IPTG诱导方法

ITPG诱导方法

1、诱导

将BL-pET-FAT/CD36菌液接种到4 mL LA液体培养基中，37 ℃，200 rpm振摇培养过夜。

（IPTG浓度）取100 μL培养过夜的菌液接种到5 mL LA液体培养液中，共接8管，37 ℃，200 rpm振摇培养至OD600至0.6~0.8时，加入1 M的IPTG，使IPTG终浓度分别为使IPTG终浓度分别为0，0.01，0.1，0.2，0.5，1， 5，10 mM，置37 ℃摇床继续培养4 h，置4 ℃保存备用。

另取不含外源基因片段的质粒pET-32a(+)转化BL21感受态细胞作相同处理，加IPTG诱导4 h作为对照。样品处理后进行SDS-PAGE分析。

（诱导时间）取100 μL培养过夜的菌液接种到5 mL LA液体培养液中，共接8管，37 ℃，200 rpm振摇培养至OD600至0.6~0.8时，加入1 M的IPTG，使IPTG终浓度为0.5 mM，进行诱导表达，分别在诱导0、1、2、3、4、6、8、12 h时，每次取出一个离心管，置4 ℃保存备用。

另取不含外源基因片段的质粒pET-32a(+)转化BL21感受态细胞，加IPTG诱导4 h作为对照。样品处理后进行SDS-PAGE分析。

2、样品处理（0.5 mM、6h找出最佳IPTG浓度和诱导时间） 取100 μL培养过夜的菌液接种到5 mL LA液体培养液中，37 ℃，200 rpm振摇培养至OD600至0.6~0.8时，加入1 M的IPTG，使IPTG终浓度为？？？ mM，诱导？？？h，10000 rpm离心1 min收集菌体，弃上清。

在细菌沉淀中加入1 mL 1×结合缓冲液，冰浴超声50次，每次4s，间隔9s，超声结束后13000 rpm离心30 min，分离上清和沉淀。

取上清50 μL，加入50 μL 2×SDS上样缓冲液；沉淀加入500 μL 1×SDS上样缓冲液，均在100 ℃水浴加热5 min，用于SDS-PAGE电泳

3、SDS-PAGE分析 （1）样品的处理

取1 mL菌液，10000 rpm离心1 min，弃上清，重悬于100 μL 去离子水，加入100 μL 2×SDS凝胶上样缓冲液，涡旋混匀，100 ℃加热3-5分钟，10000 rpm离心3 min备用。

（2）SDS-PAGE凝胶的制备 ①按下列配方组成配制4 mL 12%分离胶

H2O 1.32 mL，30%凝胶贮备液1.6 mL，分离胶缓冲液1 mL，10%SDS 0.04 mL，

10%过硫酸铵0.04 mL，最后加入TEMED 0.002 mL。 ②一旦加入TEMED，混匀后立即小心将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，注意为积层胶留有足够的空间。轻轻在其顶层加入2 mL去离子水，覆盖凝胶，以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。 ③聚合完成之后，倒掉覆盖在凝胶上层的液体，尽可能用滤纸吸干凝胶顶层的残存液体。 ④按下列配方组成配制1 mL 5%积层胶

H2O 0.675 mL，30%凝胶贮备液0.1675 mL，积层胶缓冲液0.125 mL，10%SDS 0.01 mL，10%过硫酸铵0.01 mL，最后加入TEMED 0.001 mL。 将积层胶灌入分离胶上面，插入梳子，垂直放置于室温下。 ⑤积层胶聚合完成后，用去离子水冲洗梳孔。将凝胶放入电泳槽上，加入电泳缓冲液，小心拔出梳子。

（3）电泳 ①安装好电泳槽，将电极插头与适当的电极相连。 ②开始时电压为8V/cm，染料进入分离胶后，将电压增加到15 V/cm。继续电泳直到染料到达分离胶底部，断开电源。 ③取下凝胶，将凝胶置于考马斯亮蓝染色液中放摇床上缓慢旋转3-4小时或过夜。 ④换掉并回收染色液。用脱色液浸泡凝胶，缓慢摇动4-8小时，其间换液3-4次。继续脱色，直到满意为止。 ⑤用凝胶成像系统对凝胶进行照相和分析。

我们一般都是用乙醇的：

染色液：1g考兰（R－250），300ml乙醇，100乙酸，纯水定容至1000ml.搅拌过夜，再过滤

脱色液：500ml乙醇，100ml乙酸，纯水定容至1000ml 我们这是生产用量，你可以按比例减量

（切胶免疫）

……………………………… 兔

1、抗原制备 （1）配制10%分离胶和5%浓缩胶,将浓缩后的蛋白与10×电泳加样缓冲液混合，100℃煮沸10分钟,进行恒流电泳,浓缩胶电压为80V,分离胶电压为180V。 （2）电泳后,将凝胶用考马斯亮蓝R250染色。

