微核实验-毒理学-洋葱根尖染色体观察

微核试验

摘要：利用大蒜根尖细胞微核染色与计数技术测定不同浓度6价铬和1.2,4-三氯苯以及它们的不同浓度混合液对大蒜根尖分生区细胞微核率和细胞分裂各期的影响。以蒸馏水为对照组，设置的实验组为3组不同浓度的6价铬和三氯苯以及它们的混合液。用孚尔根染液法对不同试剂及各浓度的处理的根尖进行染色。在显微镜下观察各试剂各浓度处理下的微核率以及不同分裂期细胞的比例。 关键字：孚尔根染色法、微核、微核率、分裂期细胞

Abstract:Use of garlic root tip cell micronucleus dyeing and counting technology . Different concentrations of chromium 6 and 1,2, 4 - three hlorobenzene as well as their different concentration mixture to garlic root tip meristematic cells in the areas of micronucleus rate and the influence of each stage of cell division.With distilled water as control group, the group set up for the three groups of different concentrations of chromium 6 and 3 chlorobenzene and their mixture.Usefu's root dye solution for different reagent and the concentration of the treatment of root tip for dyeing. Under the microscope to observe the reagent concentration under the treatment of micronucleus rate and different proportion of split phase cells

Key Words：Fu's root staining method、micronucleus、Micronucleus rate、Split

phase cells

一、研究的目的与意义：

1：知道微核产生的原理。

2：学会识别微核以及计算微核率。

3：学用微核试验来评价药物、放射线、有毒物质等对人体细胞或体外培养细胞遗传学损伤。

4：了解不同化学试剂对细胞各个分裂期的影响。

由于大量新的化合物的合成，原子能应用，各种各样工业废物的排出，使人们很需要有一套高度灵敏，技术简单的测试系统来监视环境的变化。真核测试系统能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害。利用微核实验这种遗传毒性试验方法可以检测检测染色体或者有丝分裂器损伤，计数细胞的微核率。检测已存在或潜在的危害。

二、研究进展

微核( micronucleus, 简称 MCN) , 是真核生物细胞中的一种异常结构, 是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。一般认为, 微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体片断产生的。在细胞有丝分裂时, 受到有害理化因子的损伤, 染 色体发生断裂, 在下一次分裂后期, 丧失着丝粒的染色体片断行动滞后, 不能进

入子细胞的主核, 形成滞留在核外的微小染色质块, 即微核。有些研究者认为, 微核可以是细胞凋亡的产物, 当致畸因素导致凋亡基因激活, 内切酶激活, 切割 DNA, 形成细胞核碎片, 最终导致产生许多微核[1]。

微核试验广泛应用于药品、食品添加剂、农药、化妆品、工业化学品、环境污染物等遗传毒性的检测、安全性评价和遗传损害的监测, 为接触有害物质的人群提供遗传损害检测和工作环境监测, 为行政管理部门的决策、立法奠定理论依据。

污染物对人体或生物产生的损害可以方便快速地通过微核检测出来。蚕豆根尖微核技术作为水污染检测方法, 早在 1988 年就被国家环保局批准, 由许多研究表明, 蚕豆根尖微核技术在检测流域或湖泊水污染方面, 有非常好的效果, 有关这方面的研究较多。

氯苯类化合物是一类普遍存在于环境中的有毒有机污染物, 由于其具有致突变、致癌、致畸特征及其在环境中残留持久, 美国国家环保局所列129种优先控制污染物中氯苯类化合物占25种之多[2]。以未经适当处理的废水、垃圾、废气和废渣排放是向环境释放氯苯类化合物的重要污染源.。我国该类化合物污染也相当严重, 在沈阳等大城市及其周边地区的土壤及地下水检测浓度均较高。农作物受到氯苯类化合物污染后, 不仅影响其产量和质量, 更为严重的是氯苯类化合物经食物链进入人体, 并在人体内富集, 危害人体健康。因此, 研究这些污染物对生态系统可能带来的负面影响及其机理具有重要的理论和现实意义。

