流式细胞

写在课前的话

流式细胞术融合了流体动力学、激光技术、电子工程、计算机技术和单克隆抗体染色技术等多学科的知识，成为一个专门的领域。它不仅应用于细胞生物学、植物学、分子生物学、生物化学、微生物学等理论科学的研究，以及血液学、免疫学、病理学、肿瘤学、遗传学等临床医学的疾病诊断和治疗，而且可以应用于农林畜牧养殖业及环境、食品、药品等检测等，因此学习其原理极其重要。

一、流式细胞术概念 (一) 概念

流式细胞术(Flow Cytometry，FCM):是上世纪70年代的一项高新技术，是利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。其研究对象为生物颗粒，包括各种动物植物细胞、微生物及人工合成微球等。研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并同时进行定量的一项技术。目前这项技术已广泛应用于生物学和医学的各个领域，已成为细胞学分析领域中不可替代的重要工具。

(二) 流式细胞术的特点

1. 快极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪（Flow cytometer）可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。

2. 准可同时分析单个细胞的多种特征，当同时用多种分子探针，如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，即可获得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识别、计数更为准确。

3. 精通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度、酶活性以及细胞的功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析。

（三）流式细胞术（Flow Cytometry ，FCM ）操作流程

流式细胞术的操作流程简单概括为：培养细胞、新鲜组织、石蜡包埋组织、骨髓、外周血、脱落细胞等不同类型的样品。首先制备成单细胞悬液后，再经过荧光染色就可以上机进行检测。如果需要分选，可以通过细胞分选把感兴趣的细胞分选出来进行进一步培养或者进行其他生物学行为的研究。

二、流式细胞仪构成及工作原理简介 （一）流式细胞仪（Flow Cytometer)

集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。经过几十年的发展，流式细胞仪在相关技术的迅猛发展下，目前它的操作越来越简单，功能会越来越强大，已经成为实验室必不可少的栋梁设备之一。

（二）流式细胞仪检测范围

流式细胞术的检测范围很广，从细胞结构来看可以检测细胞大小、细胞粒度、细胞表面面积、核浆比例、DNA含量与细胞周期、RNA含量、蛋白质含量等。从细胞功能来看它可以检测细胞表面、细胞胞浆、细胞核的特异性抗原，检测细胞内的细胞因子、细胞活性，检测细胞的酶活性、细胞激素结合位点以及细胞受体等。

（三）流式细胞仪种类

目前市场上的流式细胞仪主要有两大公司，即贝克曼公司和BD公司。两大公司有不同种型号的流式细胞仪可供选择。这种这些不同种类的流式细胞仪分为两大类：第一种是临床型的流式细胞仪。这类的流式细胞仪体积比较小，功能相对简单，固定光路，而且操作也比较简单，适合临床细胞表面分型样品的检测和DNA分析。第二类流式细胞仪是科研型的，这类仪器体积比较庞大，操作比较复杂，功能也很多，除了具有临床型仪器的功能以外，还又具有许多科研功能：细胞内pH、膜电位、染色体核型分析等，以及分选功能。

流式细胞仪的种类及各型特点？

（四）流式细胞仪的组成部分

流式细胞仪由四个系统组成，包括光学系统、液流系统、电子系统和细胞分选系统。细胞分选系统是科研型仪器才具有的功能。光学系统包括激光光源、光束成形和收集系统。液流系统包括流动室、液流驱动系统。电子系统包括光电转换、数据处理系统。为了对流式细胞仪的工作原理有更好的理解，下面简单介绍各个系统的功能。

1. 光学系统

光学系统包括激光光源、光束成形和光收集系统。它的工作原理是激光通过光束成形、整形和聚焦，细胞产生散射光信号和荧光信号，这些光信号通过光收集系统的分离到达各自的检测器进行检测。

1.1 激光光源

目前流式细胞仪都是采用激光作为激发光，因为激光具有单波长、高强度、高稳定性的特点，多采用氩离子激光器或者氦氖激光器作为激发光，一般选配2—4根激光，常用的有488nm蓝光、633nm红光和355nm和407nm的紫外激发光，目前的大型流式细胞仪最多能够检测13个荧光参数。

