界比生长速率下操作，而溶氧对脉冲补料无反应，则表明过程在高于临界比生长速率下操作。

溶氧探测补料技术在很多重组体系的分批．补料培养中都得到了成功应用［Ａｋｅｓｓｏｎｅｔａ１．１９９９，２００１；Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅｔａ１．２００２，２００３；Ｖｅｌｕｔｅｔａ１．２００６；郑志勇姚善泾２００６；廖鲜艳等２００７】。该法最大的优点是可以很快找到培养体系的最佳补料速率，从而大大降低优化补料的实验量。

１．２．２．３透析培养

除以上培养基及补料策略方面，还可以通过在发酵过程中从发酵液中移除乙酸降低乙酸抑制作用，该法的优点是不需要降低细胞的比生长速率。其中，采用透析过程移除生长抑制代谢物已被成功用于糖浓度恒定的重组蛋白的高密度发酵［Ｎａｋａｎｏｅｔ

ａ１．１９９７；

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Ｆｕｃｈｓｅｔａ１．２００２；杜鹏等２０００１。透析过程是基于浓度梯度，不网的溶质分子由于其不同的扩散行为通过半透膜而达到分离的目的。类似的，乙酸也可被大孔离子交换树脂从发酵液孛移除［Ｃｈｅｎｅｔａ１．２００５］。然丽，透析培养移除乙酸阂时趋内子移除细胞生长掰必须的营养物质，而且，不能改善碳源分流向乙酸的问题。

除以上过程方面降低乙酸生成的方法外，还有很多策略如：①选择低乙酸积累的生产菌株［ＶａｎＤｅＷａｌｌｅ＆Ｓｈｉｌｏａｃｈ１９９８；李志敏叶勤２００２］；②构建降低乙酸生产的变异

ｅｔ菌株，如ｐｔａ－和ａｅｋ一变异株［Ｓａｎａｌ。１９９４；Ｍｅｙｅｔａｌ。２００７］；③通过共表达血红蛋白来增

ｅｔ加细胞的呼吸活力来降低乙酸，同时提高ＡＴＰ产率［Ｋａｌｌｉｏａ１．１９９４］。其中，利用代谢

工程的方法构建降低乙酸生成的变异蘸株，西取得了重大进展，被认为可从根本上解决乙酸闯题［Ｍｅｙｅｔａｌ．２００７］。然藤，对于已有的发酵体系，采用过程控制的方法更容易达到目标。

１．３重组￡ｃ口／，高密度发酵的放大

生物过程开发的三个主要规模为：实验室规模、中试规模和生产规模。也有研究者将摇瓶培养也作为一个规模［Ｊｕｎｋｅｒ２００４；范代娣２０００］。一旦成功完成一个特定的生物过程豹实验室规模实验，就可以知道或可以测定其操｛董变量和物理特性，然后就可以逐步放大反应器规模［Ｇａｒｅｉａ．Ｏｃｈｏａ＆Ｇｏｍｅｚ２００９］。对于生物过程来说，放大的典型比例为ｌ：１０，可放大至１００，０００Ｌ，但是为了保证放大效果，降低放大操作不可预料的风险，ｌ：５的放大毙饲也经常使用。对予重组ＤＮＡ产品，生产规模～般最高为１０，０００Ｌ，该规模对于传统产品的发酵过程往往属于中试规模［Ｊｕｎｋｅｒ２００４１。

２０世纪４０年代初，在青霉索的生产中，发酵过程的放大作为中心问题首次被提出

【Ｓｃｈｍｉｄｔ２００５］。蜀翦，仍有很多磅究者致力予这一领域［Ｓｃｈｉｍｉｄｔ２００５；Ｊｕｎｋｅｒ２００４］。然而，由于很难确定发酵过程中影响放大操作的因素，故将～个发酵过程从实验室规模放大至工业生产规模仍是一项艰巨的任务。事实上，许多大规模发酵过程的产量都低于实验室实验结果所预期的产量［Ｈｓｕｅｔａｌ。２００２］。因此发酵过程的放大技术仍被认为‘‘是一门艺术，丽不是科学”【范代娣２０００］。