研究表明,TCB是细胞膜上 Ca2+ 通道的抑制剂, 通过降低细胞质中 Ca2+浓度, 阻止微管蛋白聚合而抑制微管的装配, 从而损害纺锤体的形成和功能, 导致染色体被阻止而停留在该分裂时期, 或使染色体不分离而形成多倍化细胞。结果表明 , 随TCB 浓度增加和处理时间延长, 蚕豆幼苗根长的生长及根尖细胞有丝分裂指数降低甚至停止。TCB 诱发蚕豆根尖细胞有丝分裂过程中染色体数目畸变和

[3]

结构畸变。

铬以Cr-2 到Cr+6等多种氧化态存在自然中，其中以三价和六价铬最稳定。铬的价态不一样，毒性也不一样。在一定的阈值内，三价铬是人和哺乳动物的必需元素，六价铬则有潜在的致癌性。由于铬的硬度大、抗腐蚀性能强，可与其他金属形成合金，因此，铬被广泛应用于国防、冶金、化学等行业。这些活动不可避免地导致大量含铬弃物排放，而这些废弃物主要是六价铬化合物，以铬酸根离子

2-［（CrO4）］存在，严重污染水、大气和土壤。据不完全统计，国内受铬严重污的土壤已愈1250万ｔ。铬污染土壤具有隐蔽性、滞后性、累积性和不可逆转等特性。进入土壤的铬具有较高的生物有效性，易被植物根系吸收并积累在植物体内，对植物产生严重的生理毒害作用，不仅影响其生长和发育，可通过食链最终影响人类健康。因此，研究铬污染对生态系统可能带来的负面影响及其作用机制具有重要的理论和实际意义。研究表明低质量浓度Cr6+促进蚕豆种子萌发，而高质量浓度Cr6+有抑制作用，并且随处理时间的延长，其最适质量浓度降低。当Cr6+质量浓度≤100㎎/L时，随着质量浓度的增加和处理时间的延长，蚕豆根尖细胞微核率增加。当Cr6+质量浓度为200㎎/L，处理超过48h后，随着处理时间的延长，其微核率反而下降[4]。

本实验根据前人的实验经验为前提采用大蒜根尖代替蚕豆根尖作为微核试验的材料，研究了不同浓度的1,2,4-三氯苯这一典型氯苯类化合物和不同浓度重铬酸钾溶液以及重铬酸钾和1,2,4-三氯苯的联合作用对大蒜根尖细胞有丝分裂指数及染色体畸变率的影响,旨在探讨铬离子对植物体的细胞毒性和遗传。

三、研究内容与技术路线

3.1 研究内容：

通过观察不同浓度的1,2,4-三氯苯和铬以及它们的交互作用对大蒜根尖细胞微核率以及不同分裂期细胞的比例的影响，来判断其遗传毒性。 3.2 技术路线：

冷冻保存

大蒜根尖培养处理24h 剪根固定解离染色制片观察

孚尔根染液配制

四、实验方法

4.1实验材料

大蒜、甲醇、冰乙酸、碱性品红、偏重亚硫酸钠、比重1.18的浓盐酸、蒸馏水、酒精、重铬酸钾、氯苯、丙酮、显微镜、载玻片、盖玻片、定性滤纸、烧杯、100毫升容量瓶、200毫升容量瓶、镊子、刀片、纱布、青霉素小瓶、移液管、试管

4.2试剂准备：

1、1mol/LHCl：用10mL移液管量取8.69mL浓盐酸加入100mL容量瓶，用在蒸馏水定容至100mL。

2、50mg/L、100mg/L、150mg/L Gr6+：称取170mg重铬酸钾，加水溶解，在200mL容量瓶中定容，配制300mg/L的Gr6+母液，然后稀释到50mg/L、100mg/L、150mg/L

