噬菌体裂解酶的研究进展

中国生物制品学杂志2012年5月第25卷第5期Chin J Biologicals May 2012，Vol.25No.5

噬菌体（Bacteriophage ）是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等的微生物的总称，以细菌为宿主进行

复制和繁殖。噬菌体裂解酶（Bacteriophage lysins ）是噬菌体在感细菌后期表达的一类细胞壁水解酶，该酶通过水解氨基糖之间的糖苷键、细胞壁肽聚糖上的酰胺键或肽内氨基酸残基间的连接键，达到裂解细菌的目的，然后释放出子代噬菌体，用于感染其他细菌。

1.噬菌体及其裂解酶

噬菌体是一种特异性感染细菌的病毒，在地球上分布非常广泛，分别由英国的Twort 和法国的D ′Herelle 在1915年和1917年独立发现［1-2］。噬菌体根据核酸的特点，可以分为单链RNA 噬菌体、双链RNA 噬菌体、单链DNA 噬菌体和双链DNA 噬菌体。噬菌体在宿主菌体内复制产生子代噬菌体，为了释放子代噬菌体，在数百万年间，噬菌体进化出了高效裂解细菌系统。小分子噬菌体（ssRNA 和ssDNA ）通过编码噬菌体相关蛋白作用于肽聚糖合成酶，从而干扰宿主菌的细胞壁的生物合成；大分子噬菌体（dsDNA ）则进化出高效的裂解酶系统，特异性地作用于细胞壁上的肽聚糖，破坏细胞壁，从而导致细菌裂解。但

是裂解酶通常没有信号序列，需要另一种蛋白质———穴蛋白去达到作用位点，从而发挥裂解作用。多数

噬菌体具有编码3种细胞壁水解酶的的基因，分别为溶菌酶（Lysozyme ），水解氨基糖之间的糖苷键；酰

胺酶（N -acetylmuramoyl -L -alanine amidase ），水解N -乙酰胞壁酸和L -丙氨酸之间的酰胺键和内肽酶（E n －dopeptidases ），水解肽交联桥。噬菌体裂解酶在结构上具有相似性，均含有两个结构域，即一个决定该酶催化活性的N -端结构域（催化域）和一个决定细胞结合位点的C -端结构域，它们之间由一个小片段连接［3］。同一类裂解酶的催化域高度保守，而细胞结合域可变。2.

已克隆的裂解酶及其分类近年来，抗生素的滥用导致耐药性菌株不断出现，且耐药性也在不断增强，因此，寻找除抗生素治疗以外的方法来治疗耐药菌感染的疾病已成为近年来研究的热点。噬菌体作为细菌的天敌，在预防和治疗细菌性疾病方面具有先天优势，噬菌体裂解酶治疗便成为一个非常经典的方法，具有较高的研究价值。近年来，国内外很多科研工作者通过克隆，表达出部分裂解酶蛋白，研究比较多的一些噬菌体裂解酶见表1。3.

裂解酶的重组研究

裂解酶作为一种新型的抗菌物质，具有广阔的

·综述

·噬菌体裂解酶的研究进展

张瑞安1，2，刘军2，冯书章1，

2，3

【摘要】噬菌体裂解酶是噬菌体在感染细菌后期表达的一类细胞壁水解酶，具有酶活性和底物特异性。多数噬菌体具有编码3种细胞壁水解酶即溶菌酶、酰胺酶和内肽酶的基因。本文综述了噬菌体裂解酶重组及其应用的研究，并探讨了近年来重组裂解酶的研究进展。

【关键词】噬菌体；裂解酶类；种属特异性

【中国图书分类号】Q939.48【文献标识码】A 【文章编号】1004-5503（2012）05-657-04

Progress in research on bacteriophage lysins

ZHANG Rui -an *,LIU Jun,FENG Shu -zhang （College of Animal Science and Technology,Jilin Agricultural Uni －versity,Changchun 130118,China ）

【Abstract 】Bacteriophage lysins are cell wall lytic enzymes expressed in the late phase of bacterial infection,with enzyme ac －tivity and substrate specificity.Most of bacteriophages contain the genes encoding three kinds of cell wall lytic enzymes,i.e.lysozyme,N -acetylmuramoyl -L -alanine amidase and endopeptidases.This paper reviews the recombination and application of bacteriophage lysins as well as the progress in research on recombinant lysins in recent years.【Key words 】Bacteriophage;Lysins;Species specificity

作者单位：1吉林农业大学动物科学技术学院（长春130118）；2军事

医学科学院军事兽医研究所（长春130122）；3吉林省人兽共患病控制与预防中心（长春130122）．

通讯作者：冯书章，E-mail ：shuzhangf＠yahoo．com

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应用前景。如果采用常规的方法制备，存在工序复杂且操作条件难以控制等问题，不适宜大规模生产，且成本较高。因此可利用基因重组技术，在基因工程菌中表达外源目的蛋白，是目前大量获得目的蛋白的主要方法，从而解决高效制备裂解酶的问题，且成本较低。表2是国内外应用的部分重组裂解酶。