１．３．１放大原理

从现有理论看，微生物过程放大主要解决两个基本问题，其一是微生物反应过程动力学的研究；其二是选择与设计满足这些过程条件的反应器【储炬李友荣２００７。２】。在

第一章文献综述

解决这两类问题时，放大过程所遵循的最基本原则是相似性，放大方法的理论基础是相似原理。相似原理的基本点是：对任何反应系统，可用数学方程描述其生物化学反应过程、流体流动与动量、热量和质量传递过程，如果两个系统能用相同的微分方程来描述，并具有相同的特征，则两个系统将具有统一的行为方式。如以ｍ７、朋和ｋ分别表示放大模型的变量、原型变量和放大因子，模型反应器与放大反应器的相似性则可表达线性关系：历７＝／ｏｎ。该方程是否对所有变量有效或对部分变量有效，决定系统是否全部或部分相似。按变量的性质，理想的反应器放大应达到的相似条件：①几何相似；②流体力学相似；③热相似；④质量（浓度）相似；⑤生物化学相似。按照以上顺序，前一级是后一级的前提。

为应用相似原理达到相似性条件，生物反应器的放大有多种方法。然而，由于生物反应器的类型很多，所适用的反应体系各异，对其放大所涉及的生物催化剂的生物学特性、生物反应动力学、传质和传热、流体流动的机理等众多方面，因而它是一个综合性很强的复杂问题。因此，实际上并不存在普遍适用的放大方法。各种放大方法的特点均是保持部分对过程影响较大的参数不变，因此放大准则的选择将成为放大成功与否的关键［储炬李友荣２００７．２】。

１．３．２物理放大参数与方法

１．３．２．１物理放大参数

可用作放大准则的物理参数包括所有己知的过程参数以及那些影响生理的参数，特别是那些影响氧供应、热传递和混合的参数，如输入功率、通气和搅拌速度［ＡｌｖｅｓａｎｄＶａｓｃｏｎｃｅｌｏｓ１９９６］、混合时间［Ｏｎｉｓｃｕｅｔａ１．２００１］、无因次混合时间、气体滞留量、溶解氧浓度、氧传递速率ＯＴＲ［ＤｉａｚａｎｄＡｃｅｖｅｄｏ１９９９；Ｒｕｓｓｅｌｅｔａ１．１９９５１、体积氧传递系数ｋＬａ、生物热变量如热流和热传递系数等等。具体如表１．１［Ｓｃｈｍｉｄｔ２００５］所示。

评价生物反应器传递过程特性主要从流体流动与混合、热量和质量传递等方面进行。生物热的测定被发现与代谢活性及ＯＴＲ有一定的相关性，可被用作细胞生长状态的指示剂［Ｔｉｉｒｋｅｒ２００４；Ａｎｄｅｒｓｏｎｅｔａ１．２００２］；然而，其计算需要热流和热源、能量输入以及发酵罐内温度分布的准确测定和相关知识［Ｓｃｈｍｉｄｔ２００５］。同时，由于热量传递仅发生在热量交换界面上，而流动与混合和质量传递既与生物过程的各宏观动力学因素有关，也涉及微观反应机制，因此反应器放大及其性能评价的关键准则主要与流体流动和质量传递性质有关［储炬李友荣２００７—２】。

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第一章文献综述

１．３．２．２放大方法

对微生物发酵或细胞培养过程，一般需考虑多方面的因素，包括宏观混合、氧传递、流体剪切力、Ｃ０２排出、泡沫形成和操作成本等，生物反应器的设计与操作受到各方面因素的限制。因此，对于一个特定的过程，应综合考虑这些因素，从而选择合适的放大方法。