3、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L 1,2,4-三氯苯：称取将1,2,4-三氯苯用少量丙酮溶解，配制1000mg/L 1,2,4-三氯苯母液，然后将稀释到浓度30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L

4、卡诺式固定液：将甲醇：冰乙酸按3:1比例混合配制

5、Schiff氏试剂：称取0.5g碱性品红加入到100mL煮沸的蒸馏水中，时时振荡，继续煮5min，使碱性品红充分溶解。冷却致50℃，用滤纸过滤，滤液中加入10ml1mol/LHCl，冷却致25℃，加入1.5g偏重亚硫酸钠，充分振荡，塞紧瓶塞，在室温暗处静置至少24h，用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封瓶塞，外包黑纸。贮存于冷暗处（4℃冰箱中）备用。

4.3实验过程：

4.3.1、材料准备：

将大蒜剥皮后放进垫了滤纸的培养基中，加入清水，放进25℃恒温培养箱中2~3天，催化大蒜生根。

选择根长0.5~1cm且不定根生长情况差不多的大蒜分为10组

4.3.2、Schiff氏试剂检验：

在大蒜生根之后，先选取一些根尖放进卡诺式固定液中固定3个小时，用Schiff氏试剂染色，镜检，观察染色体是否能染上色以及染色效果。若染色效果不行，则重新配制Schiff氏试剂，直至染色效果良好，然后将其贮存于4℃冰箱中准备使用。

4.3.3、大蒜根尖处理：

将分好组的大蒜分别用清水、50mg/L Gr6+、100mg/L Gr6+、150mg/L Gr6+、30 mg/L 1,2,4-三氯苯、40 mg/L 1,2,4-三氯苯、50 mg/L 1,2,4-三氯苯、浓度分别为50mg/L Gr6+和30 mg/L 1,2,4-三氯苯的混合液、100mg/L Gr6+和40 mg/L 1,2,4-三氯苯的混合液、150mg/L Gr6+和50 mg/L 1,2,4-三氯苯的混合液培养24小时。清水组为对照组。

4.3.4、固定：

在早上有丝分裂旺盛的时候，将处理过的大蒜根尖剪下，分别放入青霉素小瓶中，加入卡诺氏固定液固定3个小时，然后放入4℃冰箱内保存，以备使用。

4.3.5、解离：

取出部分经过固定的根尖先用酒精和清水洗涤，加入1mol/LHCl覆盖根尖，放入60摄氏度水浴锅内水浴加热7~10分钟，取出用清水洗涤3次，每次5分钟。

4.3.6、染色制片：

取出解离后的根尖，放在载玻片上，用刀片切下根尖乳白色的分生区部分，滴加1滴Schiff氏试剂染色10分钟，然后盖上盖玻片，吸干染液，并用镊子钝的一端在盖玻片上轻轻敲击，将细胞打散。

4.3.7、镜检:

将制备好的根尖放在显微镜下观察，统计微核数目、以及有丝分裂间期、前期、中期、后期、末期细胞数目并计算有丝分裂指数以及微核率。每组浓度细胞计数4000个。

微核识别标准：

（1）在主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核。 （2）小核着色与主核相当或稍浅。

（3）小核形态为圆形、椭圆形或不规则型。

五、试验结果分析

赤道板偏移有丝分裂前期

微核核崩解

有丝分裂末期有丝分裂后期

双核有丝分裂中期

分组 表1 试验结果统计 细胞总前期数中期数后期数末期数微核数 数 目 目 目 目 清水 50mg/L Gr6+ 100mg/L Gr6+ 150mg/L Gr6+ 30mg/L 1,2,4-三氯苯 3840 3784 3766 5327 3380 34 12 0 12 25 27 29 10 21 6 14 6 0 4 21 21 34 12 8 1 21 1 0 11 20 38 38 31 19 5 3 2 0 2 5 16 10 32 4 2 3 14 27 7 7 6 7 6 5 4 40mg/L 1,2,4- 3905 三氯苯 50mg/L 1,2,4- 4400 三氯苯 50mg/L Gr6+和30mg/L 1,2,4-三氯苯 100mg/L Gr6+ 和40mg/L 1,2,4-三氯苯 150mg/L Gr6+ 和50mg/L 1,2,4-三氯苯 3505 4166 3987 分组

