口蹄疫疫苗研究进展

口蹄疫疫苗研究进展

摘要：口蹄疫是世界性重大动物疫病之一。接种疫苗是预防该病的重要手段之一。而研制高质量、安全有效的疫苗，不但是决定疫苗免疫效果的关键，也是成功预防、控制直至最终消灭口蹄疫的先决条件。目前，除传统疫苗仍然在口蹄疫防控中扮演重要角色以外，国内外诸如亚单位疫苗、栽体疫苗、核酸疫苗、基因缺失疫苗、合成肽疫苗、可饲疫苗和多表位疫苗等的研究和探索已全面展开，有望为口蹄疫的有效防控提供新的途径。

关键词：口蹄疫；疫苗；进展

口蹄疫(Foot--and--mouth disease，FMD)是由FMD病毒(FMDV)引起的牛、羊、猪等偶蹄动物发生的一种急性、热性、高度接触性传染病，被0IE列为“A类烈性传染病”之首。口蹄疫的平均致死率仅为1％，但是被感染动物会100％发病，且传播效力极高，使实际畜产量锐减。根据0IE规定，一旦暴发FMD，所有感染和接触的动物都必需宰杀并销毁尸体。目前，除大洋洲和北美，口蹄疫已侵袭过所有大陆。2001年英国暴发口蹄疫损失约90亿英镑，绵羊是此病的有力传播者；我国部分地区于2005年及2009年分别暴发Asia I型和A型FMD，不仅造成了巨大的直接经济损失，而且严重危害奶业的健康发展以及相关产品的对外贸易。FMD是由FMDV引起的，其基因组是一条单股正链RNA，属于小核糖核酸病毒，是在发现烟草花叶病毒后发现的第一个脊椎动物病毒。FMDV分为O、A、C、Asia 1、SATl、SAT2和SAT3共7个血清型，型间无交叉免疫反应。目前，大多数流行口蹄疫的国家采取以常规疫苗免疫为主的措施预防口蹄疫。近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，FMDV新型疫苗不断涌现。本文综述了口蹄疫常规疫苗和新型疫苗的现状，并对口蹄疫疫苗的发展进行了展望。

1 常规疫苗

1.1 灭活疫苗

灭活疫苗是指用物理或化学方法使口蹄疫病毒丧失感染力而保留抗原性，再添加佐剂后制成的。1925年Belin首次用甲醛灭活牛舌皮组织病料制成了灭活疫苗；1934年Schmidt发现了能增强灭活苗免疫效力的氢氧化铝胶佐剂，使免疫效果日趋完善。1938--1962年口蹄疫疫苗主要由动物组织生产病毒抗原，经甲醛灭活，氢氧化铝胶吸附制成。自1962年至今，BHK--21细胞已成为制备口蹄疫疫苗病毒抗原的理想细胞培养系，广泛应用于口蹄疫疫苗生产。1965年Telling和Elsworth用发酵罐大量生产悬浮细胞来生产病毒抗原，现在几乎所有的口蹄疫灭活苗都以这种方法生产，但有研究证明甲醛在抗原的灭活中有活毒的残留，因此广泛应用二乙烯亚胺作为灭活剂。目前，世界上主要应用灭活苗来实现对口蹄疫的防制，除了灭火的单价苗之外，灭活二价苗也早已出现，张永光、王永录等已研制成功的牛口蹄疫O型A型双价灭活疫，在预防牛口蹄疫方面已取得了很好的效果。 1.2 弱毒疫苗

由于口蹄疫的广泛流行以及防疫上的大规模需要，许多国家都开展了口蹄疫弱毒疫苗的研究。目前仍在应用的有鼠化、兔化、鸡胚化及组织培养细胞驯化弱毒疫苗等几种。1937年Negel 将病毒接种于成年鼠脑内，证明病毒毒力可以被致弱。1948年Fraub 和Schneider 将豚鼠毒转接于鸡胚，获减毒毒株。Gillespic(1954)和Komorov(1957)将牛源毒适应于鸡胚和1日龄雏鸡，曾发表致弱毒株的初步应用报告。1959年Gunha和Eichhom也在兔体传代成