表1国内外研究较多的噬菌体裂解酶

Tab1.Bacteriophage lysins as focuses of study in the world

来源裂解酶基因长度（bp）裂解活性参考文献分支杆菌LysA1155裂酯酶4

LysB1146裂酯酶5

Gene1049136裂酯酶6

大肠杆菌E276裂解酶7

肺炎球菌Cpl-11017酰胺酶8

Ejl溶菌酶9

Ejh穴蛋白9

李斯特菌PlyPSA870内肽酶10

Ply118846内肽酶10

金黄葡萄球菌Lysp954753溶菌酶11

LysK溶菌酶12

Ply1871887酰胺酶3

炭疽杆菌PlyG702酰胺酶13

乳酸杆菌Hyb5465穴蛋白14

Lyb51257溶菌酶14

布鲁菌LzA882溶菌酶15

链球菌PlyC1608溶菌酶16

LySMP1446糖苷酶17

Schuch等［18］首次报道了噬菌体裂解酶在治疗细菌感染方面的应用。Vasala等［19］将乳酸杆菌噬菌体LL-H中的一段基因克隆到大肠杆菌中，表达出具有溶解细胞壁作用的酶。Kikkawa等［20］研究炭疽杆菌裂解酶PlyG，经克隆、表达和纯化裂解酶后，利用ELISA定性和定量检测发现，裂解酶PlyG具有裂解B类炭疽杆菌的作用，其裂解谱比较狭窄。Nelson 等［21］用纯化的链球菌裂解酶C1体外感染链球菌和大肠杆菌，结果对部分链球菌具有很强的杀灭作用，而对大肠杆菌没有作用，表明链球菌裂解酶具有种属特异性。Djurkovic等［22］利用链球菌裂解酶Cpl-1和几种抗生素共同作用于青霉素抗性的链球菌菌株，结果发现裂解酶Cpl-1与青霉素发挥出了协同作用，提示我们可以利用重组裂解酶与抗生素共同作用，杀灭细菌。

我国自2004年起有关于噬菌体裂解酶的报道，多以综述的形式对噬菌体裂解酶进行探讨。近几年开始了研究利用噬菌体裂解酶基因进行克隆并表达裂解酶。表2国内外应用的重组裂解酶

Tab2.Studies on application of recombinant lysins in the world 来源重组裂解酶应用参考文献乳酸杆菌噬菌体LL-H克隆19

炭疽杆菌噬菌体PlyG重组研究20

Clysin抗菌作用24

肺炎链球菌噬菌体Cpl-1重组研究，22，25

抗菌制剂

Cpl21抗菌作用23

链球菌噬菌体PlyGBS抗菌制剂26

金黄葡萄球菌噬菌体LysH5生物防治27

产气荚膜杆菌噬菌体Ply3626生物防治28

马链球菌噬菌体PlyC消毒制剂16

陆海荣等［23］将人工合成的肺炎链球菌噬菌体裂解酶CPL21基因插入pET28a载体，在大肠埃希菌BL21（DE3）中获得高效可溶性表达，裂解细菌后胞内可溶部分通过DEAE亲和层析，获得纯度为97%的目的蛋白。抑菌活性试验表明，经纯化的重组CPL21对临床分离的肺炎链球菌具有明显的抑菌活性，且随着浓度的增加，抑菌圈也明显变大。

李晓静等［24］利用PCR方法扩增炭疽杆菌噬菌体裂解酶（Clysin）基因，克隆至大肠杆菌表达载体pET22b，经菌落PCR筛选、序列测定和酶切鉴定，证实表达载体pET22b-Clysin构建成功，并在大肠杆菌BL21（DE3）中获得了高表达，经过生物活性试验证明重组的γ噬菌体裂解酶能特异、快速地裂解炭疽杆菌，但对枯草杆菌、蜡样芽胞杆菌及大肠杆菌无裂解作用。

刘爽等［7］将噬菌体PhiX174裂解基因E克隆到质粒pBV220中，再将重组质粒导入到出血性大肠杆菌O157:H7中，诱导基因E在大肠杆菌内表达。经诱导后，在大肠杆菌O157:H7表面形成孔道，菌内的内容物通过孔道流出，从而形成菌壳，同时检测到对大肠杆菌的裂解效率达98.4%。

杨文慧等［6］将分枝杆菌噬菌体D29裂解酶基因gene10克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒后，在耻垢分枝杆菌进行诱导表达，对表达产物Gp10产物进行SDS-PAGE检测并鉴定裂解活性，证实gene10表达产物具有裂解活性，是噬菌体D29的裂解酶。

从国内外的研究成果可以看出，重组裂解酶经过克隆、表达和纯化后，进行抑菌试验，重组裂解酶对相应的宿主具有裂解和杀灭作用，为研制新型抗菌制剂用于辅助感染耐药细菌的治疗提供了实验依据。