通常，反应器的几何特征是生物反应器放大时保持不变的基本条件【储炬李友荣２００７．２】。反应器几何相似，即高径比保持不变，用下式表示：

，、三

Ｄ２＝。＇ｆｔ堡ｖ，Ｊ１３

耻和＝和时＝日＇侄ｔｖ，Ｊ］－

在满足几何相似的条件下，常根据具体的过程采用不同的放大方法进行生物反应器的放大。如对于好氧发酵，常采用恒定缸口法进行放大，这是考虑到需氧发酵过程动力学速率经常受到氧传递的限制，氧传递问题是发酵过程的主要问题。而对剪切敏感的细胞，若使用机械搅拌的动物细胞反应器进行培养，最关键的问题是防止流体剪切作用对细胞的损伤，因而采取最大剪切力相同法（叶尖速度相同法）进行放大（如采用Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｈｒｅｓｔｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ的变异体生产丰加霉素的放大［Ｔａｋｅｂｅｅｔａ１．１９９４】）；由于对于一定的通气表观线速度，相同的搅拌功率消耗等同于氧传递系数相等，并且单位液体质量的功率消耗与湍流漩涡长度有关，所以保持单位液体体积的功率输入不变能够兼顾传质和流体剪切两方面的问题，因而该参数在机械搅拌发酵罐放大中较重要［Ｊｕｎｋｅｒ２００４】。通气速率和通气表观线速度是气体分散的重要指标，也是反应器流动状态和混合效果的重要参数，特别是对鼓泡反应器和气升式反应器，通气速率和表观线速度决定传质系数、液体循环和混合时间等关键参数。在有些情况下，维持发酵罐内环境的均一性非常重要，而混合时间与反应器中底物的浓度分布有关，故大型反应器与小型反应器必须保持混合时间相等（如由产气肠杆菌生产２，３－丁二醇的发酵放大［Ｂｙｕｎｅｔａｌ．１９９４】）。但是，维持相同的混合时间所需的单位体积功率输入的增加是系统总功率输入的２／３，从而限制了放大规模。实验证明，按此准则放大所需的功率远大于等体积功率放大所需的功率［戚以政夏杰２００４］。此外，在次级代谢产物培养放大中，Ｌｋ－－氧化碳释放速率仍是目前的颇为有用的方法。由于溶解二氧化碳传感器越来越可靠，基于溶解二氧化碳浓度的放大也更加可行［Ｊｕｎｋｅｒ２００４］。

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综上所述，各方法均顾此失彼，在具体放大过程中，要根据具体情况选择使用，不可能有一种完美的满足各参变量要求的放大模式。在放大过程中，大罐的混合强度、气泡大小、气泡分布、浓度梯度、滚动程度均与小罐存在差异，在讲放大原理和方法时，不可能对这些参变量进行全面考虑，面恰恰是这些参数引起的放大效应阻碍着每个工艺的成功放大，因此在实际应用过程中，要根据情况对用某一放大准则求出的放大基准参数进行必要的、合理的修正【戚以政夏杰２００４］。

有一些放大方面的研究值得注意。采用链霉菌ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ生产ｂｉａｌａｐｈｏｓ的放大生产中，基于ｋＬａ和Ｐ∥Ｌ的放大并不成功，其原因在于发酵罐内存在很大的溶氧浓度梯度。而在以上这个情况下，培养物对于放大雩｜起的搅拌桨叶尖速度的变化并不敏感。当采取实验室发酵罐中的溶解氧浓度放大时则取得了成功［Ｔａｋｅｂｅｅｔａ１．１９９４］。在＆ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ产米尔倍霉素的生产小试中采用搅拌速度控制溶解氧浓度，而当放大规模同样采取搅拌速度控制溶解氧浓度时，却引起了生产中其它问题的恶化，这种现象被简称为ＳＵＤＳ（Ｓｃａｌｅ－ｕｐｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｅｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｓｙｎｄｒｏｍｅ）并发症［Ｊｕｎｋｅｒ２００４］。ＳＵＤＳ并发症包括培养物形态发生变化，而形态变化影响压紧细胞体积和黏度，并引起碳源吸收变化，从而降低产率。通过将通气速率、反应器操作压力、温度以及搅拌速度相结合以控制溶氧的策略使得敖大后可保持实验室的产率。

