平潭万基医学检验所胎儿亲子鉴定报告

平潭万基医学检验所无创胎儿亲子鉴定研究报告

摘要 目的：

该研究的目的是使用基于微阵列芯片的单核苷酸（SNP）多态性测量从母体血浆分离的cell free DNA（cell free DNA）来评估基于信息学的无创性产前亲子鉴定（胎儿亲子鉴定）的诊断准确性。 方法：

从21名成年孕妇（胎龄在6至21周龄）取血样，从相应的生物学父亲中取出遗传样品。亲子性通过在体外受精期间对婴儿的基因检测，受孕产品，受精控制和/或植入前基因诊断进行确认。使用HumanCytoSNP-12微阵列芯片扩增并分析亲本DNA样品和母体无浆细胞的DNA。基于信息学的方法测量单核苷酸多态性数据，确认或拒绝亲子关系。具有足够胎儿cell free DNA分数的每个血浆样品独立地针对确认的父亲和1,820个随机的不相关的男性数据进行测试。 结果：

21个样品中有一个没有足够的胎儿cell free DNA。当对生物父亲进行测试时，该测试正确证实了其余20个样品（100％）的亲子关系，P值<10 -4。对于使用不相关男性作为所谓父亲的36,400次测试，99.95％（36,382）正确排除了亲子关系，0.05％（18）是不确定的。没有任何错误。 结论：

使用单核苷酸多态性微阵列芯片测量的基于信息学分析的胎儿亲子鉴定在妊娠早期准确确定亲子关系。

关键词：胎儿，无创，亲子鉴定，产前

介绍

可靠的产前亲子鉴定需要直接进行绒毛膜取样或通过羊膜穿刺进行羊水取样，这两者都会增加对母亲和胎儿造成伤害的风险。羊膜穿刺术的流产风险为1 / 300-1 / 500（参考文献1），其他并发症的风险很小。2，3绒毛取样进行了类似的流产风险和胎儿四肢减少缺陷的1/3000的风险，尤其是当将10周妊娠之前进行。4，5虽然美国妇产科学会建议将这些程序提供给所有孕妇，1 当母亲处于遗传缺陷的高风险时，如积极的第一孕期筛查后，它们最常用。 母亲血液中胎儿cell free DNA（cfDNA）的发现表明可以开发胎儿亲子鉴定，这将避免与有创操作相关的风险。6虽然胎儿cfDNA在母体循环最初报道十多年前以上，6，7，8使用孕妇外周血一种可靠的，非侵入性的亲子测试的发展已经证明难以实现，因为胎儿cfDNA通常包括在总cfDNA的<20％母亲血浆并且高度分散。9胎儿cfDNA的有限数量及其通过母体cfDNA的重度稀释存在重大技术挑战。这些可以通过将微微阵列芯片或高通量测序（其测量数十万至数百万个DNA片段）与复杂的生物信息学技术结合以从母体血浆cfDNA测量获得的有限胎儿基因型数据中提取最大信息来克服。

我们之前曾报道过这种称为亲本支持的方法，该方法使用来自母本和父本DNA的单核苷酸多态性（SNP）芯片测量来提高噪声胚胎DNA基因型测量的保真度。10虽然这种方法精确地在单个胚胎细胞的所有24条染色体倍性标识，它并没有被用于亲子鉴定。

在这里，我们使用家长支持算法的一个版本来确定从母体血浆分离的cfDNA所做的cfDNA SNP测量的胎儿组分是否可能是由于所谓的父亲造成的。我们报告了21名孕妇测试这种新方法的结果，每个样本独立测试了确认的父亲以及1,820名无关个人。我们在怀孕6周后就能以100％的准确性鉴定亲子关系。

去： 材料和方法

入选妇女/夫妇的纳入标准是在已知亲子关系的第一或第二个妊娠期的单胎妊娠。夫妻通过体外受精诊所，产科办公室或在线广告进行登记。所有符合纳入标准的女性都在2011年4月至6月期间入组。妊娠年龄介于6至21周，并且以各种方式证实了亲子关系（表1）。21个样品中的9个在体外通过控制受精已知亲代受精，并通过基因型特异性植入前基因诊断再次确认了亲子关系。剩余的12份样本通过独立的亲子鉴定对胎儿或出生后遗传物质（DNA Diagnostic Center，Fairfield，OH）进行了亲子鉴定。所有参与者均获得书面知情同意书，并在机构审查委员会批准的研究协议下收集遗传样本。 表格1