1.2 光束成形、收集系统

光束成形和光收集系统由若干组的透镜、滤光片和小孔组成。透镜主要是使光线整形和聚焦，滤光片和小孔的作用主要是去除干扰信号。滤光片是将不同波长的荧光信号送到不同的电子探测器，滤光片是光收集系统的重要组成部分，主要分成3类，包括：长通滤片、短通滤片和带通滤片。

长通滤片(long-pass filter，LP)缩写为LP，它只允许特定波长以上的光束通过，特定波长以下的光束不能通过。如LP500，是一个长通滤光片，它允许500nm以上的光束通过，500nm以下的光束是不能通过。

短通滤片（short pass filter, SP）缩写为SP，它只允许特定波长以下的光束通过，特定波长以上的光束不能通过。如SP500，是一个短通滤光片，它只允许500nm以下的光束通过，500nm以上的光束不能通过。

带通滤光片（band pass filter, BP）缩写为BP，它只允许一定波长范围内的光束通过。一般在这种滤光片上面标注两个数，前面一个数是代表

这种滤光片能允许通过的光束的波长的中心值，后面这个数代表的是允许通过光束的波长范围。BP500/50，是说这个带通滤光片它能允许通过的波长范围为475—525，允许波长中心值为500nm。

2. 液流系统

液流系统包括流动室、鞘液、样本流和液流驱动系统。流动室是流式细胞仪的核心部分，在流动室里面激光和检测样品

相交。鞘液就是工作液，可以选择磷酸盐缓冲液、血球稀释液或蒸馏水作为工作液。在仪器运行的时候，工作液就像刀鞘一样包裹着样本流接受激光的照射，所以工作液就被形象地称为鞘液。样本流必须是单细胞悬液，最佳浓度为5?10???1?10/mL。右图显示仪器运行的时

5

6

候鞘液包裹着样本流，使细胞单行排列接受激光的照射，这样不仅保证了仪器的检测精确度，同时也避免了样本阻塞在喷孔。

3.电子系统

电子系统包括光电转换器、前置放大器、模数转换电路和数据处理系统。光电转换器的作用是将光信号转为电流信号。光电转换器包括光电二极管和光电倍增管。光电二极管主要是用于检测前向散射光，光电倍增管用于检测侧向散射光和荧光信号。前置放大器的作用是将电路信号转为电压信号，同时将信号放大。它包括有线性放大器和对数放大器。模数转换电路的作用是将电压信号转换为负值信号，然后把信号输入电子计算机。

4.细胞分选系统

细胞分选系统是科研型流式细胞仪才具有的功能。图显示左边是一个四路分选，右边是一个96孔板的分选。

4.1 分选的基本原理

流式细胞仪的分选是指从细胞群体中分离出感兴趣的细胞，检测的任意参数都可作为分选时指定细胞的依据。分选的方式有捕获式分选和电荷式分选，目前应用最多的是电荷式分选。

4.1.1电荷式分选

电荷式分选的原理是当单细胞悬液形成液柱通过流动室时，液柱就被分割成一连串均匀的液滴，液滴首先接受仪器的检测，检测后细胞就很快被逻辑电路判断是否满足分选条件。如果满足分选条件，细胞会被充电带上不同的电荷，而未满足分选条件的细胞则不被充电。当细胞通过两个高压电极板形成的静电场的时候，带电的细胞会在静电场中发生不同方向的偏转，然后落入收集器中，而其他不带电的细胞则落入废液槽，从而完成分选的目的。

4.2 流式细胞术分选指标

细胞分选对仪器的性能要求较高，分选是流式细胞仪的重要功能之一，分选功能的装置较为复杂。分选的指标为分选速度、分选纯度和分选收获率。

分选速度是每秒可分离所要细胞的个数，一般要求分选速度至少达5000个/秒左右。 分选纯度是指被分选出的细胞所占百分比，分选纯度与仪器配置和细胞是否重叠有关。 分选收获率是指被分选出来的细胞占原来溶液中该细胞的比例。通常情况下，分选纯度和收获率是相互矛盾。当提高分选纯度的时候，分选收获率下降，如果提高分选收获率则纯度又会下降。

