鼠伤寒沙门氏菌试验（Ames试验）文献综述

鼠伤寒沙门氏菌试验

文献综述：

鼠伤寒沙门氏菌试验（Ames试验）

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摘要：食品安全无论如何怎样强调都不会过分，迅速而准确地检测致癌物质是食品安全问题

的重要方面。美国科学家Dr. Bruce Ames及其同事创立了一种方法，叫鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验（Ames试验），它是利用一组组氨酸营养缺陷型菌株加入待测物在有或没有微粒体活化系统条件下，发生回复突变的特征鉴定化学物质的诱变活性，现已成为初步筛选化学物潜在致突变的首选方法。 关键词：鼠伤寒沙门氏菌试验；基本原理；一般步骤

1 前言

污染物对人体的潜在危害，引起人们的普遍关注。世界上已发展了百余种短期快速测试法，检测污染物的遗传毒性效应。美国科学家Dr. Bruce Ames等经十余年努力，于1975年建立并不断发展完善的沙门氏菌回复突变试验（亦称Ames试验）已被世界各国广为采用。该法比较快速、简便、敏感、经济，且适用于测试混合物，反映多种污染物的综合效应。

众多学者有的用Ames试验检测食品添加剂、化妆品等的致突变性，由此推测其致癌性；有的用Ames试验检测水源水和饮用水的致突变性（比如，美国派斯净水器就通过了Ames试验），探索较现行方法更加卫生安全的消毒措施；或检测城市污水和工业废水的致突变性，结合化学分析，追踪污染源，为研究防治对策提供依据；有的检测土壤、污泥、工业废渣堆肥、废物灰烬的致突变性，以防止维系生命的土壤受致突变物污染后，通过农作物危害人类；检测气态污染物的致突变性，防止污染物经由大气，通过呼吸对人体发生潜在危害；用Ames试验研究化合物结构与致变性的关系，为合成对环境无潜在危害的新化合物提供理论依据；检测农药在微生物降解前后的致突变性，了解农药在施用后代谢过程中对人类有无隐患；还有用Ames试验筛选抗突变物，研究开发新的抗癌药等等[1]。

2 定义

2.1 回复突变（Reverse mutation）

细菌在化学致突变物作用下由营养缺陷型回变到原养型(prototroph)。 2.2 基因突变 （Gene mutation）

在化学致突变物作用下细胞DNA中碱基对的排列顺序发生变化。 2.3 碱基置换突变 （Base substitution mutation）

引起DNA链上一个或几个碱基对的置换。

碱基置换有转换(transition)和颠换(transversion )两种形式。

转换是DNA链上的一个嘧啶被另一嘧啶所替代，或一个嘌呤被另一嘌呤所代替。 颠换是DNA链上的一个嘧啶被另一嘌呤所替代，或一个嘌呤被另一嘧啶所代替。 2.4 移码突变（ Frameshift mutation）

引起DNA链上增加或缺失一个或多个碱基对。

2.5 鼠伤寒沙门氏菌/回复突变试验（ Salmonella typhimurium/reverse mutation assay） 利用一组鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型试验菌株测定引起沙门氏菌碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的组氨酸缺陷型(his-)转变为原养型(his+)回复突变的试验方法。

3 原理

鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅

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鼠伤寒沙门氏菌试验

少数自发回复突变的细菌生长。假如有致突变物存在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型，因而能生长形成菌落，据此判断受试物是否为致突变物。即利用是否能引起鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型（hisˉ）菌株的回复突变来判断化学物质是否诱变剂和致癌剂，并能区别突变的类型（置换或移码突变）。（如图a图b[2]所示）

需要说明的是：某些化学物质需经代谢活化才有致变作用，而细菌没有这种酶系统，故在测试系统中加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备的S9混合液，可弥补体外试验缺乏代谢活化系统之不足，同时增加检测的灵敏度。

图a 图b

注：图a和图b分别为未加入致突变物质的培养皿和加入致突变物质的培养皿，两培养皿中的菌株均为鼠伤寒沙

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门氏菌（Salmonella typhimurium）的组氨酸营养缺陷型（his）菌株。可以看出，在含微量组氨酸的培养基中，除极少数自发回复突变的细胞外，一般只能分裂几次，形成在显微镜下才能见到的微菌落（图a）。而在受诱变剂作用后，大量细胞发生回复突变，自行合成组氨酸，发育成肉眼可见的菌落（图b）。鉴于化学物质的致突变作用与致癌作用之间密切相关，故此法现广泛应用于致癌物的筛选。