功。1964年欧洲口蹄疫防治委员会决定欧洲国家不用弱毒疫苗免疫，停止了弱毒疫苗的研究。

我国在20 世纪 50年代育成O型弱毒株及A型弱毒株，并制成乳兔组织弱毒疫苗；60年代用 A 型兔化弱毒制造反应苗；70年代选育出OPK弱毒株试制疫苗，并进行A 型、O型双价苗组织培养弱毒试验研究；80年代培育出温度敏感毒株，并培育了O型OP4细胞培养弱毒疫苗。时至今日，我国在云南、新疆等边境地区仍然使用OMII、0P4 两株弱毒疫苗株及O 型、A 型混合弱毒疫苗株对牛、羊进行气雾免疫或注射免疫，保护率可达100%，保护期7个月以上。在防止境外口蹄疫传入我国的防制工作中发挥了很大作用。弱毒疫苗虽有价廉、成本低及免疫原性好、抗体持续时间长等优点，但其引起免疫动物病毒血症、长期带毒、排毒及病毒返强等缺点一直无法克服。世界各国虽已培育出几十个弱毒疫苗株，但迄今为止还无一个可以满足所有标准的口蹄疫弱毒疫苗株。80年代研究发现，欧洲发生的多次口蹄疫流行中分离的毒株与以前的弱毒疫苗株有密切关系。因为病毒对一种动物的减毒并不能保证对其他动物减毒，且由于新的亚型不断出现及毒株致弱结果和致弱时间都不能确定，因此，弱毒疫苗株已不能适应口蹄疫防制的需要。目前世界许多国家和地区在口蹄疫的防制中都几乎采用灭活疫苗。但在近年的口蹄疫世界大流行中，应用灭活疫苗控制口蹄疫时出现了疫苗质量参差不齐及疫苗供不应求的现象。曾有专家提出是否可以用弱毒疫苗株，在口蹄疫流行比较严重的地区进行紧急免疫，而在疫区周围用灭活疫苗进行包围注射免疫的办法。但由于这种方法承担的风险较大，一直没有被采用。

2 新型疫苗研究

2.1 载体疫苗

随着基因工程技术的迅速发展，重组技术为开发重组FMD疫苗提供了技术支持。病毒和细菌都可用来生产口蹄疫疫苗。

腺病毒的基因结构与功能研究得比较清楚。Mayr等利用复制缺陷型的第5型腺病毒，构建了包含有FMDVPl--2A、3C蛋白前体编码序列的重组病毒。发现含有3C序列的重组病毒能有效地加工结构蛋白前体P--2A成VP0、VP3、VPl，表达的蛋白具有类似病毒空衣壳的功能，能被免疫细胞识别，诱导动物机体产生高浓度的中和抗体。Du等用腺病毒构建了含口蹄疫VPl的3个氨基酸残基表位(21--60、141--160、200--213)的重组腺病毒(rAd--GMCSF--VPe)，并将其与猪的巨噬细胞集落刺激因子混合(rAd--GMCSF--VPl)接种豚鼠和猪，结果能检测到特异性的体液免疫应答，高水平的T细胞增殖，IL一4和IFN--γ。所有接种rAd--GMCSF--VPe和rAd--GMCSF--VPl的豚鼠和猪都能抵抗FMDV的攻击。

痘病毒基因组不具感染性，且蛋白加工、修饰及转运过程和外源病毒基本一致，因此其抗原性变异不大，是很好的病毒载体。Zheng等构建了包含FMDV衣壳和3C蛋白的鸡痘重组病毒(vUTAL3CP--1)，在接种的豚鼠和小鼠体内均能诱导细胞免疫和体液免疫应答。Ma等构建了包含有FMDV P1--2A、3C蛋白前体编码序列和猪IL--18编码序列的重组鸡痘病毒(rFPV--ILl8--2APl2A)，接种后能使猪抵抗同源病毒的攻击，并且所接种的猪均能检测到抗体和T细胞增殖及细胞免疫应答。Li等构建了包含FMDV前体衣壳的伪狂犬病病毒重组体(PRV--P1)，将其接种猪后，不仅诱导细胞免疫和体液免疫应答，而且还能使猪抵抗强毒的攻击。He等构建的包含FMDV前体蛋白P1的弱伪狂犬病病毒重组体(FHG／P1／PRV)接种猪后，能同时预防伪狂犬病和口蹄疫，达到一种苗预防两种病的目的。

除了利用病毒作为载体外，细菌也可用来生产口蹄疫疫苗。Li等构建含有VP1用基因、嗜酸乳酸杆菌ATCC8014复制起点pRc／CMV2载体的重组表达质粒，然后通过基因枪接种ATCC8014于小鼠肌肉、皮下，几周以后在心、脾、肾等均可检测到针对VP1基因的检测到抗体。与传统灭活疫苗相比，抗体生成速度快。目前用于表达外源性病毒蛋白的疫苗载体