综上所述，流式细胞仪的工作原理概括起来就是样品在一定压力的带动下，进入了流动室，鞘液在高压的作用下从鞘液管喷出，鞘液包裹着样本流，使样本流里的单细胞悬液，单细胞呈单行排列，接受激光的照射，激光通过聚焦镜片的整形和聚焦照到细胞上，细胞产生了散射光信号和荧光信号。在与激光平行和垂直的方向上分别放了许多光学元件和光信号监测器，其中在激光束平行的方向上放置的是光电二极管，它主要用于检测前向角散射光，与这束光垂直的方向上放置的是光电倍增管，它用于检测侧向散射光和荧光信号。荧光信号的强度是跟细胞的抗原表达强度或者是物质内的浓度相关，如果需要进行进一步分选则细胞被检测后很快被逻辑电路来判断是否满足分选条件，如果满足分选条件的话就被充电，当充

电的细胞通过两个高压电极板的静电场的时候，带电的细胞就发生了偏转，

落入了分选槽中，而不带电的细胞落入了废液槽中，从而达到分选的目的。

三、流式细胞仪的光信号检测

（一）流式细胞仪可告诉我们一个细胞的什么指标?

细胞被激光照射后产生散射光信号和荧光信号，其中前向角散射光主要是与细胞的大小相关，简称FSC。而侧向角散射光是与细胞的相关颗粒性及内部结构的复杂性有关，荧光强度反应的是细胞的抗原表达强度或者是细胞内部物质的浓度。

右图是外周血红细胞溶解后的细胞散射光双参数散点图。横坐标是侧向散射光，越往右细胞的颗粒度越强，纵坐标是前向角散射光，越往上细胞越大，根据前向和侧向散射光细胞被分为四个群，包括碎片、淋巴细胞群、单核细胞群和粒细胞群。

（二）荧光信号检测

荧光信号包括自发荧光和特异荧光。自发荧光就是细胞自己本身发出来的微弱的荧光，而特异性荧光是指细胞表面的抗原(或细胞膜受体)与相关的荧光抗体结合，形成带有荧光的抗原抗体复合物。通过流式细胞仪测定其荧光量，即可得到细胞群的不同抗原位点表达情况。

（三）荧光信号的产生

荧光是如何产生的呢？荧光在接受激光照射后吸收了光量子，属于激发态，当从激发态回到基态的时候会释放出能量，这部分能量以光的形式发射出来，这部分光称为荧光。

（四）信号检测--荧光信号

在实际分析时会使用多种荧光抗体来进行染色，做多色分析。如右图蓝色部位所示：细胞包倍三种荧光抗体，在接受488nm激光照射后产生了三种不同的荧光信号。右图白色部分是细胞包倍了两种荧光抗体，分别是FITC连接的CD3单克隆抗体和PE连接的抗CD19单克隆抗体。通过荧光参数散点图可以来分析这两种细胞的CD3和CD4的抗原表达情况。

（五）荧光信号的特征

发射光的荧光强度是与结合位点成正比，如果结合位点越多，荧光强度就越强，结合位点越少，荧光强度就越弱。

（六）荧光染料

荧光染料对于流式细胞的分析结果是至关重要的，理想的荧光染料包括以下四个方面：首先是荧光染料需要尽可能有高的光子产量，以提高信号强度。第二是它要对激发光有较强的吸收，从而能降低背景噪音。第三是激光光谱与发射光谱之间要有尽可能大的间隔，以减少背景信号对荧光信号的干扰。最后是要易于与被标记的抗原、抗体或者其他生物物质结合，同时不会影响被标记物的特性。

1.常用荧光染料

上图是常用的荧光染料，其中FITC、PE、PECY5和PI都是用488nm的蓝光激发的，APC是要用633nm的红光激发。PI这种荧光染料主要用于细胞周期分析以及死活细胞鉴定。

