液相色谱-串联质谱法测定动物组织中1,2-二苯乙烯类药物残留的研究

液相色谱-串联质谱法测定动物组织中1,2-二苯乙烯类药物残留的研究

第!-卷第’期

!""#年&&月质谱学报>*5<902*;?419@6@A066B@8D<*/@D<*81@DCEBEF*2+!-!)*+’)*G+!""#

液相色谱串联质谱法测定动物组织中%

"二苯乙烯类药物残留的研究BD%

应永飞&!朱聪英&!陈慧华&!吴平谷!!周文海&

"浙江杭州!%浙江杭州!%#&+浙江省畜产品质量安全检测中心$&""!"!!+浙江省疾病预防控制中心$&""N&

摘要!建立了固相萃取液相色谱串联质谱法同时测定动物组织中%种&$二苯乙烯类药物"包括己二烯雌$$!$

己烯雌酚’己烷雌酚#残留量的方法%试样中的药物经甲醇超声提取后$过IK氮吹酚’\固相萃取柱净化’

至干$用流动相溶解后进行液相色谱串联质谱法测定$以^己烯雌酚为内标进行定量分析%方法的最低检$$#

a&a&(‘定量限均为"+(‘在&+(Ka&范围内线性良好!加标浓度在"+出限为"+!#N#"!&""#N!::$::!:

a&(‘动物组织中己二烯雌酚’己烯雌酚’己烷雌酚的回收率在,批内相对&"##+#c!&&"+-c$::范围内$

能满足相关法规要求%标准偏差小于或等于#+"c$

关键词!固相萃取液相色谱串联质谱!二苯乙烯类药物!残留量!动物组织$$&$!$

中图分类号!"#M’N,+’%!!文献标识码&O!!文章编号&&""($!--,!""#"’$%(%$"’

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收稿日期!修回日期!!""#$"%$!,!!""#$"N$!%

基金项目!浙江重大科技攻关项目"#!浙江重点科技攻关项目"#资助)*+!""’?&!"!N)*+!""N?!!"!-

作者简介!应永飞"$男"汉族#$浙江仙居人$兽医师$从事兽药残留分析的研究%.&&-,,!#$/012’%+8*/;&""&"&EE

通信作者!陈慧华"$男"汉族#$浙江东阳人$高级兽医师$从事兽药管理和兽药残留分析的研究%.&&-’!!#$/0123V/＿844"&’%+8*/=

液相色谱-串联质谱法测定动物组织中1,2-二苯乙烯类药物残留的研究

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!!同化激素作为生物体内产生的一类调节机

体代谢或生理功能的微量物质"能增强体内物质

沉积和改善生产性能&&"二苯乙烯类药物作!$

为人工合成非甾体类雌激素的代表药物"主要包

括己烯雌酚’()己烷雌酚’(和己二烯雌^.BI.B

酚’(等"具有促进动物生长和提高饲料转化^HB

率的作用"对畜牧生产者有很大的吸引力&但

是"滥用&"!$二苯乙烯类药物会导致动物生理

系统功能失调甚至不可逆的病变"并通过食物链

最终危害人类健康"长期摄入会干扰人体正常的

激素平衡"导致机体代谢紊乱)发育异常肿瘤)女

性乳腺癌和子宫内膜异位)胎儿畸形等严重的问

题"在我国和欧美等国家都禁止在动物养殖过程

中使用*&$!+&

&"!$二苯乙烯类药物的结构式示于图&&

目前"该类药物的检测方法主要包括免疫分析

法*%$(+)液相色谱法*N+和气相色谱$质谱法*%"’$-+&

其中免疫法往往作为筛选方法"不能作为定性依

据%液相色谱法也容易受到杂质干扰"且检测限

很难达到要求%气相色谱$质谱法作为定性方法

往往需要衍生化等步骤"操作较为繁琐&高效液

相色谱$串联质谱’K?$AB$AB(是一种集高效分

离和多组分定性)定量于一体的系统"对高沸点)