表2试验计算结果 前期数目 中期数目 后期数目 末期数有丝分微核率 目 裂指数 0.08% 0.36% 0.078% 清水 0.88% 0.36% 0.55% 50mg/L Gr6+ 100mg/L Gr6+ 150mg/L Gr6+ 0.32% 0 0.23% 0.16% 0 0.08% 0.62% 0.54% 0.77% 0.34% 0.19% 0.025% 0.03% 0 0.21% 0.59% 0.097% 0.86% 0.88% 0.46% 0.125% 0.06% 0 0.04% 0.15% 0.41% 0.23% 0.91% 0.10% 0.05% 30mg/L 1,2,4- 0.74% 三氯苯 40mg/L 1,2,4- 0.69% 三氯苯 50mg/L 1,2,4- 0.66% 三氯苯 50mg/L Gr6+和30mg/L 1,2,4-三氯苯 100mg/L Gr6+ 和40mg/L 1,2,4-三氯苯 150mg/L Gr6+ 和50mg/L 1,2,4-三氯苯 0.29% 0.5% 0.15% 0.16% 0 0.075% 0.62% 0.54% 0.78% 0.34% 0.12% 0.025% 0. 37% 0. 72% 0.13% 0.2% 0.15% 0.12% 0.17% 0.19% 0.1% 1,2,4-三氯苯0.90%0.80%0.70%0.60%0.50%0.40%0.30%0.20%0.10%0.00%-通用格式-通用格式-通用格式-通用格式-通用格式-通用格式-通用格式mg/L微核率有丝分裂指数1,2,4-三氯苯和Gr6+0.40%0.35%0.30%0.25%0.20%0.15%0.10%0.05%0.00
2mg/L34微核率有丝分裂指数

图5-1

5.1、Gr和1,2,4-三氯苯对大蒜根尖细胞有丝分裂的影响和微核率的影响

如图5-1所示，单独使用1,2,4-三氯苯处理大蒜根尖的实验组，有丝分裂指数先降低后增大，在浓度为40mg/L的时候达到最小值，可见，1,2,4-三氯苯对大蒜根尖分生细胞有丝分裂有着显著地影响，但是要受到1,2,4-三氯苯浓度的限制，浓度40mg/L的时候对有丝分裂指数的影响最大。同时，随着1,2,4-三氯苯浓度的增加，微核率逐步下降，浓度分别为30 mg/L、40mg/L、50mg/L的1,2,4-三氯苯处理过的微核率分别为0.2%、0.15%、0.12%，清水对照组的为0.078%，与清水对照组相比，经过1,2,4-三氯苯处理过的根尖的微核率有显著提高。

单独使用Gr6+处理打算根尖的实验组，，随着Gr6+浓度增加，细胞有丝分裂指数呈逐步递减状态，且在浓度为50mg/L的时候，细胞有丝分裂指数为最大值为0.16%，但是，与清水对照组0.36%的有丝分裂指数相比，大蒜根尖有丝分裂

6+

指数明显降低，意味着Gr能有效的抑制大蒜根尖细胞的有丝分裂。随着处理物质Gr6+浓度的增加，大蒜根尖细胞的微核率呈现增大再减小状态，在100mg/L的时候，微核率达到最大。浓度分别为50 mg/L、100mg/L、150mg/L的Gr6+处理过