1.1标记抗体常用荧光素 FITC

FITC（异硫氰酸荧光素）是目前应用最广的一种荧光素，，它的发射光峰值接近于525nm，价格相对便宜。

1.2标记抗体常用荧光素 PE

PE（藻红蛋白）它的发射光峰值接近于575nm，激发效率最好，所以它的信号是最强的，检测某些弱表达的抗原时，推荐使用这种荧光素。它的价格要比FITC昂贵。

1.3标记抗体常用荧光素 PE-Cy5

PE-Cy5（藻红蛋白-花青苷5.1）它的发射光峰值接近于667nm，激发效率也比

较高。目前FITC、PE、PE-Cy5三者是流式细胞最为常用的荧光素，并且经常将三者共同使用进行三色分析。

1.4标记抗体常用荧光素 PE-Cy7

PE-Cy7（藻红蛋白-花青苷7）是一种复合荧光素，它是2000年以后被开发出来的，它的激发效率也比较好，发射光峰值接近于767nm。

（七）荧光补偿

荧光补偿是流式细胞术里比较重要的一个概念，常用荧光染料中荧光染料的发射峰值各不相同，但实际上一种荧光染料不止发出一个波长，而是一定范围的波长，只是

其中一部分要比其他染料亮。如右图中所显示的这四种荧光染料它们在发射峰值的附近信号最强，虽然它们的发射峰值不相同，但是由于它们发射光谱比较宽，那么导致互相之间光谱有重叠，尤其是FITC，它的发射光谱最宽，与其他的那三种染料的发射光谱都有不成程度的交叉。一般都是在做两色以上的分析时候都会存在这种光谱交叉现象。

而带通滤片接受的是一定带宽波长的荧光，因而就会有一定的干扰光同时被接受，然后一同进入PMT进行光电转换并放大。例如在分析FITC和RD1这两种荧光染料的荧光信号时，由于FITC发射光谱比较宽与RD1有重叠，就导致在接受RD1发射光的这组滤光片同时在接受一部分 FITC的干扰光。因而干扰光和检测信号会一同进入光电倍增光进行放大，如果不处理必然导致结果存在误差。荧光补偿的概念，就是用电子的方法校正荧光染料之间光谱重叠所造成的误差，流式在完成双色以上荧光标记的样本时，都需要作颜色补偿。补偿的方法是首先将仪器的所有补偿调为0，然后调节电压，调节电压是用同型对照或者阴性对照调节，然后是阴性群位于“做左下角”，然后再用单阳性的样本管调节荧光补偿。

关于荧光补偿方法描述错误的是（）

A. 是首先将仪器的所有补偿调为0 B. 是首先将仪器的所有补偿调为1 C. 然后调节电压

D. 调节电压是用同型对照或者阴性对照调节 A. 是首先将仪器的所有补偿调为0

B. 是首先将仪器的所有补偿调为1

C. 然后调节电压

D. 调节电压是用同型对照或者阴性对照调节

流式细胞术不仅可以测量细胞大小，内部颗粒的形状，还可以检测细胞表面

的DNA,RNA的含量，可以对群体细胞在单细胞水平上分析，在短时间内分析大量细胞，并收集，储存和处理数据。在血液，免疫，肿瘤，分子生物学等领域应用。固

掌握其原理和方法极其重要，同时要注重仪器的保养。

四、流式细胞术的数据采集与分析 （一）流式细胞术的设门

在细胞分布图中确定一个范围或一片区域，对其中的细胞进行单参数或多参数分析。形状包括：线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门、四象限门。

（二）流式细胞术数据显示类型

流式细胞术的数据一般都是用图形的方式来显示。包括单参数直方图、多参数二维散点图、二维等高线图、密度图、三维立体图等等。

（三）数据显示类型

右图是两个单参数直方图。直方图的X轴代表荧光信号或者散射光信号的强度，用“通道数”表示，它可以与光强度之间呈线性关系或者对数关系。具体要取决放大器的性质。Y轴代表通道内所出现具有相同光信号特征性的细胞频率，一般是细胞的相对数。

右图是二维散点图。二维散点图是分析数据时的主要表达方式，任选两个参数就

可以构成一个二维散点图，左侧是一个前向和侧向散射光散点图，右边是一个荧光双参数图。这是一个淋巴细胞亚型的分析流式图。首先通过前向、侧向散射光靶细胞分群，然后再通过R1门把感兴趣的细胞分出来。这个门所圈的就是淋巴细胞。然后再分析R1门内细胞的CD3、CD4表达情况。双参数散点图的缺点是如果许多细胞有相同的二维坐标，则在点图上只呈现一个点。此时细胞在该处是均匀分布，还是另有精细结构都难以知道，为此又研究出了等高

线图。

上图左侧是一个二维等高线图。是一种可以同时表达检测参数又表达细胞频度的方式，类似于地图中的等高线。它是把代表相同细胞数目的点依次连接起来形成密闭曲线，连接在里面的曲线代表细胞数目越多，曲线变化越快的地方表示这个地方细胞数目变化越快。右侧图是一个密度图，它的依据是细胞分布的密度大小，细胞密度大的地方点的密度就大，细胞密度小的地方点的密度就小。这样使数据的显示更加直观。