4 试验前的准备工作

4.1 仪器与设备

培养箱、恒温水浴、振荡水浴摇床、压力蒸汽消毒器、干热烤箱、低温冰箱(-80℃) 或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、混匀振荡器、匀浆器、菌落计数器、低温高速离心机，玻璃器皿等。 4.2 试验菌株

采用TA97、TA98、TA100和TA102一组标准测试菌株。

生物学特性鉴定

新获得的或长期保存的菌种，在试验前必须进行菌株的生物特性鉴定。菌株鉴定的判断标准，如表1所示。

表1 试验菌株鉴定的判断标准

菌株 TA97 TA98 TA100 TA102 注 组氨酸 缺陷 + + + + “+”表示需要组氨酸 脂多糖屏障缺损 + + + + 氨苄青霉素抗性 + + + + 切除修复缺损 + + + - “+”表示具有△uvrB突变 四环素 抗性 - - - + “+”表示具有pAQ1质粒 自发回变菌落数* 90-180 30-50 100-200 240-320 *在体外代谢活化条件下自发回变菌落“+”表示具“+”表示具有rfa突变 有R因子 - 2 -

鼠伤寒沙门氏菌试验 数略增 4.3 大鼠肝微粒体酶的诱导和S9的制备 4.3.1 诱导

最广泛应用的大鼠肝微粒体酶的诱导剂是多氯联苯（PCB混合物），选择健康雄性大鼠体重200g左右，一次腹腔注射诱导剂，剂量为500mg/kg体重。诱导剂溶于玉米油中，浓度为200mg/mL。苯巴比妥钠和β-萘黄酮结合也可作为诱导剂。 4.3.2 S9制备

动物诱导后第五日断头处死。处死前12h停止饮食，但可自由饮水。首先，用75%酒精消毒动物皮毛，剖开腹部。在无菌条件下，取出肝脏，去除肝脏的结缔组织，用冰浴的0.15mol/L氯化钾溶液淋洗肝脏，放入盛有0.15mol/L氯化钾溶液的烧杯里。按每克肝脏加入0.15mol/L氯化钾溶液3mL。用电动匀浆器制成肝匀浆，再在低温高速离心机上，在4℃条件下，以9000g离心10min，取其上清液（S9）分装于塑料管中。每管装2 mL ~3 mL。储存于液氮生物容器中或-80℃冰箱中备用。

上述全部操作均在冰水浴中和无菌条件下进行。制备肝S9所用一切手术器械、器皿等，均经灭菌消毒。S9制备后，其活力需经诊断性诱变剂进行鉴定。 4.4 溶剂的选择

如果受试物为水溶性，可用灭菌蒸馏水作为溶剂；如为脂溶性，应选择对试验菌株毒性低且无致突变性的有机溶剂，常用的有二甲基亚砜（DMSO）、丙酮、95%乙醇。一般操作中，为了减少误差和溶剂的影响，常按每皿使用剂量用同一溶剂配成不同的浓度，固定加入量为100?l。

4.5 剂量的设计

决定受试物最高剂量的标准是对细菌的毒性及其溶解度。自发回变数的减少，背景菌变得清晰或被处理的培养物细菌存活数减少，都是毒性的标志。

对原料而言，一般最高剂量组可为5mg/皿。对产品而言，有杀菌作用的受试物，最高剂量可为最低抑菌浓度，无杀菌作用的受试物，最高剂量可为原液。受试物至少应设四个剂量组。每个剂量均做三个平行平板。

5 试验操作一般步骤

5.1 增菌培养

取营养肉汤培养基5mL，加入无菌试管中，将主平板或冷冻保存的菌株培养物接种于营养肉汤培养基内，37℃振荡（100次/min）培养10h。该菌株培养物应每毫升不少于1～2×109活菌数。