不挥发和热不稳定化合物的分离和鉴定具有独

特优势"成为近年来研究同化激素类药物检测的

主要方向"并已经应用到&"!$二苯乙烯类药物

残留检测中*&"+&同位素稀释技术在微量检测方

面具有很大的优势"在很大程度上提高了定量准

确性"在兽药残留检测领域有很好的应用前景&

本工作拟对样品前处理方法)液相色谱条件)质

谱条件进行系统优化"并对采用同位素稀释技术

解决离子抑制效应问题进行初步研究&

!实验部分

CB!主要仪器

Z0D@<6O221098@!’-N液相色谱仪$A1$

<*/066[50DD<*/18<*三重四极杆质谱仪"配

A066KE9VF(+"软件%B1:/0%‘&#冷冻离心机%

k?IH\$(-"旋转蒸发仪%AB!/191640‘@<漩

涡混匀器%A.UUK.YOQ$!#N电子天平%氮

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液相色谱-串联质谱法测定动物组织中1,2-二苯乙烯类药物残留的研究

液相色谱串联质谱法测定动物组织中&’二苯乙烯类药物残留的研究$!$!第’期!!应永飞等"%(N

工作曲线溶液含有同位素内标!!"/:

BCF!仪器条件

BCFCB!色谱条件!色谱柱"Z0D@<6eU@<<0AB

%柱温"?%+"/b&N"//b%+N#/$%"_%&#柱#

流动相"乙腈#和"+%流速"O$!c氨水溶液#\$

a&%进样量""+(/K&/19N"#K!流动相洗脱梯

度"’’"/19O!Nc#"+"&/19O(#c##+""!$!$过"+进行溶液定容至&+"/K’!!#/微孔滤膜’液相色谱串联质谱测定!$D!结果与讨论DCB!质谱定性定量分析二苯乙烯因含有酚羟基结构’在.&’!$BH负离子电离模式下容易失去一个If形成较为稳

a定的)准分子离子!以J#乙腈$AaI*iJ

#水$采用+三hN"iN"的溶液为基准流动相’U,

通方式’分别获得各个药物的分子离子诱导产生

的特征碎片离子’子离子扫描图示于图!!通过

优化锥孔电压-锥孔气-碰撞能量等仪器参数’将

各监测离子的强度调整至最大!选择丰度比最

强的碎片离子组成监测离子对"(4?!’N+"-

(((-!d-’4?!’,d!-!N&+"’4?!’-+"-&%%+-’4?

分别用于己二烯雌酚-己烯雌酚-!,N+!-!(N+%’

己烷雌酚-己烯雌酚的定量%而4(^$?!’N+"-#

((!(-+"’4?!’,+!-!%,+"’4?!’-+"-&&#+-分

别用于待测药物的辅助定性离子!为了获得更

高的离子强度’在AYA模式下优化质谱条件’

结合基质空白和基质标准液的离子扫描图优化

参数’从而相应地确定了各种药物在多反应监测

模式下信号采集的特征离子对’具体检测条件列

于表&!

DCD!液相色谱条件

为了将%种待测物与基质干扰分开’本工作

对色谱柱及流动相进行了优化!采用B+F+B所

各组分的色谱行为良述色谱柱及流动相条件’

好’减少了样品的分析时间’达到了快速检测的

目的!在该流动相条件下’被测药物容易失去

在很大程度上提高了检测的灵敏If而离子化’

度!从加标样品的AYA色谱图#图%$可见’在

待测药物出峰的位置没有杂质干扰!’’/19O(#c##+"&/19O#"c#&!+""!$!$’!/19O#"c#&!+"&/19O!Nc#!$!$B+F+D!质谱条件!离子源为.BH负离子电离源%毛细管电压%+萃取电压!F%离子源%‘F%温度&脱溶剂温度%脱溶剂气和锥!"_%N"_%孔气均为)其中脱溶剂气流速(锥N"K&4a&’!’孔气流速N碰撞气为高纯氩气’控制"K&4a&%碰撞室的压力为"+!监测模式"采用AYA%J0多反应监测方式%母离子#(子离子#离子[[&$%$各离子对的驻留时间均为对均设为单位分辨’’离子监测条件列于表&!"+&6BCG!样品处理BCGCB!试样提取!称取N+":动物组织样品#精确至"+至N加"&:$"/K聚丙烯离心管中’涡("#K同位素内标溶液!用!"/K甲醇提取’旋!/在’待蛋白质19’"_下超声提取N/19’a&变性后’取出冷却’在#"下离心N""<&/19倾出甲醇层%另取&重复提取&/19’"/K甲醇’次’合并提取液!用&甲N/K正己烷脱脂&次’醇层在(转移"_下旋转蒸发至约N/K左右’至&氮吹至约!/加&"/K离心管中’K’"c甲a&醇溶液至N/&/离心N/取K’#"""<1919’上清液备用!依次B+G+D!试样净化!取IK\固相萃取柱’用N/取B+K甲醇和N/K水活化’G+B上清液过柱’用N/K水和N/K&"c甲醇溶液淋洗柱