上图的左侧是一个假三维图，它是利用计算机软件技术在二维图上双参数的基础上，以细胞数目为Z轴展示立体的二维细胞分布，实际上还是一个二维图。所以就称为假三维图。右侧图是三维图，正前方的参数作为X、Y和Z就构成一个三维图，三维图对复杂的细胞亚型分析更为直观准确。但对其数据的统计分析比较难。

五、流式细胞术影响因素及注意事项 （一) 抗体使用原则

与其他技术相比，流式细胞术的操作相对复杂，它在设计选择样本前注意仪器调适、数据分析等方面都有很多的因素，都有可能影响结果的准确性。首先是荧光抗体的选择。流式细胞对于抗体的选择具有很严格的要求，一般遵循以下三项原则：第一是要根据仪器的型号和抗原表达强弱合理选择荧光抗体。第二是低表达抗原标记要选择高信噪比的荧光素，如PE、APC。在使用双标以上的抗体必须要做荧光补偿。

（二）单细胞悬液制备

流式细胞术的测定对象是单细胞或者是单个颗粒，所以能否制备出合格的单细胞悬液是关系最终分析结果准确与否的关键。单细胞悬液来自于动植物的不同组织器官，也可来自于非生物样本，生物样本主要来自于培养细胞、血液、新鲜实际组织以及石蜡包埋组织等。不同的组织有不同的单细胞分散方法，理想的状态是既要达到分离细胞的目的又要不损伤细胞。同时还要避免细胞粘连、细胞团块。粘连的细胞存在会改变细胞群体的分置分布，较大细胞的团块会阻塞喷孔，这样会阻挡鞘液流动，影响仪器的正常运转。

（三）样品荧光标记的影响因素

在荧光染色的时候也有很多影响因素，主要有温度、PH值、固定剂、非特异荧光等。温度方面如果温度升高则荧光淬灭的可能性就增大，所以荧光染色的时候一般要求温度在20℃左右。PH值改变会造成荧光光谱改变，从而影响荧光的强度。而某些固定剂与细胞的某些物质结合后，会干扰荧光染料与细胞成分的结合，而造成荧光强度改变。而对于某些非特异性的荧光如果不消除会使检测结果假性升高。

（四）流式细胞仪注意事项

在仪器方面也有一些注意事项。首先是环境方面，一般要求仪器放置的环境温度在20～25℃之间，适度在30%—40%之间。实验室要尽量减少灰尘和烟尘。仪器每天都要进行校正，定期进行光路和流路的校准，还需要进行不同仪器间和不同实验室间的数据比对。在上机的时候，最重要的是设置同型对照，以去除非特异性荧光的干扰，如果能有质控一定要进行全程质控，以保证结果的准确性。在获取实验数据前要先调节仪器，分析实验数据的时候，要根据实验目的来决定分析的模型。仪器保养方面要做好仪器的日保养、周保养和月保养，这样才能保证结果的准确性，降低仪器的故障率，延长仪器的使用寿命。

流式细胞术不仅可以测量细胞大小，内部颗粒的形状，还可以检测细胞表面

的DNA,RNA的含量，可以对群体细胞在单细胞水平上分析，在短时间内分析大量细胞，并收集，储存和处理数据。在血液，免疫，肿瘤，分子生物学等领域应用。固掌握其原理和方法极其重要，同时要注重仪器的保养。

写在课前的话

流式细胞术（Flow CytoMeter，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，能高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。随着对FCM研究的日益深入，其价值已经从科学研究走入了临床应用阶段，在我国临床医学领域里已有着广泛的应用。可用于白血病的分型、肿瘤细胞染色体的异倍性测定，以及免疫学研究，并已开始用于细菌鉴定，病毒感染细胞的识别和爱滋病感染者T4、T8细胞的记数。