（3）在分子量约为3kDa处可见较宽条带,切取该条带,进行研磨,-20℃冻存。

2、动物免疫 （1）将制备好的抗原分别免疫2只大耳白雌兔,首次免疫剂量为1 mg /只,经皮下多点及腹腔注射,

（2）3周后进行第二次免疫,剂量及免疫途径同首次免疫。 （3）二次免疫后测定血清效价,并用Western确认免疫效果。

3、高丰度蛋白多克隆抗体的制备

免疫效果验证的大耳白兔,经心脏穿刺放血处死,动物血静置2小时,2000r/min离心,获得动物血清,此即多克隆抗体。

4、Western蛋白印记鉴定多克隆抗体

（1）将超滤浓缩后腮腺液分别与2×还原型及非还原型电泳加样缓冲液混合,100℃煮沸10分钟,制备还原型及非还原型样本

（2）进行常规恒流电泳,电泳后,电转于硝酸纤维素膜上,电压18V,时间30分钟 电转后,将硝酸纤维素膜置于5%脱脂奶粉进行封闭1小时以上,免疫后兔血清(多抗)1∶1000稀释作一抗进行孵育过夜,正常兔血清1∶1000稀释作阴性对照,TBST作空白对照

（3）次日,TBST洗膜4次,15min /次,辣根过氧化物酶标记羊抗兔及辣根过氧化物酶标记羊抗兔(IgG)1∶10000稀释作二抗孵育1小时,TBST洗膜3次,TBS洗膜1次，15min /次,曝光1～2min,显影。

3、扩大培养

将BL-pET-FAT/CD36菌液接种到4 mL LA液体培养基中，37 ℃，200 rpm振摇培养过夜。

取500 μL培养过夜的菌液接种到含500 mL LA液体培养液的三角培养瓶中，共6瓶，37 ℃，200 rpm振摇培养至OD600至0.6~0.8时，加入1 M的IPTG，使IPTG终浓度为0.5 mM，诱导6 h

4、蛋白纯化

（1）融合蛋白的变性裂解上清液的制备

由于表达产物为包涵体的非可溶性蛋白，因此需进行蛋白质的变性，操作步骤如下：

①4 ℃，10000 rpm离心10 min收集菌体。

②称量细菌湿重，按每克细菌湿重用5 mL 8 M尿素的1×结合缓冲液，重新悬浮细菌。 ③将悬浮液在室温条件下置摇床上温和摇动1 h。 ④12000 rpm室温离心20 min。 ⑤上清液即为蛋白质的变性液，弃沉淀。 ⑥纯化之前用0.45 μm滤膜过滤上清。

（2）层析柱的制备

当树脂沉降、保存液的液面降至树脂表面时，按以下顺序清洗、离子化和平衡色谱柱： ①3倍体积灭菌去离子水； ②5倍体积1×离子化缓冲液； ③3倍体积8 M尿素的1×结合缓冲液。

（3）柱层析 ①待8 M尿素的1×结合缓冲液下降至层析柱表面，小心加入制备好的融合蛋白变性裂解上清液。 ②用10倍体积8 M尿素的1×结合缓冲液过柱。 ③用6倍体积8 M尿素的1×漂洗缓冲液过柱。 ④用6倍体积8 M尿素的1×洗脱缓冲液洗脱结合蛋白，按需要分段收集洗脱缓冲液。 ⑤用3倍体积8 M尿素的1×结合缓冲液过柱。 ⑥用1倍体积8 M尿素的1×结合缓冲液保存层析柱。 2.2.4.16 蛋白的透析

（1）将成卷的透析袋剪下适用的长度（一般为20-30 cm），在过量的10 mmol/L

NaHCO3中润湿透析袋，并煮沸几分钟。在5 mmol/L Na2EDTA煮沸几分钟。 （2）重复一次。

（3）用去离子水洗数次，于5 mmol/L Na2EDTA（或20%-50%的乙醇）中保存于

4 ℃以防分解纤维素的微生物生长。

（4）在透析袋的一端打两个死结。

（5）用移液管将欲透析的蛋白移入透析袋。 （6）在透析袋的另一端打两个死结，并将其依次放入10倍于蛋白质溶液以上体

积的蛋白质透析缓冲液Ⅰ-Ⅸ中，用磁力搅拌器缓慢的搅拌，以促进溶液的交换。在每种缓冲液中透析4 h以上，达到平衡后更换透析液。 （7）将纯化蛋白透析到去离子水中。

5、蛋白的浓缩

将透析袋放入20%聚乙二醇溶液中进行蛋白透析 将纯化蛋白浓缩至一定体积，取出透析袋 用蒸馏水冲洗4-5次后吸出浓缩的蛋白 再用蒸馏水冲洗透析袋内壁2次。

以稀释的牛血清白蛋白（BSA）为对照，将浓缩后的蛋白质进行SDS-PAGE电泳分析，用核酸蛋白测定仪测定浓度，置于-20 ℃保存。

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