酶活性测定方法

一、过氧化物酶（POD）活性的测定

POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。 测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。

△470 ×VT

POD活性=

0.01×t×Vs×W

式中：△470----反应时间内吸光度值的变化；

VT ----提取酶液的总体积（ml） t----反应的时间（min）

Vs ----测定时取用酶液体积（ml） W----样品鲜重（g）

二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定

多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。

酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心15min后上清液即为粗酶液。

PPO活性测定：反应试管中分别加入0.1 mL酶液+3.9 mL磷酸缓冲液+ 1 mL 1m mol／L的邻苯二酚。混匀后于 30℃保温 10 min，迅速加入 2 mL质量分数为20％的三氯乙酸终止反应，立即于525nm下测定其吸光度值，计算酶活。

PPO活性= OD×VT

0.01×t×0.5g×Vs

= OD×VT

0.005

OD——反应时间内吸光值的变化； VT ----提取酶液的总体积（ml） Vs ----测定时取用酶液体积（ml） T———反应时间(min)；

三、吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性的测定

参照张志良等(1990)人的方法并稍作改动。

标准曲线的制定，配制浓度0~ 250 μg/ml的IAA溶液，分别在530nm下测定吸光度，并绘制标准曲线。

酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心20min后上清液即为粗酶液。

IAAO活性测定：量取1ml 酶液+2ml 1mmol/L MnCl2 +1ml 1mmol/L 二氯酚+2ml 1mmol/L IAA+5mL PH=6.0的磷酸缓冲溶液，放入30℃的水浴中30min,对照为2ml 1mol/L的MnCl2+1ml 1mol/L 二氯酚+2ml 1mmol/L IAA+6ml PH=6.0 磷酸缓冲液。将上述溶液吸取2ml，与4ml反应液（0.5mol/L的FeCl31.0ml+35%的过氯酸30ml）混合置于黑暗处，30℃条件下保存30min，最后测定530nm下的吸光度，并计算酶活性。IAAO活性以每mg蛋白质在1h内分解破坏1μgIAA的酶量表示酶活性大小。

（C 1- C 2）×V T

吲哚乙酸氧化酶活性=

W×t×V 1 [μg/ （ g·h ） ]

式中： C 1 ——对照管在标准曲线上查得 IAA, μg ； C 2 ——测定管在标准曲线上查得 IAA, μg ；

V T ——酶液稀释后总体积， mL ；V 1 ——酶液反应时用体积， mL W ——样品重量， g ；t ——酶促时间， h

四、超氧物歧化酶（SOD）活性的测定

多酚氧化酶活性测定参照赵世杰等的方法，略加改动。

酶液制备：称取样品0.5g，加入5ml 0.05mol/L磷酸缓冲液（PH=7.8），冰浴研磨成浆，4℃条件下10000r/min离心10min后上清液即为酶液。

SOD活性测定：反应试管中分别加入1.5 mL磷酸缓冲液，0.3 mL130m mol／L的Met溶液，0.3 mL750μmol/LNBT溶液，0.3 mL100μmol/LEDTA-Na2溶液，0.3 mL20μmol/L核黄素，0.25mL蒸馏水，0.05 mL的酶液（对照加缓冲液，2支）。混匀后将1支对照管置于暗处，其他各管于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，温度低可适当延长）。反应结束后，以不照光的对照管作空白，分别测定其他各管560nm波长下的消光度值，已知SOD活性单位以抑制NBT光光化还原的50﹪为一个酶活性单位表示。

SOD总活性=[(Ack-AE)×V]／[Ack×1／2×W×a] SOD比活力=SOD总活性／蛋白质浓度

SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位／mg蛋白表示； Ack--照光对照管的消光度值； AE—样品管的消光度值； V—样液总体积（ml）； a—测定时样品用量（ml） W—样重(g)

蛋白质浓度单位为：mg蛋白／g样重

五、过氧化氢（CAT）活性的测定

0.15 mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液

反应液配制：取200mlPBS（0.15mol，PH=7.0），加入0.3092ml 30‰的H2O2（原液摇匀即可）

酶液制备：称取样品0.2g，加入5ml 0.15mol/L磷酸缓冲液（PH=7.0），冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心20min后上清液即为粗酶液。

样品测定：取3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（紫外）（测定40s）

酶活性计算：以每minOD值减少0.01为1个酶活性单位（μ） CAT=[△A240×Vt]／（0.01×t×W×Vs） （μ／g.min）

△A240—反应时间内吸光度的变化

W—样品鲜重（g） t—反应时间（min）

Vt—提取酶液总体积（ml，1.6ml） Vs—测定时取用酶液体积（ml，0.1ml）

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