还包括脊髓灰质炎病毒等。 2.2 核酸疫苗

核酸疫苗，常被称作DNA疫苗、“裸”DNA疫苗、基因疫苗、多核苷酸疫苗、基因免疫、核酸免疫、多核苷酸免疫等。即把外源的抗原基因克隆到质粒或病毒载体上，然后将重组的质粒或病毒DNA直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生以天然蛋白形式出现的抗原，激活机体的免疫系统，并能够持续地引发免疫反应。核酸疫苗作为近几年来发展起来的一项新的生物技术，无疑具有广阔的应用前景，免疫期长、成本较低、容易构建和制备、稳定性好，抗原递呈过程与病原的自然感染相似，但在短期内，DNA疫苗很难代替目前大量使用的传统疫苗，随着DNA疫苗研究的不断深入，预计不久将会有新的突破。 2.3 基因植物疫苗

转基因植物疫苗即利用农杆菌或基因枪等技术，将免疫原性基因导入植株中，获得能表达免疫原基因的植株。口蹄疫转基因植物可饲疫苗是研究较早，并且效果较好的例子之一。1990年，Curtiss等首次在转基因烟草中表达出约占烟草蛋白0.02％的变异链球菌表面蛋白。王炜等(2007)以豆科牧草百脉根为转化受体，将口蹄疫病毒P12A--3C基因通过根癌农杆菌介导法导人百脉根基因组，获得了转基因抗性植株。对转基因植株进行RT--PCR检测表明，外源基因整合进了植物染色体基因组，并且具有转录活性，通过ELISA方法检测到了转基因植株表达的外源目的蛋白。Pan等(2008)构建了pBin438／P1--2A3C载体，获得了表达P1--2A3C的转基因番茄，用叶提取物免疫豚鼠，攻毒后保护率可达100％。目前主要应用的转基因植物有豇豆、烟草、拟南芥、苜蓿、马铃薯、玉米、百脉根、水稻、番茄和胡萝卜等。FMDV转基因植物可饲疫苗的研究成功，将为牛、羊等草食动物口蹄疫的防制带来光明的前景。 2.4 亚单位疫苗

亚单位疫苗是将编码病原微生物的抗原基因导人受体菌或细胞，使其在受体中高效表达保护性抗原，以此抗原制成的一类疫苗。FMDV衣壳VPl是主要的抗原蛋白，早期亚单位疫苗主要是利用各种表达系统表达VPl蛋白，或者VPl与免疫球蛋白重链稳定区sclgG基因构成嵌合体，制成疫苗。Kleid等于1981年首次将口蹄疫保护性抗原基因VPl导人大肠杆菌，制备的高纯度VPl蛋白接种牛，可使牛抵抗强毒的攻击。我国台湾的Wang等将大肠杆菌诱导表达的重组VPl蛋白应用SDS协助其重折叠，去除SDS后获得纯化的VPl单体和二聚体，与口蹄疫抗体反应的结果表明，任何一种形式的重组VPl猪用疫苗都能产生免疫反应。大肠杆菌表达系统相对有许多优点。包括表达的目的蛋白纯度高，表达蛋白量多。包涵体能抵抗蛋白酶的水解等。除了用大肠杆菌生产亚单位疫苗之外，研究者还试图在其它菌中进行亚单位疫苗的生产，但这些细菌由于不能完成蛋白表达之后的加工和修饰，从而使其应用受到限制。

真核表达系统所表达的蛋白质类似于天然蛋白质，具有较高的生物学活性。Balamurugan等利用巴斯德毕氏酵母分别表达了口蹄疫病毒O、A、C、Asial的结构蛋白P1，纯化后加佐剂免疫豚鼠，28 d之后可检测到抗体。Roosien等将FMDV前体衣壳蛋白基因P1、2A、L、3C的cDNA导人苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)，在秋粘虫细胞中表达的前体蛋白1AB、1C、1D可产生75S的类病毒粒子。其免疫动物效果类似于全病毒，可产生高水平的中和抗体。Shi等将牛的IFN--γ基因和VP1基因在巴斯德毕氏酵母中融合表达，表达出的重组蛋白可诱发小鼠体液免疫反应和微量的细胞免疫反应。在多数情况下，在昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达的蛋白具有相同的结构、生物学活性和免疫原性。比较这几种表达系统，蛋白质的表达量较低，免疫原性较传统疫苗低。因此，如何研制出安全、稳定、高效的亚单位疫苗仍是目前一个比较棘手的问题。 2.5 合成肽疫苗

