实验九 植物原生质体的分离和培养

实验九 植物原生质体的分离和培养

实 验 目 的

掌握植物原生质体分离和培养的基本方法，并对培养的结果进行初步观察。

实 验 原 理

原生质体是除去细胞壁的裸露细胞。在适宜的培养条件下，分离的原生质体能合成新壁，进行细胞分裂，并再生成完整植株。

植物的幼嫩叶片、子叶、下胚轴、未成熟果肉、花粉四b咻、培养的愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为分离原生体的材料来源。

分离愿生厦籀萨采用酶解法。其原理是根据由纤维素酶、罘胶酶和半纤维素酶配制而成的溶液对细胞壁成分的降解作用，而使原生质体释放出来。原生质体的产率和活力与材料来源、生理状态、酶液的组麟，以及原生质体收集方法有关。酶液通常需要保持较高的渗透压，以使原生质体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离之后不致膨胀破裂。渗透剂常用甘露醇，山梨醇，葡萄糖或蔗糖。酶液中还应含一定量的钙离子，来稳定原生质膜。游离出来的原生质体可用过筛一低速离心法收集，用蔗糖漂浮法纯既，然后进行培养。

实 验 用 品

一、材料

1.烟草幼苗的叶片、或向日葵无菌苗的叶片、子叶或下胚轴等。 2.胡萝卜根切片诱导的松软愈伤组织。

二、器材

超净工作台、台式离心机或手摇离心机、倒置显微镜、普通显微镜、培养室、灭菌锅、血细胞计数板、石蜡膜带等。

细菌过滤器和0·45μm的滤膜、300目不锈钢网筛及配套的小烧杯、解剖刀、尖头镊子、注射器(5、10m1)和12号长针头、带皮头的刻度移液管(5、10ml，上部管口加棉塞)、培养皿(直径6cm)或扁平培养瓶(50m1)、大培养皿、吸水纸等、使用前需经过灭菌。 三、试剂

1. 70％酒精。

2. 0.1％升汞水溶液，并滴入少许TWeen 80。 3. 灭菌蒸馏水。

4. 0.16mo／L和0.20mo／L CaCl2·2H2O溶液，并加有0.1％MES（2-N-吗啉已烷磺酸），PH5.8~6.2。

5. 20％和12％蔗糖溶液，pH PH5.8~6.2。 6. 酶液A

纤维素酶(cellulase，Onozuka R-10 2％ 果胶酶(13ectinase，Serva) 1 % (若用国产EA3-867纤维索酶，则果胶酶可省去。)

甘露醇 0.6 mol／L CaCl2·2H2O 0.05 mol／L MES 0.1％ pH 5．8～6．2 7．酶液B

纤维素酶(Onozuka R-10) 2％

离析酶(Macerozyme R-10) 1％

半纤维素酶(hemicellulase，Sigma) 0.2％

甘露醇 0.4 mol／L CaCl2·2H20 0.1％ MES PH5.8～6.2

表22-1 DPD培养基

成分 NH4N03 KN03 MgSO4·7H20 CaCl2·2H2O KH2P04 Fe SO4·7H20 Na2-EDTA MnSO4·H2O Na2MoO4·2H2O H3BO3 ZnSO4·7H2O CuSO4·5H2O CoCl2·6H2O 9．C81V培养基(表22-2)

表22-2 C81V培养基

成分 NH4N03 柠檬酸铵 尿素 MgSO4·7H20 CaCl2·2H2O KH2P04 NaHCO3 Fe SO4·7H20 Na2-EDTA MnSO4·H2O KI CoCl2·6H2O ZnSO4·7H2O CuSO4·5H2O H3BO3 Na2MoO4·2H2O 含量（mg/L） 1000 100 100 250 400 100 150 27.8 37.3 10 0.75 0.025 2 0.025 3 0.25

成分 烟酸 盐酸吡哆锌 盐酸硫胺素 肌醇 叶酸 水解酪蛋白 甘氨酸 谷氨酰胺 色氨酸 胱氨酸 蛋氨酸 胆碱 葡萄糖 玉米素 萘乙酸 pH 含量（mg/L） 1 1 10 200 1 500 10 100 10 10 5 10 0.38 mol／L 0.1 0.2 5.8 含量（mg/L） 270 1480 340 570 80 27.8 37.3 5 0.1 2 2 0.015 0.01

成分 KI 烟酸 盐酸吡哆锌 盐酸硫胺素 肌醇 叶酸 甘氨酸 生物素 蔗糖 甘露醇 2，4一D 激动素 pH 含量（mg/L） 0.25 4 0.7 4 100 0.4 1.4 0.04 2000 0.3 mol／L 1 0.5 5.8 8．DPD培养基(表22-1)

10. 0.1％酚藏花红(配在0.4 mol／L甘露醇中)。 11. 0.01％荧光增白剂(配在0.3 mol／L甘露醇中)。

(3、4、5用高压灭菌，6、7、8、9用过滤灭菌。)

实 验 方 法

一、叶肉原生质体的分离和培养

1. 取充分展开的叶片，用自来水冲洗干净。(以下步骤均在超净台上进行)。

2. 将叶片在0·1％升汞溶液中浸泡灭菌10min，中间摇动几次。取出后用无菌蒸馏水漂洗5次 3. 将叶片移入大培养皿中，用吸水纸吸去上面的水珠。然后将叶背面朝上，小心用镊子撕去下表皮。

