土壤中产淀粉酶菌株的分离、鉴定与纯化

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土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选

一、 实验目的

1、 掌握从土壤中分离产淀粉酶菌株的方法 2、 掌握平板法分离与纯化微生物的技术 3、 进一步熟练和掌握无菌操作技术 二、实验原理

培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同。但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所需的C源、N源、无机盐、生长因子以及水等。从混杂微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离纯化。平板分离法普遍适用于微生物的分离与纯化，其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

稀释涂布法或平板法时常用的分离与纯化的方法，以淀粉作为惟一碳源的培养基培养未分离细菌，能产淀粉酶的细菌能生长，且菌落周围出现透明圈（淀粉不透明，被消化后变透明），则产淀粉酶微生物被分离出来。本实验采用透明圈检验法检测培养物中是否有产淀粉酶微生物的生长。

分离得到的单个菌落还要进行性能的筛选,分为初选和复选. 三、实验材料

样品:张掖市甘州区青松村面粉厂周围采集的土样若干 试剂:营养琼脂、淀粉 、土壤、碘液等

仪器：高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱 .移液管、培养皿、试管、三角瓶、量

筒、 酒精灯、接种环等 液体培养基:淀粉10 g、硫酸铵10 g、氯化钠5 g、硫酸0.5 g、磷酸氢二钾1 g、

牛肉膏1 g，定容1 L

四.实验步骤

(一)培养基的配置 1.称量

按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。 2．溶化

在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，应控制火力并需不断搅拌,以防琼脂糊底烧焦。（调pH和过滤本实验不做） 3．分装

将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。 分装过程中注意不要使培养

基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。 固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。 4．加塞

培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染。 5．包扎

加塞后，将全部试管和三角瓶用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层报纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期 。培养皿、移液管、涂布棒用报纸包扎好。试管里面加入45ml自来水，三角瓶里面加入90ml自来水和玻璃珠，加塞，包扎。 6．灭菌

将上述培养基及其仪器121．3℃， 20分钟高压蒸汽灭菌。 7．搁置斜面及倒平板

将灭菌的试管培养基冷至50℃左右（以防斜面上冷却水太多），将试管口一端搁置在书边上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。三角烧瓶里的培养基在超净工作台上倒平板，然后静止，待其凝固。 （二）产淀粉酶菌株的分离、纯化

1.土样的采集

（1） 地点的选取：张掖市甘州区青松村面粉厂周围 （潮湿） （2） 采集时间:2012-5-16 10:00 （3） 采集原则：地点选取后，用小铲子出去5cm表土，取离地面5-15cm

处的土，盛与袋中并标明时间，地点及环境情况。

2.菌悬液的制备和梯度稀释

（1） 取10g土壤样品加入90ml无菌水中并放于震荡培养箱中培养20

分钟, 然后在水浴锅中放置30分钟，取出待冷却至室温。

（2）取六只试管编号1—6分别加入9ml无菌水，从菌悬液中取1ml

上清液加入1号管后震荡摇匀，然后再从1号管中取1ml加入2号管震荡摇匀，依次操作六个试管，得到10ˉ1—10ˉ6六个稀释度的菌悬液。

3．涂布平板法分离产淀粉酶细菌

(1）倒平板：将配置好并已灭菌的淀粉培养基倒入培养皿中（大约10-15ml）

(2)涂布：取0.2ml稀释度为10ˉ3菌悬液倒入平皿，用涂布棒涂匀，标

记后倒扣放入恒温培养箱37°C恒温培养24小时。依次对10ˉ4、10ˉ5、10ˉ6 三稀释度的菌悬液进行上述操作。

(3)培养24小时后取出培养皿，然后加入少量碘液，观察其透明圈的大小。

4. 平板划线法纯化菌株

(1)将上述已分离好的产淀粉酶菌株划线纯化（挑取透明圈比较大的菌株）

(2)重复上述操作2-3次，直至出现单菌落 。

（ 三）;鉴定

选择单菌落进行制片,革兰氏染色观察其形态,保存单菌落。 （ 四）.高活力淀粉酶菌株的筛选 方法一：

1、将斜面上保存的菌种活化后制成10-6菌悬液。

2.配置液体培养基：取淀粉10 g、硫酸铵10 g、氯化钠5 g、硫酸亚铁0.5 g、磷酸氢二钾1 g、牛肉膏1 g，加水溶解定容至1L。将培养基在121．3℃，高压蒸汽灭菌20min。

3、将制好的菌悬液按体积分数4％的接种量接种于装有液体培养基的摇瓶中，编号，摇瓶容量250 mL，装量50 mL，培养温度37℃，摇床转速180 r / min，培养24h。种子液做镜检观察。

4、培养好的液体4000 r / min离心20min,取上清液0.2 mL 与1 mL 质量分数1％的淀粉溶液于37 ℃水浴5 min，然后沸水浴5 min，终止反应，再加入1 ml碘液，沸水浴5 min后，迅速冷却观察颜色。以空白液体培养基加质量分数1％淀粉直接煮沸再加1 ml碘液，反应后作为空白对照。 方法二：

1.热处理: 将斜面上保存的菌种活化后放进50ml 生理盐水中混匀, 水浴煮沸5min, 然后再转种到固体培养基上, 37 ℃ 培养48h , 又从中选取生长征盛的典型菌落, 菌落周围透明圈大的菌落重复进行热处理2一3 次。

2． 用紫外线照射诱变， 将细菌均匀涂布在固体培养基上, 放在离30w 紫外线灯管45cm 处照射1min , 置37 ℃ 培养36h , 从中选取数个生长旺盛, 典型的菌落重照1一2次,最后选出菌落大, 菌落周围透明圈大的菌株。 方法三:点样法

将1 号, 2号, 3号菌株初筛四划法后在第四区出现的单菌落挑取各自最有代表性的菌落在平板上进行接种, 每个点3下, 将平板分成9个区域。用同样的方法, 把其余菌株也用此方法接种, 培养16 h~ 18 h, 长出菌落后, 滴加卢戈碘液,

用游标卡尺分别测量水解圈直径D 和菌落直径d, 计算D /d的平均值。根据两者比值大小初步确定淀粉酶活性的高低, 同时对每号菌株都进行显微镜检查, 并将菌株保存

（五）:实验预期结果：

终止反应后观察到的颜色，如果颜色越淡则表示该菌株的产淀粉酶酶活较高，反之则比较底。在点样法中,得到的比值越大说明产淀粉酶活性越高,反之则比较低.。在观察颜色和测量直径是存在误差，结果应采取更精确的方法。 （六）:注意事项：

1．液体培养基做好后应该立即灭菌，防止空气或别的杂菌污染培养基。 2．无菌操作时一定严格遵守各步操作步骤 ,以防被污染. 3. 沸水浴后要迅速冷却。 (七)查阅文献

[ 1 ] 张丽苹, 徐岩. 酸性α-淀粉酶生产菌株的选育的初步研究[J].工业微生物, 2002, 32（4）:12-14.

[ 2 ] 卢涛, 舒丹, 张杰, 等. 高温α-淀粉酶产生菌株的选育[J]. 四川大学学报: 自然科学版, 2002, 39（6）:1 131-1 133.

[ 3 ] 张应玖, 朱学军, 关键, 等. 一种新型淀粉酶的鉴定及其产酶菌株的筛选[J]. 微生物学通报, 2002, 29（5）:38-41.

[ 4 ]祖若夫 胡宝龙 周德庆.微生物学试验教程[M].上海.复旦大学出版社.1993

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