4.噬菌体裂解酶的应用研究

重组裂解酶作为新型抗菌制剂，其潜在的抗菌

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能力不仅可以用于对细菌的预防、治疗和生物防治，还可以用于食品安全卫生方面，并且具有其独特的优点：①噬菌体裂解酶作用具有特异性，只作用于相应的宿主病原菌，而不会对其他细菌产生作用，因此不会对动物产生毒副作用；②噬菌体裂解酶作用机制与抗生素完全不同，其受体识别结构与特异性底物相结合，而催化结构则作用于宿主病原菌的细胞壁肽聚糖，因此细菌对噬菌体裂解酶产生耐药性的机率微乎其微；③噬菌体裂解酶可以与抗生素联合用药，共同发挥作用；④噬菌体裂解酶作为一种酶类制剂，不会对人体产生致病性。2001年，Nelson等［21］通过实验证实，纯化后的重组噬菌体裂解酶可以用于预防和治疗A型链球菌引起的小鼠黏膜感染。此后，人们开始对其他噬菌体裂解酶进行研究。目前世界上很多科学家通过大量的体内和体外试验，致力于研究噬菌体裂解酶的抗菌特性。

肺炎球菌裂解酶Cpl-1已经在杀灭有抗性的肺炎链球菌方面成功用于临床预试验。Rodriguez-Ro－dríguez-Cerrato等［25］研究了肺炎链球菌裂解酶Cpl-1，小鼠在感染肺炎链球菌1h后，用2000μg剂量的重组裂解酶Cpl-1静脉滴注小鼠，15min后，肺炎链球菌由L g4.70CFU／ml降到L g2.00CFU／ml 以下。经重组裂解酶Cpl-1治疗的小鼠，致死率为0%，并且在经静脉滴注Cpl-1后24h内恢复常态，而未静脉滴注Cpl-1的小鼠死亡率为80%。这项研究说明了重组裂解酶Cpl-1在预防和控制肺炎链球菌感染的疾病中具有很好的效果。

PlyGBS是经研究获得的较为全面的链球菌重组裂解酶，Cheng等［26］通过体外试验，证明重组裂解酶PlyGBS对链球菌A、B、C、G和L型具有杀灭作用，而对D、E、N型链球菌无作用。通过小鼠体内试验，证明单剂量的PlyGBS能够杀死小鼠阴道和口腔中的B型链球菌，在最适pH5.0条件下，并没有对小鼠体内诸如乳酸杆菌等具有抵抗病原微生物作用的共生微生物产生杀灭作用。重组裂解酶PlyGBS 可用于B型链球菌的感染和治疗，为其进一步开发成新型药物奠定了良好的基础。

金黄葡萄球菌能引起奶牛乳房炎，影响产奶量，也可引起肺部感染及脑、肝、肾、乳腺等脏器的脓肿，具有很高的发病率和致死率，其中甲氧西林耐药葡萄球菌是影响范围最广和结果较严重的。Obeso 等［27］研究了重组裂解酶LysH5，该酶在pH7.0，37℃条件下，能够快速杀死经巴氏消毒的牛奶中生长的金黄葡萄球菌，在37℃培养4h后并未检测到含有病原菌，因此，可用于乳制品的生物防治。

Zimmer等［28］研究了产气荚膜杆菌噬菌体裂解酶Ply3626，该酶包含N-端酰胺酶作用区和C-端结合区，能抵抗产气荚膜杆菌的感染，对多株测试的产气荚膜杆菌具有裂解活性。重组Ply3626对产气荚膜杆菌高效的裂解活性，使其可作为新型食品防腐剂，用于食品的生物防治。

Hoopes等［16］研究了马链球菌重组裂解酶PlyC，作为一种抵抗马链球菌的消毒制剂，用于马场的消毒。重组裂解酶PlyC的宿主谱较窄，可以杀死马链球菌亚种和兽疫链球菌亚种，可控制马链球菌的扩散和传播，且对环境无污染，能快速杀死20%以上临床分离的马链球菌，消毒效果是消毒药卫可的1000倍；在30min内1μg的PlyC灭菌效果相当于杀死108CFU／ml的马链球菌培养液。通过标准的稀释法和喷雾法测试消毒效果，结果表明，PlyC可以杀死马厩里各种设备上的病原菌，消毒效果良好。

5.结语

近年来，细菌耐药性的问题越来越严重，呈全球蔓延趋势，抗生素的局限性也越来越明显，因此，迫切需要研究新型的抗菌制剂，噬菌体的出现给人们提供了一个新的思路。早在20世纪20年代，人们就开始利用噬菌体来治疗细菌的感染，并取得了良好的效果。随后，科学家从各种感染了噬菌体的致病菌，包括肺炎链球菌、炭疽杆菌、乳酸杆菌、金黄葡萄球菌等中都分离出了噬菌体。但是，随着抗生素的出现，人们的注意力又转移到抗生素上面来，从而忽略了细菌的天敌噬菌体。现在，细菌耐药性愈发显著，才使人们重新探索裂解酶的抗菌作用。要真正实现全面利用噬菌体及其裂解酶治疗细菌性感染，还需要解决诸如活噬菌体对人的影响和工程化生产噬菌体裂解酶等等问题。随着对噬菌体及其裂解酶的深入研究，会开发出新型抗菌制剂，用于细菌性疾病的治疗。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/9ofm.html