6+

Gr6+0.80%0.70%0.60%0.50%0.40%0.30%0.20%0.10%0.00%-通用格式-通用格式-通用格式-通用格式-通用格式mg/L微核率有丝分裂指数的微核率分别为0.37%、0.72%、0.13%，清水对照组的为0.078%，可见，经过Gr6+处理过的根尖的微核率有显著提高。

在Gr6+与1,2,4-三氯苯共同作用的实验组，随着Gr6+与1,2,4-三氯苯处理浓度的增加，微核率先增后减，在处理浓度为100mg/L Gr6+ 和40mg/L 1,2,4-三

氯苯的时候，微核率达到最大值，大蒜根尖分生细胞有丝分裂指数逐步下降，浓度为50mg/L Gr6+和30mg/L 1,2,4-三氯苯、100mg/L Gr6+ 和40mg/L 1,2,4-6+

三氯苯150mg/L Gr和50mg/L 1,2,4-三氯苯处理的大蒜根尖有丝分裂指数为0.34%、0.12%、0.025%，微核率为0.17%、0.19%、0.1%。微核率提高，有丝分裂指数下降。

大蒜根尖经过1,2,4-三氯苯处理，在形成微核同时，存在很多双核细胞这表明，1,2,4-三氯苯可以破坏细胞有丝分裂纺锤题的形成，从而导致染色体畸变。经过Gr6+处理微核率，细胞有丝分裂遭到阻滞，细胞基本处于有丝分裂间期，分裂期的细胞很少，微核率提高，同时产生大量的双核细胞、核崩解细胞以及赤道板偏移等畸变，染色体畸变严重。

在Gr6+与1,2,4-三氯苯共同作用下，阻滞细胞有丝分裂的情况更加明显，与清水对照组相比，微核率也提高；与单独使用Gr6+处理相比，微核率降低；与单独使用1,2,4-三氯苯处理相比，微核率增加。表明对于阻滞大蒜根尖细胞有丝分裂，Gr6+和1,2,4-三氯苯有协同作用，对于细胞微核率，有相互抑制作用。

6+

5.2、Gr和1,2,4-三氯苯对大蒜根尖细胞有丝分裂分裂周期的影响

有丝分裂各期细胞数目1.00%0.80%0.60%0.40%0.20%0.00345678910组别前期中期后期末期图5-2

组别：1为清水，2、3、4分别为50、100、150mg/LGr6+，5、6、7分别为30、40、50mg/L1,2,4-三氯苯，8、9、10分别为Gr6+和1,2,4-三氯苯混合物

6+

在经过24h处理之后，Gr组的细胞有丝分裂各期比例明显降低，1,2,4-三氯苯组分裂前期细胞比例基本不变，但是处于后、末期的细胞比例明显增大，分裂期中处于细胞后、末期时间延长。Gr6+和1,2,4-三氯苯混合浓度有丝分裂各期所占比例随着处理浓度的增加而递减，有丝分裂的阻滞作用越来越明显。

六、讨论

1、初步观察结果

经过初步观察统计，经1，2，4-三氯苯溶液处理过的根尖细胞，微核等染色体变异现象较少，且处于分裂期的细胞较少（与空白组比较）；Cr6+溶液处理过的根尖细胞，微核、双核、赤道板偏移等变异现象出现率均有所提高，但几乎找不到处于细胞分裂中期的细胞。

2、后面几组染色效果偏差：

在对根尖进行染色时，由于染色用的Schiff试剂已经配制了接近7天，染色能力可能有所下降，经染色的细胞核呈较淡的橘红色，并非明显的紫红色，染色的模糊可能会影响对高度螺旋的染色体的观察，导致观察Cr6+溶液处理的根尖细胞时，难以分辨出分裂期细胞，影响实验结果。还有一种情况就是解离过度，破坏了细胞结构，染色效果下降。