合成肽疫苗(synthetical peptide vaccine)是依据天然蛋白质氨基酸序列一级结构用化学方法人工合成包含抗原决定簇的小肽(20--40个氨基酸)，通常包含一个或多个B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。该疫苗是一种完全基于病原体抗原表位或者决定簇氨基酸序列特点开发设计的一类疫苗，不存在毒力回升或灭活不全的问题。特别是对于还不能通过体外培养方式获得足够量抗原的微生物病原体或虽能进行体外培养，但有潜在致病性和免疫病理作用等涉及安全性与有效性问题的病原体意义重大。合成肽疫苗的研究最早始于FMDV合成肽疫苗，研究重点主要集中在FMDV的单独B细胞抗原表位或与T细胞抗原表位结合而制备的合成肽疫苗研究，虽然取得了一定的进展，但仍未获得一种具有理想保护作用的合成肽疫苗。分析合成肽疫苗免疫效果不佳的原因主要有：疫苗缺乏足够的免疫原性，很难如蛋白质抗原那样诱导集体的多种免疫反应；B细胞和T细胞抗原表位很难发挥协同作用：缺乏足够多的B细胞抗原表位的刺激。合成肽作为免疫原存在的一个普遍问题是主要组织相容性复合体(MHC)的限制性，FMDV是典型的细胞依赖性体液免疫为主，单纯B细胞位点肽诱导机体产生保护性有限，因而T细胞表位的引入对提高肽段的免疫性意义重大。但T细胞表位的识别受MHC限制，非选择性T11表位或病毒蛋白不同部分的特异性，T1l表位的引入可极大解决这个问题。1990年Doel分别用A、O、C血清型FMDV VPl序列的141--158和200--213肽段组成的40个氨基酸合成肽，在牛和豚鼠进行试验，每个肽都产生高滴度的特异性抗病毒中和抗体，O、A型肽可完全保护豚鼠抵抗各同源病毒的攻击，C型较差。2002年Wang等以VPI G--H环及大量侧翼序列为框架，将共有残基整合进入VPl高变区位点，并引入外源Th位点设计的合成肽疫苗，免疫猪后，以Taiwan株FMDV攻击时获得20／21保护率。 2.6 基因缺失疫苗

基因缺失疫苗是在DNA或cDNA水平上剔除病原致病相关基因而制备的一种新型疫苗。这种疫苗安全，毒力不会返强。可诱导对病毒多种抗原的免疫应答，免疫力坚挺，免疫期长，是发展活疫苗的理想途径。FMDV的L蛋白酶是一种毒力因子，A1meida应用遗传工程构建了一种编码前导蛋白L基因缺失的病毒，该病毒对牛和猪无毒力，可在特殊的细胞系上增殖，因而可作为一种新型活毒疫苗加以制备。VPl上的RGD序列是病毒与细胞吸附所必需的，应用遗传工程构建的一种缺失细胞结合位点RGD序列的病毒粒子，免疫牛后，牛产生了明显的抗病毒保护作用。新的缺失疫苗是将感染性的FMDV经过基因改造。使其缺失的RGD受体结合位点或前导蛋白L基凶在自然宿主上诱导保护而不产生症状。 2.7 多表位疫苗

多表位疫苗是指同时携带多个目标相关抗原以及辅助性表位的疫苗，也称鸡尾酒式疫苗，是近几年新兴的一种疫苗研制技术。多表位疫苗有病毒样颗粒展示多表位疫苗和自身蛋白质分子为载体的多表位疫苗。Clarke等(1987)将口蹄疫病毒VPl蛋白第141--146位氨基酸的基因序列与乙肝病毒核心抗原基因融合，实现了重组质粒在真核细胞中的表达，表达产物为27 nm的病毒样颗粒，能与口蹄疫病毒阳性血清发生免疫反应，提示该口蹄疫病毒抗原表位被展示到乙肝核心颗粒表面，病毒样颗粒能够诱导机体产生高效价的中和抗体，用其加强免疫的动物能抵抗同源病毒的攻击，具有与口蹄疫全病毒颗粒相似的免疫原性。Chan等(2000)利用机体免疫系统不对自身物质发生免疫应答这一特点，选用宿主自身免疫分子lgG作为载体蛋白，将口蹄疫病毒O1K株的多个表位基因(第14l--160位氨基酸和第200--213位氨基酸)串联后与猪免疫球蛋白重链恒定区基因融合，成功实现了大肠杆菌的表达。经过Western blotting鉴定，融合蛋白能与阳性免疫血清发生免疫反应。免疫猪保护试验显示，多表位重组蛋白疫苗具有较强的免疫原性，不仅能刺激机体产生高效价的中和抗体，也能诱导机体发生细胞免疫应答。多表位疫苗适合多价疫苗及联合疫苗的开发研究，这些优点符合未来疫苗研究的方向，具有广阔的开发应用前景。

3 前景与展望

新型疫苗的研究虽然取得了很大的进展，但目前大部分还处于实验室阶段．如抗原蛋白的表达量较低；蛋白质多肽在体外合成，或者载体表达出的蛋白折叠、糖基化、裂解等过程还需进一步的研究。要使其规模化生产。应用于市场。还有很长的路要走。但随着研究的深入，相信在不久的将来，新型疫苗必将大量投入使用，人类可以对口蹄疫进行有效地防控。

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