一、诊断性指标

流式细胞术提供的临床诊断性指标主要有：第一，免疫表型分型，免疫表型分型主要是用来诊断和监测白血病和淋巴瘤。第二，CD55和CD59，主要用来诊断和鉴别诊断阵发性睡眠性血红蛋白尿。第三，HLA-B27的检测，主要用来诊断强直性脊柱炎。第四，肺泡灌洗液（BALF）T细胞亚群的检测，可以用于诊断结节病和特发性肺间质纤维化，并与其它疾病进行鉴别。第五，网织红细胞，通过网织红细胞的检测可以用于贫血的诊断。第六，胎儿血红蛋白（HbF）的检测，可以用来诊断β珠蛋白生成障碍性贫血和异常血红蛋白病。第七，血小板膜糖蛋白的检测，血小板GPIIb/IIIa用于血小板无力症的检测；血小板GPIb/IX，

用于巨大血小板综合征的检测。第八，血小板表面的免疫球蛋白PAIg，IgG、 IgM、IgA等免疫球蛋白可以用来诊断特发性血小板减少性紫癜。

（一）免疫表型分型

1.白血病和淋巴瘤免疫表型分析

目前,白血病和淋巴瘤免疫表型分析已被纳入了WHO MICM分型方案中.MICM中“M”指形态学，“I”指免疫学方法，“C”指细胞遗传学，“M”指分子生物学， WHO倡导将形态学、免疫表型分析、细胞遗传学和分子生物学综合起来，对白血病和淋巴瘤进行诊断。免疫表型分析是诊断和鉴别诊断白血病和淋巴瘤的一个重要检测手段。在诊断急性淋巴细胞白血病时，镜下的形态学很难区分白血病类型及亚型，但是临床上对于不同类型白血病的治疗方案又是不同的。所以就要靠免疫表型分析，根据白血病细胞上的抗原表达特性来进行鉴别。

2.CD45/SSC设门法的优势

流式细胞术检测免疫表型分析能够在临床上得到认可，主要是因为设门方案出现了很大的变化，目前采用的设门方案是CD45/侧向散射光（SSC）设门法。而传统的白血病免疫分型用的是前向角对侧向角散点图的设门法。

如图1所示，图（左）白血病细胞成为一个单一的群体，很难区分原始或病态的白血病细胞和成熟的细胞。但是通过CD45和（SSC）设门法之后（图右），看到图（左）无法区分细胞被分成了五群。在这五群中，成熟细胞CD45表达的荧光比较强。A门里是淋巴细胞，B门里是单核细胞，C门里就是粒细胞群，D门里是原始细胞，一般CD45表达较弱。一些细胞碎片、红细胞和转移来的瘤细胞，由于不表达CD45，可能位于D门、D门偏下或者E门的位置。CD45结合侧向散射光之后能把白血病细胞找出来，减少了其它细胞的干扰。对D门里的白血病细胞做进一步的分型，就能准确看到白血病细胞群免疫分型的表达情况。

图1

3.白血病的特异性标志

免疫表型分析主要是根据细胞的特异表面标志，把白细胞分成T细胞、B细胞和原始细胞。

T淋巴细胞白血病一般表达的分化抗原有胞浆内的cCD3、抗TCRαβ、抗TCRγδ、CD2、CD5、CD8 、CD10和CD7；B淋巴细胞白血病一般表达的分化抗原有胞浆内的cCD79a、CD22、CD19 、CD10和CD20；髓系白血病一般表达的分化抗原有胞浆内的cMPO、CD117、CD13、CD33、CD14、CD15和CD64；NK淋巴细胞白血病一般表达的分化抗原有CD16、CD56和CD57；红白血病一般表达的分化抗原有GlyA和CD36；巨核细胞白血病一般表达的分化抗原有CD41、CD42和CD61；一系列非特异标志在不同的白血病中可能都有表达，尤其是表达在早期的造血干组细胞上，一般表达的分化抗原有CD34和HLA-DR。

其中，对T淋巴细胞白血病来讲比较特异的是胞浆内的CD3，当胞浆内CD3出现阳性的时候，高度怀疑是T淋巴细胞白血病。对于B淋巴细胞白血病来讲，胞浆内的CD79a和CD19是比较特异的，cCD79a最具特异性。cCD3和cCD79a分别表达于早期T细胞和B细胞。cMPO是髓系特异标志。

如图2所示为B-ALL的表达图。白血病免疫分型采用的是CD45和侧向散射光的设门方案，通过CD35和侧向散射光设门可以准确地找到一群CD45表达较弱的白血病细胞，也就是D门里的细胞。把D门的细胞再做进一步的分型，发现表达CD19、CD10和HLA-DR。这是B淋巴细胞白血病的表型分析。

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