七、小结

两个星期的实验说长不长，说短不短，但却是我的大学学习中非常有意义的一次实验实践。通过大蒜根尖的培养、染毒、解离、染色、显微镜观察等一系列实验步骤，我掌握熟练了大蒜根尖的诱导培养方法、电子天平的使用和一些操作技巧、孚尔根染液的配制、大蒜根尖的解离制片的方法、显微镜的操作技巧以及相关软件的使用等一系列实验技巧。此外在师兄师姐的帮助指导下学会了pH计、分光光度计、浊度计等实验仪器的使用方法。

八、心得体会

两个星期的起早摸黑，我们付出的不过是少睡几个懒觉，晚点吃饭，但在这期间我们收获的却是比这些付出更有价值有意义的实验经验和心得体会。我认为此次实验的目的不在于实验结果，而在你是否认真亲自动手，在于自身在实验期间所掌握的实验技巧以及实验期间的点滴体会。

我的第一个体会便是关于实验器材的整理保管问题。我在此次创新实验之前除了课程所要求的实验外，基本没接触过其他的实验，更没有跟老师做项目的经验。所以对实验室非常的陌生，以至于在实验刚开始时连简单的实验器材都找不到更别说做实验了，最后还是老师帮我们订购了才得以继续实验。其实想想也是 实验室就那么大，一二十个人在做实验，你自己的实验器材不保管好别人就会拿去用，几经转手之后，你自己想做实验的时候反而找不着了。这样不仅实验效率低，还浪费钱，浪费时间。我想这是老师给我们上的第一节课吧。自己的实验器材不用的时候要清洗好，贴好标签，保管好。我想这样不仅能提高实验器材的使用寿命，还能提高实验的效率以及实验结果的精确度。

我的第二点体会是实验是一项耐心活，细心活。实验溶液的配置是实验的基础，实验溶液的好坏直接影响到实验结果，而溶液的配备并非把几种试剂混合在一起拌匀了那么简单。在配置孚尔根染液的过程中，由于盐酸浓度的计算错误，我们配置出来的孚尔根染液很刺鼻，染色效果不是很好。但我们并没有因此而将就使用，而是经过一次次计算后，再耐心的重配，前后共重配了4次，每配一次就会要一个下午的时间。但我觉得这都不算什么，实验就是一个不断探索的过程，哪

怕是在一件很小的事上。实验是需要耐心和细心的，这是一个合格的实验者的必备品质。

参考文献：

1.李宏.微核试验的研究进展,安徽农业科学, Journal of Anhui Agri. Sci. 2009, 37( 7): 2864- 2866

2.刘宛,周启星,李培军,孙铁珩,台培东,许华夏,张春桂,张海荣氯苯胁迫对蚕豆幼苗生长和细胞分裂的影响 《应用生态学报》2003年第04期

3.Xia S J ( 夏 世 钧) . 2001. M olecular Toxicology Basis. Wuhan: Hubei S cience and Technology Press. 99~ 251( in Chinese)

6+

4.王爱云，夏文睿，荣玮，刘茜 Cr胁迫对蚕豆幼苗根生长和细胞分裂的影响.西北农业学报，2012,21（6）：79-85

怕是在一件很小的事上。实验是需要耐心和细心的，这是一个合格的实验者的必备品质。

参考文献：

1.李宏.微核试验的研究进展,安徽农业科学, Journal of Anhui Agri. Sci. 2009, 37( 7): 2864- 2866

2.刘宛,周启星,李培军,孙铁珩,台培东,许华夏,张春桂,张海荣氯苯胁迫对蚕豆幼苗生长和细胞分裂的影响 《应用生态学报》2003年第04期

3.Xia S J ( 夏 世 钧) . 2001. M olecular Toxicology Basis. Wuhan: Hubei S cience and Technology Press. 99~ 251( in Chinese)

6+

4.王爱云，夏文睿，荣玮，刘茜 Cr胁迫对蚕豆幼苗根生长和细胞分裂的影响.西北农业学报，2012,21（6）：79-85

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/9jfp.html