RNA的提取和cDNA合成与realtime PCR-100125

RNA的提取，cDNA合成及realtime PCR

RNA提取 cDNA合成

RT- PCR 或 realtime PCR 一：RNA提取

1．RNA提取中应该注意的事项

模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的结构特点,容易受RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。

细胞内总RNA制备方法很多,如异硫氰酸胍热苯酚法等，许多公司有现成的总RNA提取试剂盒,可快速有效地提取到高质量的总RNA。本实验室采用Trizol?试剂进行总RNA的提取，纯化的mRNA在70%乙醇中-80℃可保存一年以上。 2．RNA提取所需要准备的试剂及器材 1）试剂

三氯甲烷、异丙醇、DEPC水（配制方法参考分子克隆）、75%乙醇（用经DEPC处理的去离子水配制） 2）设备及器材

真空泵、分光光度计、匀浆器（用于组织来源的样本）、冰浴、RNase-free的eppendorf管、RNase-free的枪头、一次性手套、一次性口罩、一次性帽子。 3．RNA提取的步骤

3．1 细胞在Trizol?试剂中的匀质化

此步骤因样本类型的不同在操作上略有不同，请操作者依据情况而定。 a. 组织样本

将事先经180℃干烤过夜的匀浆器置于冰浴中，加入1ml Trizol?液，然后将新鲜取得的或保存于液氮中的组织块50-100mg（注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%），经生理盐水清洗后迅速置于Trizol?液中，仔细研磨，直到形成均一的混合液，整个操作在冰上进行。 b. 单层贴壁细胞

将培养皿中的细胞培养液吸干，直接在培养皿中加入适当体积的Trizol?液（1ml/10cm），Trizol?液的不足会造成DNA的污染。用枪吸打混合液数次，直到形成均一的混合液，无粘稠现象。 c. 悬浮细胞

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首先通过离心收集细胞。用PBS清洗细胞两次，除去上清后加入适当体积的Trizol?液（1ml/5-10×10细胞）。用枪吸打混合液数次，直到形成均一的混合液，无粘稠现象。 注意：当样品中混有较多的蛋白、多糖、脂肪或者肌肉组织的时候，需要进行额外的一个分离步骤。在细胞与Trizol?充分混合均匀后，在2-8℃，12000g离心10min，抽取上清到一个新的EP管，以除去不溶性的物质。然后再新的EP管中进行以下步骤。

注：放在Trizol?中的RNA可放于-80℃冰箱中保存，长达半年。在样品数目较多，或者不同时间点收集的样品一时无法完成RNA提取的全部操作程序，可以考虑选择这样的方式保存。 3．2 氯仿（三氯甲烷）抽提

将上述获得的Trizol?混合液在室温放置5min，使核蛋白复合物充分解的离。按照200ul/1ml Trizol?的比例加入三氯甲烷，用力摇匀15-30s，室温静置2-3min。用不大于12000g的转速2-8℃离心15min。离心后，Trizol?混合液会分为三层：下层为粉红色的有机相，中间层为薄薄的白色物质，上层为清亮的水相，只含有RNA，大约占60%。 3．3 RNA沉淀

将水相小心的转移到一个新的EP管中（注意不要碰到中间相），如果要进行DNA和蛋白的分离可保存有机相（操作按照Trizol?说明书进行）。加入吸出的RNA水相等体积的异丙醇，均匀混合后，室温静置10min，然后用不大于12000g的转速2-8℃离心10min。

注：异丙醇按照1：1的量加入。异丙醇沉淀中含有较多的盐离子，沉淀后要用75%乙醇漂洗，见下。

3．4 RNA沉淀的漂洗

将上清部分去除，加入至少1ml的75%乙醇（用经DEPC处理的去离子水配制），用振荡器振荡使RNA沉淀重悬，使RNA沉淀得到充分漂洗。然后用不大于7500g的转速2-8℃离心5min。 3．5 RNA沉淀的溶解

去除上清，室温干燥5-10min，可用一次性手套盖住管口，以防RNA降解。另外注意不要使RNA沉淀过干，影响RNA的溶解。用适当体积的DEPC水溶解RNA 沉淀，可将EP管放到55℃水浴中促进RNA 的溶解。

注：根据RNA沉淀大小适量调整DEPC水的体积，使RNA浓度尽量一致。 3．6 RNA质量的检测及浓度测定。

电泳检测：用1%的琼脂糖电泳观察RNA质量。总RNA由rRNA，tRNA和mRNA组成，三者分别占总RNA的80%， 10～20%，3～5%。28S rRNA和18S rRNA 构成电泳的两条主带，带型清晰，大小分别在2kb和 1kb左右；mRNA大小从数百bp到数kb不等，5S rRNA和tRNA更小，这几种RNA亮度较弱。RNA有降解时，28S和18S的主带消失，RNA降解为小分子的片段，电泳时成糜散样分布。见图。

分光光度计检测：1）根据OD260计算RNA浓度：RNA的浓度（ng/ul）=(OD260*40ng/ul)*稀释倍数。2)根据OD260/280检测是否有DNA和蛋白污染： RNA的比值为2.0，而DNA和蛋白质的比值为1.8，若比值较