子’抽干’用N/收集洗脱液至玻璃K甲醇洗脱’

试管中’N"_下氮吹至干!残余物用N"c甲醇

表B!+K+监测模式下B!二苯乙烯类药物的监测条件D%

,9;J.B!,-.750I0Z.=+K+?71=050716873B!D%650J;.1.64

组分

己烯雌酚#$^.B

己二烯雌酚#$^HB

己烷雌酚#$I.B

己烯雌酚#$^$^$^.B##

?.为碰撞能量!!!注"’为定量子离子%母离子[&!’,+!!’N+"!’-+"!,N+!子离子[(?.@F$%#’’#$#$!N&+"!,!%,+"%"’’#$#$-!+-!-!(-+"!’’’#$#$&%%+-&,&&#+-%"’#$!(N+%!#锥孔电压(F(%("%"(!

液相色谱-串联质谱法测定动物组织中1,2-二苯乙烯类药物残留的研究

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质谱学报 !!!!!!!!!!!!!!!!!第 !卷 ! -

图 D!子离子扫描图/2D!Q M -. 016967 1J56 0C 9253 7?1 89 9<.0^ B!^ B!+ B!+#^ B+H 7+ . 8 I. X^$ .

图 E!多反应监测模式下标准溶液!"空白样品!"># V#空白加标样品!"浓度 GC !$#XB"$的提取离子色谱图![ 2/2E!$ 3 I 529 67% 6J..<+K+ I= 0C -7 973 I 8B D 5;16;%0 7.0 4?! N+#(%! 4?! -+#% -!+" ! -+#& -!+" !,+#N"!+", ! ! N+ 7+"’"&%+ 8 4?’"&#+ X 4?’ ! !&+@ 4?!,+#%"!+" ! N+#!+ !+" ! N+#("+"’ ! !,+; 4?’" - -: 4?’" ! -+

液相色谱-串联质谱法测定动物组织中1,2-二苯乙烯类药物残留的研究

DCE!线性方程和检测限

取B+按B+E+E绘制标准曲线系列溶液!F建

立的仪器条件进行测定"分别以选定的定量离

子峰面积R对含量M#$Ka&%做标准曲线!己:#

己烯雌酚&己烷雌酚的标准曲线方程二烯雌酚&

分别为Rh%-!"’Ma%#!&%&Rh(&!"%Ma

相关系数5分别为%,!NN&Rh%N!-,Ma!,!,!!

"d---’&"+----和"+---,"以%倍信噪比为

检出限#!KM^%%种待测药物的检出限达到"+!

a&$‘::"采用空白样品中添加目标化合物的#

方法!按B+得到本方G的方法进行处理和检测!

a&法样品的定量限#为"+低于KM[%N#:$‘:!

欧盟制定的^.B最高限量标准#&+"#:$

a&"‘:%

DCF!离子抑制的影响可以有效地降低离子抑制对检测结构极为相近!果的影响!从而有效地提高定量的准确性"DCG!加标回收率和精密度试验取同一批号的空白猪肌肉和鸡肌肉等动物添加适量混合标准工作液!使^组织!HB&^.B和a&按I.B的加标浓度在"+N!&"#:$‘:之间!B+G的方法处理后进行仪器分析"每个浓度点取N份样品!求其平均回收率!并计算批内相对a&标准偏差"加标浓度为"+N!&"#:$‘:时的回收率结果列于表!"动物组织中^HB&^.B和!!由表!数据可知!a&批内相I.B的加标量在"+N!&"#:$‘:时!对标准偏差小于或等于#+回收率为,"c!#+#c&"+-c"!&DCH!样品分析

应用本方法!对’"份市场随机采集到的猪

其中&份样品检测出含肉和鸡肉样品进行测定!

a&有己烯雌酚!含量为&$‘’+,#&份样品检::’

a&测出含有己二烯雌酚!含量为’+均##:$‘:’为了考察基质离子抑制对定量结果的影响!a&在"+采用N&!+"和&"#:$‘:的添加水平下!空白样品洗脱液加标和标准溶液进行比较!结果表明在进行痕量分析时!样品基质对待测药物的