5.2 平板掺入法

实验时，将含0.5mmol/L组氨酸- 0.5mmol/L生物素溶液的顶层琼脂培养基2.0mL分装于试管中，45℃水浴中保温，然后每管依次加入试验菌株增菌液0.1mL，受试物溶 液0.1mL和S9混合液0.5mL（需代谢活化时），充分混匀，迅速倾入底层琼脂平板上，转动平板，使之分布均匀。水平放置待冷凝固化后，

倒置于37℃培养箱里孵育48h。记数每皿回变菌落数。（参见图c）图c 鼠伤寒沙门氏菌试验过程

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鼠伤寒沙门氏菌试验

实验中，除设受试物各剂量组外，还应同时设空白对照、溶剂对照、阳性诱变剂对照和无菌对照。

6 数据处理和结果判断

记录受试物各剂量组、空白对照（自发回变）、溶剂对照以及阳性诱变剂对照的每皿回变菌落数，并求平均值和标准差。

如果受试物的回变菌落数是溶剂对照回变菌落数的两倍或两倍以上，并呈剂量-反应关系者，则该受试物判定为致突变阳性。

受试物经上述四个试验菌株测定后，只要有一个试验菌株，无论在加S9或未加S9条件下为阳性，均可报告该受试物对鼠伤寒沙门氏菌为致突变阳性。如果受试物经四个试验菌株检测后，无论加S9和未加S9均为阴性，则可报告该受试物为致突变阴性。

7 Ames试验的应用

7.1 Ames试验对特殊用途化妆品致突变性的研究[3]

广东省疾病预防控制中心的何冬梅、王建、严纪文等人采用鼠伤寒沙门菌/回复突变试验检测染发类育发类、美乳类及健美类等特殊用途化妆品的致突变性。

其结果为：在受试的237份特殊用途化妆品中，染发剂的阳性率为3182%，且阳性者均为氧化型染发剂。育发类、美乳类及健美类产品均未出现致突变阳性。染发剂主要引起试验菌株TA97、TA98、TA100回变率明显升高，引起试验菌株回变率升高的剂量范围是125~5000μg/皿。

该试验的结论：部分染发类产品具有致突变作用，可对健康产生危害。 7.2 Ames试验在水质检测方面的应用[4]

广州市自来水公司的林朝晖质采用Ames试验，对珠江流域主要取水点的水源水和对应自来水中的有机致突变物污染情况进行了研究。

研究表明，部分取水点的有机致突变物污染较严重，并且氯化消毒后自来水的致突性大于水源水的致突性。因而，加强饮水中致突变物质的检测，改进净水消毒剂和净水流程很有必要。

7.3甘蓝红色素的毒理学试验研究[5]

云南省疾病预防控制中心的耿菊敏、秦光和刘敏等人按卫生部GB15193-1994食品安全性毒理学评价程序和方法进行了①急性经口毒性试验；②鼠骨髓细胞微核试验；③小鼠精子畸形试验；④Ames试验；⑤30d喂养试验以及⑦致畸试验等多项试验来研究甘蓝红色素的安全性。其中Ames试验未见明显毒性反应。

8 展望

8.1 Ames试验的优缺点

Ames试验的优点是，方法灵敏，检出率高，经试验有90％的化学致癌物经都可获得阳性结果；加之方法比较简便、易行，不需特殊器材，容易推广。

但是Ames试验也存在这缺陷。其缺点是，微生物的DNA修复系统比哺乳动物简单，基因不如哺乳动物多，不能完全代表哺乳动物的实际情况。同时，据文献报道，应用Ames试验平扳掺入法严重不足之点是被测化学物、S9液、组氨酸加进顶层后可能扩散到底层去，它们的浓度有随时间延长而下降的趋势，从而影响实验结果，如要提高测试物浓度，其毒性可能威胁细菌的生存 。 8.2 Ames试验的改进

尽管如此，由于存在着上述的优势，故目前在致突变试验中占重要位置，为首选的试验方法。

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鼠伤寒沙门氏菌试验

与此同时，不少同仁也结合其他的方法，使得Ames试验的结果更加精确可靠。 比如，华东师范大学生命科学学院李伟民、孙峰、米琴等人采用生物发光检测法进行Ames试验的研究[5] 即他们将自行构建的含有青海弧菌荧光酶基因的质粒pACYCL184引入Ames试验的4个菌株TA97、TA98、TA100、TA102中，构建成能够生物发光的工程菌，分别命名为TAL97、TAL98、TAL100、TAL102。