１．３．３．３氧传递在发酵过程中的重要作用

大多数工业微生物过程都魁好氧的，而且其培养基大多数为包含盐和有机物的水溶液。在这些过程中，氧是微生物用于生长、维持和代谢产物生产的重要基质，氧的缺乏会直接影响过程结果［Ｇａｒｃｉａ－Ｏｃｈｏａ＆Ｇｏｍｅｚ２００９１。而生物反应器中氧的传递往往会成为发酵的控制因素。这主要是由于氧在水中溶解度很小所致，在２５℃和１０１．３２５ｋＰａ下，空气中的氧在缝水中的溶解度仅为０．２５ｍｏｂ＇ｍ３左右，毙糖鲶溶解度小７０００倍【范代娣２０００］。培养基中因含有大量有机物和无机盐离子，因而氧在培养基中的溶解度就更低。在细胞的对数生长期若停止供氧，则发酵液中的溶解氧会在几分钟内耗尽；尤其在发酵后期，反应器中生物量很大，发酵液粘度也增大，此时氧的溶解和传递往往是细胞反应的限制步骤［马晓轩２００６］。供氧不足会导致兼性好氧菌的代谢途径发生改变，如在酵母菌发酵过程中产生乙醇［Ｈｅｎｓｉｎｇ

Ｅｉｔｅｍａｎ＆Ａｌｔｍａｎ２００６；Ｍｅｙｅｔｅｔａ１．１９９５１，在Ｅｃｏｌｉ发酵过程中产生乙酸［Ｌｅｅ１９９６；ａｌ。２００７］，从而影响整个发酵过程的结果。

氧从气泡传递到细胞内要克服一系列的阻力，如图ｌ一２【范代娣２０００］所示。在这些阻力项中，气泡周围的液臌阻力往往控制着整个传递过程［Ｇａｒｃｉａ．Ｏｃｈｏａ＆Ｇｏｍｅｚ２００９】。

第一章文献综述

①通过气膜到气液界面的气膜传递阻力ｌ／妃；②气液界面的传递阻力ｌ编：③从气液界面通过液膜的传递阻力Ｉ／ｋＬ：④液相主体的传递阻力１／ｋＬｓ；⑤细胞或细胞团表面的液膜阻力ｌｌｋＬｃ；⑥固液界面的传递阻力１偏ｓ；⑦细胞团内的传递阻力１／“；⑧细胞壁的阻力１／ｋｗ；⑨反应阻力ｌ瓜Ｒ．

图１．２氧从气泡到细胞的传递过程示意图

Ｆｉｇ．１－２Ｓｔｅｐｓｆｏｒｏｘｙｇｅｎｔｒａｎｓｆｅｒｆｒｏｍｇａｓｂｕｂｂｌｅｔｏｃｅｌｌ

描述气液界面质量传递最简单、也是最常用的理论为双膜理论，如图

。

１－３［Ｇａｒｃｉａ－Ｏｃｈｏａ＆Ｇｏｍｅｚ２００９］所示。

７

＆１２｜》１１．ｋ＋礁。

图ｌ－３

Ｆｉｇ．１－３薄膜理论气液界面浓度及质量传递系数示意图

ａｎｄｌ【ＧａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｆｉｌｍｔｈｅｏｒｙＳｃｈｅｍａｔｉｃｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｇａｓ—ｌｉｑｕｉｄｉｎｔｅｒｆａｃｅ．ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓａｎｄｍａｓｓｔｒａｎｓｆｅｒｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓＫＬ，ｋＬ

根据双膜理论，氧气通过气液界面的摩尔流量为

Ｊ＝ｋｃ（ｐＧ—Ｐ１）＝ｋＬ（Ｃｉ—ＣＬ）

由于界面浓度不能直接测定，因此考虑整个质量传递系数，上式可写为

Ｊ＝ＫＧ（ｐＧ－Ｐ幸）＝ＫＬ（Ｃ扎ＣＬ）

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