4. 将撕去下表皮后的叶片放进预先放有酶液A的培养皿或带盖兰角瓶中，每10ml酶液约放2g叶片。若叶片不易撕下下表皮，可用锋利的解剖刀将叶片切成约0.5mm宽的小条，放入酶液。

5. 将培养皿用石蜡膜带封口，在28℃条件下保温3～6h，中间轻轻摇动2～3 。在倒置显微镜下检查，直到产生足够量的原生质体。 6. 将酶解后的原生质体悬浮液用不锈钢网筛过滤到小烧杯中，以除去未酶解完全的组织。

7. 将滤液分装在刻度离心管中，用600r／min的速度离心5min，使原生质体沉淀下来。 8. 用移液管吸去上清液。将沉淀的原生质体悬浮在2ml 0.2 mol／L的CaCl2·2H2O中。 9. 用注射糙生长针头)向离心簧生部缓缓注入20％蔗糖溶液6ml，在600r／min下离心 5min。此步完成后，在两相溶液的界面之间将出现一层纯净的完整原生质体带，杂质，碎片将沉到管底。

10. 注射器吸出管底杂质和下部的蔗糖溶液及上部的CaCI2·2H2O溶液。 11. 离心管中留下的纯净原生质体用8ml 0.2 mol／L的CaCl2·2H2O悬浮。离心离心5min，吸去上清液。再用培养基如法洗涤一次。

12. 将收集的原生质体悬浮在适量DPD培养基中，将其密度调整到5X104／m1左右(可用血细胞计数板统计原生质体的密度)。

13. 用皮带头的刻度移液管将原生质体悬液分装在培养皿中，每皿放2m1。 14. 用石蜡膜带封口。置26℃左右条件下进行暗培养。 二、愈伤组织原生质体的分离和培养 1. 胡萝卜松软愈伤组织的诱导和保存

(1) 取田间生长两个月左右的植株的根，用自来水冲洗干净。

(2) 在70％酒精中浸泡2min，取出后放在0.1％升汞溶液中浸泡10min。再用灭菌蒸

馏水换洗5次。 (以下操作在超净工作台上进行)

(3) 在大培养皿中用解剖刀切取根中央部分，并切成3～5mm厚的横切片。

(4) 将切片摆放在含2mg／L 2，4-D、0.2mg／L激动素和500mg／L。水解酪蛋白的MS培养基上。在26℃左右条件吓进行暗培养，诱导愈伤组织。

(5) 培养2周以后，用镊子将外植体周围形成的愈伤组织取下转移到新鲜培养基上。 (6) 连续继代培养多次，每三周转移一次。待愈伤组织成为松软状态便可用于分离原

生质体。

2. 取转代培养一周左右，并处于旺盛生长期的愈伤组织，直接放在酶液B中，每10ml酶

液放2g左右。在室温下保温过夜，或26℃下保温6h以上，直到产生足够量的原生质体。

3. 将酶解后的原生质体悬液用不锈钢网筛过滤，除去未完全消化的组织。

4. 向过滤液中加入等体积的0.16 rnol／L CaCl2·2H2O溶液，混合之后转移到带盖离心管中。 5. 吸去上清液，将沉淀的原生质体悬浮在2ml 0.16 rnol／L CaCl2·2H2O溶液中。

6. 用注射器向离心管底部缓缓注入12％蔗糖溶液6ml，然后离心5～10min。两相溶液界面间应出现纯净原生质体带，管底出现杂质沉淀。

7. 将注射器插入管底，吸出沉淀的杂质。并吸出下部蔗糖液及上部钙液。

8. 用0.16 mol／LCaCl2·2H2O悬浮，离心一次，再用C81V培养基如法洗涤一次。 9. 用C81V培养基培养，其操作同叶片原生质体培养。 三、培养结果观察 1．活力检查

凡是活力的原生质体均呈现圆球行，在显微镜下可观察到明显的胞质环流运动。在叶肉原生质体中由于叶绿体的阻挡，看不清胞质环流。可取一滴原生质体悬液放在载波片上，加一漓0.1％酚藏花红溶液，凡生活的原生质体均不着色，而死去的原生质体立即着染成红色。 2. 细胞壁再生的观察

培养24～28h后，大部分原生质体已再生新壁。并且体积增表，变成椭圆形。可用以下方法别细胞壁的再生。

（1）取一滴原生质体培养悬液放在载波片上，加一滴高浓度（25％）蔗糖溶液，有壁的细

胞将发生质壁分离。 （2）取一滴原生质体培养悬液放在载玻片上，加一滴0.01％荧光增白剂溶液。在荧光显微

镜下，当用366nm波长的紫外光照射时，细胞壁将发黄绿色荧光。 3. 细胞分裂的观察

培养4天以后，将出现第一次分裂，可在倒置显微镜下观察。在培养8～10天后，应统计分裂频率，即出现分裂的原生质体占成活原生质体的百分率。 一般在细胞团形成后(大约在培养的15~20天)，应向培养瓶中补加渗透剂减半的新鲜培养基，以促进细胞团的增殖。待小愈伤组织形成后，转移到固体培养基上，进行植株分化的条件试验。

思 考 题

1. 酶解液以及原生质体起始培养液中，为何要保持较高的渗透压？ 2. 为何在培养一段时间后，需向培养瓶补加降低渗透压的新鲜培养基? 3. 如何判断分离原生质体的活力和新壁再生?

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