实验表明，该4株工程菌保持原出发菌株所具有的与Ames试验相关的性状，对各类致突变剂有良好的反应，且可用平皿计数法进行致突变试验。其发光值与致突变剂浓度存在良好的量效关系，故可用发光检测取代原Ames试验的平皿计数，使检测更简单、方便、快速。

再比如，黄燕、钟振国、罗沛等人在蒲葵子提取物致突变试验中使用了两种Ames试验方法来研究该方法的灵敏度[6]。即是说对蒲葵子用正丁醇浸提，他们用Ames试验方法（掺入法）与彷徨试验方法，对TA100鼠伤寒沙门氏菌株进行致突变试验。结果为两种试验方法结果显示，蒲葵子正丁醇提取物在5—500μg/ml剂量范围，以Ames试验方法与彷徨试验均检测出阳性结果，而在0.025μg/ml 与0.5μg/ml 剂量下，彷徨试验能检测出阳性结果，而Ames方法未检测出阳性结果。结论在较低浓度时，彷徨试验能检测出Ames试验检测不出的阳性结果，表明彷徨试验灵敏度较Ames试验高。

彷徨试验（Fluctuation test)是由Green等(1976)发明的，经Ames试验的改良的一种方法。它用液体培养基代替固体培养基，以观察培养管浊度或pH指示剂颜色的变化代替菌落计数，用试管代替培养皿。通过直观地对各试管中液体颜色变化的计数，再利用公式对组间进行χ2检验，其结果判定简单、直观、明确、可靠。其检测效力已被许多研究者所证实。

1978年Gatehouse将其改进为彷徨试验方法，通过了解到该方法与常用的筛选致突变物试验Ames试验（掺入法）比较，有如下的优点：①有较高的敏感性，可以检测出诱变性较弱的致突变物，从而避免因方法灵敏性较差而造成的假阴性结果。②样品、试剂消耗量少，可同时进行数个样品的检测。

彷徨试验所用菌株为TA100，该菌株可用来检测点突变和移码突变[7]，该菌株在无外源性组氨酸供给的情况下不能生长繁殖，但当发生回复突变时则可在无外源性组氨酸供给的情况下生长繁殖。由于一些外源性化学物需经体内代谢活化才具有诱变活性或经代谢而解毒，为了模拟哺乳动物对外源性物质的体内代谢活化过程，提高测试的准确性，通常在Ames试验中添加哺乳动物肝微粒体酶制剂（S9）作为外源性物质代谢活化系统。彷徨试验能够灵敏、迅速地检测到基因的突变情况，是基因突变检测的主要方法之一。

但彷徨法操作费时，一般可作为Ames试验的补充方法。不得不承认的是，这两种方法对人和动物的体液监测，环境致突变因素的研究及流行病学调查中潜在致癌物的检测具有十分重要的作用。

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鼠伤寒沙门氏菌试验

参考文献

[1] 百度百科.ames试验.http://baike.http://www.wodefanwen.com//view/1690651.htm.[EB/OL]

[2] 纽芬兰大.http://www.mun.ca/biology/scarr/Bio4241_Ames_Test_1.html.[EB/OL]

[3] 何冬梅，王建，严纪文，赖蔚苳.Ames试验对特殊用途化妆品致突变性的研究[J].中国卫生检验杂志2007,17,(11)：1956—2004.

[4] 林朝晖. Ames试验在水质检测方面的应用[J]. 微生物学通报.2002,29(3):66—70.

[5] 李伟民，孙峰，米琴，景奉香，朱文杰.采用生物发光检测法进行Ames试验的研究[J].应用与环境生物学报2006, 12 (5): 722—725.

[6] 黄燕，钟振国，罗沛. 两种Ames试验方法在蒲葵子提取物致突变试验中灵敏度的研究

[7] Ordaz-Pichardo C, etal. Antiamoebic and toxicity studies of a carbamic acid Derivative and its the rapeutic effect in a hamster model of hepatic amoebiasis[J].Antimicrob Agents Chemother,2005,49(3):1160.

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/9uov.html