IPTG诱导方法
更新时间:2023-11-24 01:44:01 阅读量: 教育文库 文档下载
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ITPG诱导方法
1、诱导
将BL-pET-FAT/CD36菌液接种到4 mL LA液体培养基中,37 ℃,200 rpm振摇培养过夜。
(IPTG浓度)取100 μL培养过夜的菌液接种到5 mL LA液体培养液中,共接8管,37 ℃,200 rpm振摇培养至OD600至0.6~0.8时,加入1 M的IPTG,使IPTG终浓度分别为使IPTG终浓度分别为0,0.01,0.1,0.2,0.5,1, 5,10 mM,置37 ℃摇床继续培养4 h,置4 ℃保存备用。
另取不含外源基因片段的质粒pET-32a(+)转化BL21感受态细胞作相同处理,加IPTG诱导4 h作为对照。样品处理后进行SDS-PAGE分析。
(诱导时间)取100 μL培养过夜的菌液接种到5 mL LA液体培养液中,共接8管,37 ℃,200 rpm振摇培养至OD600至0.6~0.8时,加入1 M的IPTG,使IPTG终浓度为0.5 mM,进行诱导表达,分别在诱导0、1、2、3、4、6、8、12 h时,每次取出一个离心管,置4 ℃保存备用。
另取不含外源基因片段的质粒pET-32a(+)转化BL21感受态细胞,加IPTG诱导4 h作为对照。样品处理后进行SDS-PAGE分析。
2、样品处理(0.5 mM、6h找出最佳IPTG浓度和诱导时间) 取100 μL培养过夜的菌液接种到5 mL LA液体培养液中,37 ℃,200 rpm振摇培养至OD600至0.6~0.8时,加入1 M的IPTG,使IPTG终浓度为??? mM,诱导???h,10000 rpm离心1 min收集菌体,弃上清。
在细菌沉淀中加入1 mL 1×结合缓冲液,冰浴超声50次,每次4s,间隔9s,超声结束后13000 rpm离心30 min,分离上清和沉淀。
取上清50 μL,加入50 μL 2×SDS上样缓冲液;沉淀加入500 μL 1×SDS上样缓冲液,均在100 ℃水浴加热5 min,用于SDS-PAGE电泳
3、SDS-PAGE分析 (1)样品的处理
取1 mL菌液,10000 rpm离心1 min,弃上清,重悬于100 μL 去离子水,加入100 μL 2×SDS凝胶上样缓冲液,涡旋混匀,100 ℃加热3-5分钟,10000 rpm离心3 min备用。
(2)SDS-PAGE凝胶的制备 ①按下列配方组成配制4 mL 12%分离胶
H2O 1.32 mL,30%凝胶贮备液1.6 mL,分离胶缓冲液1 mL,10%SDS 0.04 mL,
10%过硫酸铵0.04 mL,最后加入TEMED 0.002 mL。 ②一旦加入TEMED,混匀后立即小心将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中,注意为积层胶留有足够的空间。轻轻在其顶层加入2 mL去离子水,覆盖凝胶,以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。 ③聚合完成之后,倒掉覆盖在凝胶上层的液体,尽可能用滤纸吸干凝胶顶层的残存液体。 ④按下列配方组成配制1 mL 5%积层胶
H2O 0.675 mL,30%凝胶贮备液0.1675 mL,积层胶缓冲液0.125 mL,10%SDS 0.01 mL,10%过硫酸铵0.01 mL,最后加入TEMED 0.001 mL。 将积层胶灌入分离胶上面,插入梳子,垂直放置于室温下。 ⑤积层胶聚合完成后,用去离子水冲洗梳孔。将凝胶放入电泳槽上,加入电泳缓冲液,小心拔出梳子。
(3)电泳 ①安装好电泳槽,将电极插头与适当的电极相连。 ②开始时电压为8V/cm,染料进入分离胶后,将电压增加到15 V/cm。继续电泳直到染料到达分离胶底部,断开电源。 ③取下凝胶,将凝胶置于考马斯亮蓝染色液中放摇床上缓慢旋转3-4小时或过夜。 ④换掉并回收染色液。用脱色液浸泡凝胶,缓慢摇动4-8小时,其间换液3-4次。继续脱色,直到满意为止。 ⑤用凝胶成像系统对凝胶进行照相和分析。
我们一般都是用乙醇的:
染色液:1g考兰(R-250),300ml乙醇,100乙酸,纯水定容至1000ml.搅拌过夜,再过滤
脱色液:500ml乙醇,100ml乙酸,纯水定容至1000ml 我们这是生产用量,你可以按比例减量
