乳酸菌培养及诱导培养基
更新时间:2024-05-22 11:42:01 阅读量: 综合文库 文档下载
嗜酸乳杆菌 试验方法
一株嗜酸乳杆菌产共轭亚油酸条件的优化 [J]. 中国酿造,2009 1、基础培养基(脱脂乳培养基)
12.0 g脱脂奶粉,蒸馏水100 mL,pH自然,115℃灭菌20 min。
2、MRS固体培养基
葡萄糖20.0g,蛋白胨10.0g,牛肉膏10.0g,酵母浸膏5.0g, 无水乙酸钠5.0g,磷酸氢二钾2.0g,柠檬酸氢二铵2.0g, MgSO4·7H2O 0.58g,MnSO4·H2O 0.33g,
琼脂15g,pH 6.8左右,加蒸馏水至1000mL,121℃灭菌20min。
3、产酶培养基:
脱脂乳培养基,并加入一定浓度的亚油酸来诱导产酶。
1 出发菌株的活化及纯化
保藏的嗜酸乳杆菌接种于液体MRS培养基,摇匀后置36℃恒温箱中培养12h,接种于液体培养基中活化2次。划线接种到MRS固体培养基,36℃恒温培养36h,嗜酸乳杆菌在120r/min的状态下培养有利于嗜酸乳杆菌的繁殖。长出单个菌落后,挑取菌落进行革兰氏染色镜检,确定是否纯种。
嗜酸乳杆菌的形态与菌落特征
在MRS琼脂培养基上需氧培养48h后,菌落微小,不规则,微隆起,有光泽,灰白色,呈透明的玻璃霜花样。10倍显微镜观察表面凸凹不平,边缘为丝状或卷发样。革兰氏染色后可见菌体呈短杆状,单个或短链状排列,革兰氏染色阳性。肉眼观察, 嗜酸乳杆菌菌落较小,平台状, 不规则、圆形凸起、边缘整齐、质地柔软、灰白色、有光泽。
1)500mL MRS液体培养基
2)5个250mL的三角瓶,橡胶塞,牛皮纸,绳子 3)5个培养皿
4)1个接种环,酒精灯,打火机,酒精
2 种子的制备
活化的菌种接种于基础培养基,于36℃恒温培养24 h,保藏备用。 增菌培养基最佳接种量为3%(活菌数为108个/mL)★
3 产酶诱导培养
用脱脂乳配成12%的产酶液体培养基,每250mL三角瓶中装入100mL(含12g脱脂乳、1.50‰亚油酸),加入1mL吐温80,115℃灭菌30 min后,接入2 mL种子液(每mL含菌体5×108个),36℃培养36h。▲
*
100mL 三角瓶装40mL的脱脂乳(含4.8g脱脂乳、1.50‰亚油酸),将活化后的菌种按3%接种(接种量为1.2mL),混匀,在36℃下静止培养36h。并添加0.1%(m/v)的乳糖,0.1%的硫酸铵,0.1%的氯化钠。
1)5个100mL的三角瓶 第一次
直接添加LA比较好,且LA添加量为 1.50‰ 反应温度为 36℃ 发酵时间为 36h
第二次(回归正交)每个试样平行3次。 (菌种接种量2%、3%、4%、5%、6%) (发酵时间为 12h、24h、36h、48h)
(D-果糖添加量0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%(m/v)) 果糖为产CLA的最佳碳源
(硫酸铵添加量0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%(m/v))
结合有机物牛肉膏更有利于乳酸菌的生长,CLA产量也最高。硫酸铵的添加量增加CLA产量反而有所减少。铵离子被吸收会导致培养基的pH下降不利于CLA的产生。※ ※ 于国萍,寇秀颖. 产共轭亚油酸乳酸菌的选育及培养基的确定[J]. 食品工业科技, 2005,26(5):60~62.
(氯化钠添加量0、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%(m/v))
(直接添加LA比较好,且LA添加量为 0.50‰、1.00‰、1.50‰、2.00‰(v/v)) (反应温度为 25℃、30℃、36℃、40℃) (发酵时间为 12h、24h、36h、48h)
考察菌体接种量、亚油酸(LA)的添加量、反应温度等因素对菌株嗜酸乳杆菌转化培养条件的影响。
4 分离纯化
培养结束后离心高速冷冻离心机(6000r/m,10min,4℃)收集菌体细胞。用蒸馏水洗涤2次,离心后称重,及得生物量。离心后加入4倍体积的pH4.0的缓冲液混匀,以0.5%(m/v)的量添加溶菌酶(30℃保温,1h),然后再使用超声波细胞破碎仪(超声3s,间歇4s,90次,400W)在冰水浴中进行细胞破碎。破碎完成后进行离心(8000r/m,10min,4℃),所得上清液及为粗酶液。 粗酶液的合成反应
取上述制取粗酶液5mL加2mLLA乳浊液底物(5% LA+5% Tween80+90% pH4.0缓冲液,放入冰水浴中超声10min,功率400w),放在摇床中30℃,120r/min反应3h。反应结束后,待测。 5 共轭亚油酸的检测 脂肪酸的提取
反应后的溶液中加入5ml正己烷,充分震荡萃取,静置后待分层,收集上清液,在正己烷溶液中加如无水NH3SO4吸水干燥。与30℃旋转蒸发,去除有机溶剂,将余下的液体收集在试管中待测。 GC-MS检测共轭亚油酸
以未接入菌种、其他步骤和条件同上的情况下所得到的正己烷萃取液为参比、正己烷为溶剂,于波长200nm~300nm处扫描样品,观察波长233nm处有无特征吸收峰。若在该波长处有特征吸收峰者,表明其发酵液中有CLA生成,读取波长234nm处吸光度值,根据CLA标准曲线所得CLA浓度,计算发酵液中CLA的生成量。
用UV-1600可见紫外分光光度计在190nm~300nm对共轭亚油酸进行波长扫描,以确定其最大的吸收波长。其波长扫描图如图2.1,得其最大吸收波长233nm。
图2.1 CLA最大吸收波长扫描图 Fig.2.1 Absorption wave maximum of CLA
* 张 智,余 萍. 嗜酸乳杆菌的筛选及培养基的优化[J]. 中国乳品工业, 2007,
35(6):25~27. ★ 陈洪仪,杨 楠. 嗜酸乳杆菌培养的研究[J]. 现代食品科技, 2009, 25(6):656~660.
▲ 张 浩,曹 健,张国艳. 保加利亚乳杆菌中德亚油酸异构酶的研究[J]. 食品研究与开发, 2006, 127(7):102~107.
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