离子化影响较大!离子化效率在(,c!,Nc之

间"采用同位素稀释技术进行定量时!由于内标

且与%种被测药物结物也存在离子化效率问题!未检出己烷雌酚"该检测结果表明!本方法完全能满足我国对动物组织中&!二苯乙烯类药物!$进行监控的需要"

表D!动物组织中回收率试验结果

,9;J.D!K.6MJ56783.?7:.3N.30I.156<.4

组分

^HB样品基质猪肉

鸡肉

猪肉

鸡肉

猪肉

鸡肉

^.B猪肉

鸡肉

猪肉

鸡肉

猪肉

鸡肉

I.B猪肉

鸡肉

猪肉

鸡肉

猪肉

鸡肉加标(a&%#$‘::#回收率(c#-+!!#&+,!,#+#!##+’!##+-#,+N!-!+’!-’+%!,-+’!#-+%-!+,!&"!+’!&"#+%!&"&+,!&"&+"-,+&!-’+%!#-+’!&"%+&!-N+’--+(!-%+-!&"#+N!&"%+#!-’+,&""+N!&"N+!!-N+%!#,+%!##+’&"%+!!&"&+!!-#+N!-!+"!&"!+(-’+,!-N+’!-’+%!&"%+#!-%+--N+’!-#+#!&"&+N!-N+!!-’+’-’+-!-#+,!-’+-!-(+&!-%+N-’+N!&"!+(!-!+%!&"%+-!&"!+N-#+’!-’+’!&""+!!-%+#!&""+&&"’+%!&",+#!-"+%!&"%+!!&"!+%&"%+!!&"’+N!&"-+&!&""+’!&"N+!&&"+!!&"&+"!&"%+’!&"N+!!&&"+-&"%+N!&"’+%!&"(+N!&"!+%!&""+N#’+N!#,+-!-#+’!-N+%!##+--N+,!-#+%!-&+!!#-+’!&""+%平均回收率(c#N+(#-+&&"&+%-’+%&""+N-N+(&"(+%-,+%-,+N-’+"--+N-,+-&"!+"&"(+-&"’+!&"%+(-&+(-N+"(cYB^N+,,+"N+NN+"N+##+"N+N%+-!+,!+%N+"!+#’+#%+&(+"!+&N+,(+#"+N"+N!+"!+"&"+"&"+""+N"+N!+"!+"&"+"&"+""+N"+N!+"!+"&"+"&"+"

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残留的基体固相扩散气相色谱质谱分析方法研$$

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(&)’!"",!#N!&!N!-$N%%+E!结!论本方法采用同位素稀释结合固相萃取技术!建立了液相色谱串联质谱同时测定动物组织中$违禁药物己二烯雌酚"己烯雌酚"己烷雌酚残留量的方法!同单组分检测相比!有效地缩短了检测时间!节约了检测成本#在本实验的仪器条件下!被测样品中的各组分与样品基质均实现了较好分离!出峰时间合适!检测灵敏度较高#实验表明!该条件易于控制"结果准确"加标回收率稳定"重现性好!适用于动物组织中&!二苯乙烯!$类药物的定性定量测定!为管理部门制定和执行动物源性食品相关安全法规和动物源性食品中有毒有害残留物质监控计划提供了依据#参考文献!$&%*//1661*9*;D4@.5<*@09?*//591D1@6+?*/$!?C/1661*96D0;;W*<‘19*85/@9D*9D4@1/2@/@9$:XCD1*9*;90D1*902<@61X5@/*91D*<19209619D4@:C&&/@/7@<6D0D@619!""N!?*59812^1<@8D1G@-’!%.?’N&+$%卫生部"国家药品监督管理局+农业部&!,’!农业部"号公告’禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录!!"",+$%%>HI)B!]IOKH^JK!O^)O)I!@D02+!ZOB8<@@919*<@6D<*@9186D@<*1X61964@@9X:;:C08418‘@97D4@02180D1*9*;@93/@$219‘@X1//5$ECCE9*6*<7@9D06609X08*/0<16*9W1D409026167E0CEE%0684<*/0D*<04$/0666@8D<*/@D<>+R**X::CECE$

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