亲子鉴定包括用于验证试验的样本类型

将母体血液样品（?20ml）收集到无细胞血液试管（Streck，Omaha，NE）中，并且将血液样品（?5ml）收集到EDTA血液收集管中。平均来说，10毫升血浆从每个母体样品通过双离心（分离1,600 克 10分钟，管传递，离心16,000个克10分钟）。根据制造商的说明使用Qiagen（Valencia，CA）循环核酸试剂盒分离母体血浆cfDNA并在45μl缓冲液中洗脱。使用20μl在1x NEB4缓冲液，0.42mmol / l dNTP和2.5U T4 DNA聚合酶（New England Biolabs，Ipswich，MA）中的20μl洗脱液在20℃下孵育DNA末端30分钟，并使聚合酶通过在75℃孵育15分钟而变性。加入3微升连接混合物（0.5μl10x NEB4,1μl10mmol / l三磷酸腺苷，1μlT4多核苷酸激酶（New England Biolabs），0.5μlT4 DNA连接酶（New England Biolabs）），并孵育样品在16℃24小时，然后在75℃15分钟。将测试样品转移至标准Illumina Infinium测定（Illumina，San Diego，CA），如同母本和所谓的父本基因组

DNA样本一样。简而言之，将24μlDNA在37℃下全基因组扩增20-24小时，然后进行片段化和沉淀。除非另有说明，所有后续程序均在Tecan EVO（瑞士M?nnedorf）进行。将沉淀重新悬浮在微微阵列芯片杂交缓冲液中，热变性，并转移至Cyto12-SNP微微阵列芯片。将微微阵列芯片在48℃孵育至少16小时，X染色（Infinium II Chemistry），洗涤并扫描。并转移至Cyto12-SNP微微阵列芯片。将微微阵列芯片在48℃孵育至少16小时，X染色（Infinium II Chemistry），洗涤并扫描。并转移至Cyto12-SNP微微阵列芯片。将微微阵列芯片在48℃孵育至少16小时，X染色（Infinium II Chemistry），洗涤并扫描。 使用BeadStudio（Illumina）软件提取微微阵列芯片强度。通过考虑母亲纯合的常染色体SNP来确定母体血浆中的胎儿部分。基于群体频率，母体纯合SNP组被分成子集，其中胎儿极有可能或极不可能具有与母亲相同的基因型。胎儿分数与两个子集之间观察到的非等位基因强度的差异成比例。

使用家长支持分析基因分型结果。8对于每个母亲和所谓的父亲组合，该方法生成一个检验统计量，表明该可能父亲的基因型占母体血浆cfDNA基因型测量的胎儿组分的多少。测试统计值是为5,000名不相关男性的母亲分别计算的，为这种情况创建了一个不相关的男性测试统计分布（图1和补充图S1-S19线上）。然后为母亲和被指称的父亲计算检验统计量，单假设拒绝检验确定所谓父亲的检验统计量是否落在使用无关男性产生的检验统计量的分布之下。如果所谓的父亲的检验统计量被排除在无关男性检验统计量分布之外，那么所谓的父亲被确定为亲生父亲。如果所谓父亲的检验统计量落在无关男性检验统计量分布范围内，则认定他不是生父亲。 图1

亲子鉴定的父母支持方法。两个独立的女性的亲子鉴定结果：（a）一个带有亲子鉴定和（b）一个带有亲子鉴定排除。测试统计分布用灰色表示，该区域表示父亲包含（指称父亲的P值<10 -4）用绿色表示，指示父亲排斥的区域（所指称的P值> 0.02的父亲）用米黄表示，并且该地区表明不确定的亲子关系（据称父亲的P值介于10 -4和0.02 之间）用黑色表示。 具体而言，根据无亲缘关系的男性分布的所谓父亲的检验统计量的P值<10 -4时，称为亲子鉴定（确认亲子鉴定）。当计算出的P值在10 -4和0.02 之间时（图1），调用一个不确定的结果（无呼叫）。当计算出的P时，称为父亲排除值> 0.02。当母体cfDNA中的胎儿DNA分数<2％时未做出决定。用于产生预期分配的一组无关个体由来自各种种族背景的个体组成，并且使用不同种族的不相关个体重新计算亲子鉴定，包括针对所指称的父亲指示的种族。包含和排除结果由信息学方法自动生成; 不需要人为判断。 去： 结果

使用家长支持测试了21个已知亲子关系的母亲血样（表1）。由于母体血浆中胎儿cfDNA的比例很低（<2％，表1），因此无法评估一个样本。对于其余20份胎儿cfDNA充足的样本，使用确认的父亲和随机设置的1,820名无关男性个体进行了1,821次独立的亲子鉴定，共进行了36,420次亲子鉴定。我们在100％（20/20）的病例中证实了亲子关系，P值<10 -4（表1）。该测试早在妊娠6周时就准确鉴定亲子关系，并且胎儿cfDNA的含量较低。 值得注意的是，99.95％（36,382 / 36,400）的测试使用家长支持正确排除了亲子关系。只有18（0.05％）被称为不确定。没有一个测试样品的亲子鉴定不正确。 去： 讨论

我们报告了第一个高度准确，无创，临床可用的产前亲子鉴定。传统的产后亲子鉴定包括分

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/9w8r.html