酶活性测定方法

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一、过氧化物酶(POD)活性的测定

POD测定参照李合生等(2003)的愈创木酚法方法进行测定,略加改动。 测定:称取样品0.5g,加入5mL 1/15mol/L PH=7.0的磷酸缓冲溶液,冰浴研磨成匀浆,4℃条件下12000r/min离心15min,上清液为粗酶液。然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml,愈创木酚(0.2%)0.5ml,浓度为0.15%的H2O2 0.5ml,取0.3ml的酶提取液加入到试管中,空白以缓冲液代替。在470nm下测定其吸光度,加入酶液时开始计时,每隔30s读数一次,连续记录5分钟。以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。

△470 ×VT

POD活性=

0.01×t×Vs×W

式中:△470----反应时间内吸光度值的变化;

VT ----提取酶液的总体积(ml) t----反应的时间(min)

Vs ----测定时取用酶液体积(ml) W----样品鲜重(g)

二、多酚氧化酶(PPO)活性的测定

多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法,略加改动。

酶液制备:称取样品0.5g,加入5mL 0.1mol/L PH=6.0的磷酸缓冲溶液,冰浴研磨成浆,4℃条件下12000r/min离心15min后上清液即为粗酶液。

PPO活性测定:反应试管中分别加入0.1 mL酶液+3.9 mL磷酸缓冲液+ 1 mL 1m mol/L的邻苯二酚。混匀后于 30℃保温 10 min,迅速加入 2 mL质量分数为20%的三氯乙酸终止反应,立即于525nm下测定其吸光度值,计算酶活。

PPO活性= OD×VT

0.01×t×0.5g×Vs

= OD×VT

0.005

OD——反应时间内吸光值的变化; VT ----提取酶液的总体积(ml) Vs ----测定时取用酶液体积(ml) T———反应时间(min);

三、吲哚乙酸氧化酶(IAAO)活性的测定

参照张志良等(1990)人的方法并稍作改动。

标准曲线的制定,配制浓度0~ 250 μg/ml的IAA溶液,分别在530nm下测定吸光度,并绘制标准曲线。

酶液制备:称取样品0.5g,加入5mL 0.1mol/L PH=6.0的磷酸缓冲溶液,冰浴研磨成浆,4℃条件下12000r/min离心20min后上清液即为粗酶液。

IAAO活性测定:量取1ml 酶液+2ml 1mmol/L MnCl2 +1ml 1mmol/L 二氯酚+2ml 1mmol/L IAA+5mL PH=6.0的磷酸缓冲溶液,放入30℃的水浴中30min,对照为2ml 1mol/L的MnCl2+1ml 1mol/L 二氯酚+2ml 1mmol/L IAA+6ml PH=6.0 磷酸缓冲液。将上述溶液吸取2ml,与4ml反应液(0.5mol/L的FeCl31.0ml+35%的过氯酸30ml)混合置于黑暗处,30℃条件下保存30min,最后测定530nm下的吸光度,并计算酶活性。IAAO活性以每mg蛋白质在1h内分解破坏1μgIAA的酶量表示酶活性大小。

(C 1- C 2)×V T

吲哚乙酸氧化酶活性=

W×t×V 1 [μg/ ( g·h ) ]

式中: C 1 ——对照管在标准曲线上查得 IAA, μg ; C 2 ——测定管在标准曲线上查得 IAA, μg ;

V T ——酶液稀释后总体积, mL ;V 1 ——酶液反应时用体积, mL W ——样品重量, g ;t ——酶促时间, h

四、超氧物歧化酶(SOD)活性的测定

多酚氧化酶活性测定参照赵世杰等的方法,略加改动。

酶液制备:称取样品0.5g,加入5ml 0.05mol/L磷酸缓冲液(PH=7.8),冰浴研磨成浆,4℃条件下10000r/min离心10min后上清液即为酶液。

SOD活性测定:反应试管中分别加入1.5 mL磷酸缓冲液,0.3 mL130m mol/L的Met溶液,0.3 mL750μmol/LNBT溶液,0.3 mL100μmol/LEDTA-Na2溶液,0.3 mL20μmol/L核黄素,0.25mL蒸馏水,0.05 mL的酶液(对照加缓冲液,2支)。混匀后将1支对照管置于暗处,其他各管于4000lx日光灯下反应20min(要求各管受光情况一致,温度高时间缩短,温度低可适当延长)。反应结束后,以不照光的对照管作空白,分别测定其他各管560nm波长下的消光度值,已知SOD活性单位以抑制NBT光光化还原的50﹪为一个酶活性单位表示。

SOD总活性=[(Ack-AE)×V]/[Ack×1/2×W×a] SOD比活力=SOD总活性/蛋白质浓度

SOD总活性以每克鲜重酶单位表示;比活力单位以酶单位/mg蛋白表示; Ack--照光对照管的消光度值; AE—样品管的消光度值; V—样液总体积(ml); a—测定时样品用量(ml) W—样重(g)

蛋白质浓度单位为:mg蛋白/g样重

五、过氧化氢(CAT)活性的测定

0.15 mol/L PH=7.0的磷酸缓冲溶液

反应液配制:取200mlPBS(0.15mol,PH=7.0),加入0.3092ml 30‰的H2O2(原液摇匀即可)

酶液制备:称取样品0.2g,加入5ml 0.15mol/L磷酸缓冲液(PH=7.0),冰浴研磨成浆,4℃条件下12000r/min离心20min后上清液即为粗酶液。

样品测定:取3ml反应液加入0.1ml(可视情况调整)酶液,以PBS为对照调零,测定OD240(紫外)(测定40s)

酶活性计算:以每minOD值减少0.01为1个酶活性单位(μ) CAT=[△A240×Vt]/(0.01×t×W×Vs) (μ/g.min)

△A240—反应时间内吸光度的变化

W—样品鲜重(g) t—反应时间(min)

Vt—提取酶液总体积(ml,1.6ml) Vs—测定时取用酶液体积(ml,0.1ml)

本文来源:https://www.bwwdw.com/article/9gt3.html

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