实验报告

实验报告

一．实验目的

质粒提取即将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。本次实验的目的主要是获得相对纯净的植物表达载体质粒E1-PUC18 二．实验内容

1.理解质粒提取的基本原理 2.熟悉质粒提取的基本操作步骤 3.获得相对纯净的目的质粒 三．实验原理

1.Buffer P1（重悬菌体，提供缓冲环境）

主要成分是50 mmol/L葡萄糖，25 mM/L Tris-HCl，10 mM/L EDTA，pH8.0 主要作用：悬浮菌体

葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到离心管的底部；EDTA抑制DNase的活性，

2.Buffer P2（氢氧化钠和SDS裂解菌体细胞壁、在细胞膜上穿孔，释放细胞内的质粒）

主要成分是0.2mol/L的NaOH ，1% SDS

主要作用是破坏细胞壁和细胞膜，使细胞的内容物释放 其中NaOH主要是为了溶解细胞，释放DNA，因为在强碱性的

情况下，细胞膜发生了从双层膜结构向微囊结构的变化。SDS与NaOH联用，其目的是为了增强NaOH的强碱性，同时SDS作为阴离子表面活性剂破坏脂双层膜。

注意事项：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断也会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA会断裂。破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以称为碱法抽提。

3.Buffer P3（中和氢氧化钠、SDS中的钠被钾替换，吸附菌体产生沉淀）

主要成分是3mol/L的醋酸钾，2mol/L 醋酸，75%酒精 主要作用是沉淀蛋白和中和反应

其中醋酸钾是为了使钾离子置换SDS中的钠离子而形成了PDS，因为十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate，SDS）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾 （potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是不溶水的，同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。2 mol/L的醋酸是为了中和NaOH。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50~100 kb大小的片断，就没有办法再被 PDS共沉淀了，所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条较亮的总DNA条带。75%酒精主要是为了清洗盐分和抑制

DNase；同时Buffer P3的强酸性也是为了使DNA更好地结合在硅酸纤维膜上 3.Buffer DW1

主要成分为去蛋白液，可以进一步降低蛋白残留量 4.Wash Solution 主要成分为80%的乙醇

主要是起到洗涤的作用，使质粒DNA纯化和沉淀 5.Elution Buffer

主要成分是pH=8.0的TE缓冲液

主要作用是最后把DNA从柱子上洗脱下来 四．实验器材

SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒：生工生物工程(上海)股份有限公司

小型高速离心机，1.5ml离心管，无水乙醇等 五．实验步骤

菌体收集→裂解→上柱→洗涤→洗脱 1.准备工作

检查Buffer P1中是否已加入RNase A（储存于2-8℃，有效期为6个月）

检查Wash Solution中是否已经加入乙醇（乙醇终浓度为80%，室温密封保存）

检查Buffer P2和P3中是否出现沉淀（如有沉淀，于37℃溶解沉淀，待冷却至室温后使用）

2.取4ml过夜培养（37℃摇床振荡培养14h）的E1-PUC18菌液（分装于4个1.5ml的EP管中）12000×g离心10分钟收集菌体，弃尽培养基

3.在沉淀中加入250μl Buffer P1，彻底悬浮菌体

4.加入250μl Buffer P2，立即温和颠倒离心管10次（两手来回颠倒），然后室温静置4分钟（开盖后有拉丝的现象，说明效果较好）

5.加入350μl Buffer P3，立即温和颠倒离心管5次混匀（将离心

管在试管架上翻转过来左右摇晃5次）

6.12000×g离心10分钟，将上清液移入吸附柱（只能装750μl，应多次离心），9000×g离心30秒，倒掉收集管中液体 7.（选做）加入500μl Buffer DW1,9000×g离心30秒，倒掉收集管中液体

8.加入500μl Wash Solution，9000×g离心30秒，倒掉收集管中液体

9.重复步骤8一次

10.空吸附柱于9000×g离心1分钟

11.将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入

65μl Elution Buffer（60℃预热），室温静置一分钟后，离心1分钟，保存管中DNA溶液（-20℃） 六．结果分析与讨论

琼脂糖凝胶电泳结果显示质粒浓度偏小，未有明显条带。原因可能有

1.菌液浓度太低

2.质粒提取操作某些细节可能存在问题

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/9mq2.html