(切胶免疫)
……………………………… 兔
1、抗原制备 (1)配制10%分离胶和5%浓缩胶,将浓缩后的蛋白与10×电泳加样缓冲液混合,100℃煮沸10分钟,进行恒流电泳,浓缩胶电压为80V,分离胶电压为180V。 (2)电泳后,将凝胶用考马斯亮蓝R250染色。
(3)在分子量约为3kDa处可见较宽条带,切取该条带,进行研磨,-20℃冻存。
2、动物免疫 (1)将制备好的抗原分别免疫2只大耳白雌兔,首次免疫剂量为1 mg /只,经皮下多点及腹腔注射,
(2)3周后进行第二次免疫,剂量及免疫途径同首次免疫。 (3)二次免疫后测定血清效价,并用Western确认免疫效果。
3、高丰度蛋白多克隆抗体的制备
免疫效果验证的大耳白兔,经心脏穿刺放血处死,动物血静置2小时,2000r/min离心,获得动物血清,此即多克隆抗体。
4、Western蛋白印记鉴定多克隆抗体
(1)将超滤浓缩后腮腺液分别与2×还原型及非还原型电泳加样缓冲液混合,100℃煮沸10分钟,制备还原型及非还原型样本
(2)进行常规恒流电泳,电泳后,电转于硝酸纤维素膜上,电压18V,时间30分钟 电转后,将硝酸纤维素膜置于5%脱脂奶粉进行封闭1小时以上,免疫后兔血清(多抗)1∶1000稀释作一抗进行孵育过夜,正常兔血清1∶1000稀释作阴性对照,TBST作空白对照
(3)次日,TBST洗膜4次,15min /次,辣根过氧化物酶标记羊抗兔及辣根过氧化物酶标记羊抗兔(IgG)1∶10000稀释作二抗孵育1小时,TBST洗膜3次,TBS洗膜1次,15min /次,曝光1~2min,显影。
3、扩大培养
将BL-pET-FAT/CD36菌液接种到4 mL LA液体培养基中,37 ℃,200 rpm振摇培养过夜。
取500 μL培养过夜的菌液接种到含500 mL LA液体培养液的三角培养瓶中,共6瓶,37 ℃,200 rpm振摇培养至OD600至0.6~0.8时,加入1 M的IPTG,使IPTG终浓度为0.5 mM,诱导6 h
4、蛋白纯化
(1)融合蛋白的变性裂解上清液的制备
由于表达产物为包涵体的非可溶性蛋白,因此需进行蛋白质的变性,操作步骤如下:
①4 ℃,10000 rpm离心10 min收集菌体。
②称量细菌湿重,按每克细菌湿重用5 mL 8 M尿素的1×结合缓冲液,重新悬浮细菌。 ③将悬浮液在室温条件下置摇床上温和摇动1 h。 ④12000 rpm室温离心20 min。 ⑤上清液即为蛋白质的变性液,弃沉淀。 ⑥纯化之前用0.45 μm滤膜过滤上清。
(2)层析柱的制备
当树脂沉降、保存液的液面降至树脂表面时,按以下顺序清洗、离子化和平衡色谱柱: ①3倍体积灭菌去离子水; ②5倍体积1×离子化缓冲液; ③3倍体积8 M尿素的1×结合缓冲液。
(3)柱层析 ①待8 M尿素的1×结合缓冲液下降至层析柱表面,小心加入制备好的融合蛋白变性裂解上清液。 ②用10倍体积8 M尿素的1×结合缓冲液过柱。 ③用6倍体积8 M尿素的1×漂洗缓冲液过柱。 ④用6倍体积8 M尿素的1×洗脱缓冲液洗脱结合蛋白,按需要分段收集洗脱缓冲液。 ⑤用3倍体积8 M尿素的1×结合缓冲液过柱。 ⑥用1倍体积8 M尿素的1×结合缓冲液保存层析柱。 2.2.4.16 蛋白的透析
(1)将成卷的透析袋剪下适用的长度(一般为20-30 cm),在过量的10 mmol/L
NaHCO3中润湿透析袋,并煮沸几分钟。在5 mmol/L Na2EDTA煮沸几分钟。 (2)重复一次。
(3)用去离子水洗数次,于5 mmol/L Na2EDTA(或20%-50%的乙醇)中保存于
4 ℃以防分解纤维素的微生物生长。
(4)在透析袋的一端打两个死结。
(5)用移液管将欲透析的蛋白移入透析袋。 (6)在透析袋的另一端打两个死结,并将其依次放入10倍于蛋白质溶液以上体
积的蛋白质透析缓冲液Ⅰ-Ⅸ中,用磁力搅拌器缓慢的搅拌,以促进溶液的交换。在每种缓冲液中透析4 h以上,达到平衡后更换透析液。 (7)将纯化蛋白透析到去离子水中。
5、蛋白的浓缩
将透析袋放入20%聚乙二醇溶液中进行蛋白透析 将纯化蛋白浓缩至一定体积,取出透析袋 用蒸馏水冲洗4-5次后吸出浓缩的蛋白 再用蒸馏水冲洗透析袋内壁2次。
以稀释的牛血清白蛋白(BSA)为对照,将浓缩后的蛋白质进行SDS-PAGE电泳分析,用核酸蛋白测定仪测定浓度,置于-20 ℃保存。
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