低，说明有残余蛋白质和基因组DNA存在；比值太高，则提示RNA有降解（实际做实验时，OD260/280一般在1.3～1.4左右，因此该项的参考意义不大。比值在较文献所述值偏低的原因可能与DEPC水有关）。 3）根据OD260/230检测是否有污染：有机物如酚和Trizol试剂中含有的硫氰酸胍在OD230有吸收峰，使得OD260/230比值偏低，这些物质会影响下游如RT-PCR的反应，降低反应效率，特别是在表达谱芯片时，影响较大，因此要注意该项比值，不要太低，理想值为2.0以上。

3．7 RNA的保存

RNA可在DEPC水中于-80℃进行短期保存，不超过1个月。

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二：RT-PCR

1. 试剂：

Random primer（Takara，D3801，用DEPC水溶解成100uM,分装，放于-20度）或oligo dT(Takara，D510或D511)，

dNTP（Takara， D2030，2.5mM each， RNA专用）, RNase inhibitor（Takara，D2313A），

M-MuLV Reverse Transcriptase（NEB，M0253，若需反转录的区域的GC含量较高，可使用invitrogen公司的superscriptase-反转录温度可达55度，或thermoscriptase-反转录温度可达65度）。

2. RT反应体系（第一步）： Random 引物（100uM） 1μl dNTP（2.5mM each） 4μl RNase inhibitor（40U/ul） 0.5μl RNA 水 2ug 补充至17.25 70℃ 5分钟使RNA充分变性，然后立即放入冰浴利于引物与模板的结合。

RT反应体系（第二步）： 10×RT 缓冲液（如有不溶2μl 物， 可置于55度充分溶解） M-MLMV逆转录酶 0.25μl 1) （可选）25～30度10分钟。该步骤是使random primer与模板结合后先有一个短暂扩增，

生成一个较长长度的引物以便于下一步42度时结合更牢固。 2) 42℃ 1～1.5小时 3) 94℃ 5分钟

4) cDNA保存于4℃一个月或-20℃或进行PCR。

3. 注意事项：

? 微量加样一定要加准（枪，操作细节：各样品之间操作统一，一致）。 ? RT-PCR之前进行电泳分析RNA完整性。

? 试剂溶解时尽量用DEPC水溶解，以防RNA酶污染。

三、Realtime PCR

1.引物设计与检验 1.1 引物设计：

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引物不能有非特异的扩增条带或者引物二聚体

在mRNA level assay中，要使引物扩增产物尽量的跨过内含子；如果是在不能找到跨内含子的引物，那就要尽量保证RNA的质量要好，没有基因组污染。或者也可以用DNA酶处理逆转录之前的 RNA样品。 ? ? ? ? ?

在基因组数据库中用扩增产物BLAST, 避免扩增出基因组上的假基因

扩增产物尽量小，扩增效率要好；扩增产物在50bp~150bp之间，文献中小于300bp似乎也可以接受 根据所选择的试剂，确定退火温度，通常用60度，采用两步法PCR 引物设计软件，推荐：ABI公司的Primer Express 2

引物大规模使用之前要先用定量的试剂试用，确保无非特异扩增和无二聚体形成

1.2 引物检验

进行realtime PCR, 通过熔解曲线实验判断引物是否可用。

2.试剂：

试剂盒有多种可选用，实验室所用为 Takara SYBR? Premix Ex Taq? (Perfect Real Time)，货号DRR041。

3.实验步骤

3.1 反应体系： buffer（2x，含有buffer，dNTP，酶） 10ul 引物（上下游引物各5uM each） 模板（20ul 反转录完成后稀释到100ul） H2O 1ul 2ul 补至20ul 3.2 配制反应体系，尽量使用premix然后进行分装。上机进行realtime实验。设定程序，不同试剂，不同机子程序不同。另外，由于每次扩增的模板以及其他情况不同，最好每次进行realtime时均作溶解曲线实验确定引物扩增出的为单峰。

3.3 分析溶解曲线，去掉溶解曲线不佳的孔，标记各孔模板以及基因，选择对数扩增期确定各孔Ct值进行数据分析。

4. 注意事项：

? 仔细阅读所使用试剂的说明书，按照所使用的机器和试剂选择Passive Reference ROX Dye。? ? ? ? ? ? ?

ABI 7500必须使用Rox，而Biorad IQ5不需要。

微量加样一定要加准（枪，操作细节：各样品之间操作统一，一致）。 拿管和盖时带一次性PE手套，避免干扰管和盖的透光部分。

管盖是读数的通道，所以不能写字，如果使用八连管可以在管子的侧边写字编号标注，防止离心时分辨不清。设计PCR管的布局，可以在实验记录上预先写好，方便加样。 充分混匀，分至三个复孔。

Vortex（转速不至太高，普通离心机不超过3000~5000rpm以避免酶失活）甩至管底，多甩几次去除气泡。

放至realtime机子内一定要将管子压紧，压实。 进行定量分析

? 舍弃数值差异太大的孔 ? 不同次realtime PCR的数值能否相互比较？可以，导出每次的数据进行分析 ? 在模板较少时，复孔间的Ct值会有较大的变异，因此标准差会相对较大。

分析完之后一定注意保存文件。

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