南师大蛋清中提取溶菌酶实验 - 图文

蛋清中提取溶菌酶

南京师范大学生命科学学院 姓名：穆旭 学号：09130333 摘要：本实验通过离子交换层析提取蛋清中的溶菌酶，掌握静态和动态离子交换的方法；

和从生物材料中提取活性蛋白质方法，并用超滤法分离溶菌酶和盐析浓缩溶菌酶，掌握超滤分离技术的原理和操作。并且用SDS-PAGE检测溶菌酶的纯度和含量，从而掌握SDS－PAGE的原理和操作。

关键词：溶菌酶，柱层析，离子交换树脂，超滤，盐析，SDS-PAGE

研究材料与实验方法 1.柱层析前的准备工作 实验材料：

树脂：724型阳离子交换树脂、层析柱：φ1.6cm×30cm、溶液：0.1M NaOH，0.1M HCl、其他材料：布氏漏斗，抽滤瓶，铁架台，恒流泵，核酸蛋白检测仪等。 1.1预处理724型阳离子交换树脂

碱－酸－碱的方法（Na型），每次用0.1N NaOH或者0.1N HCl溶液（体积约为树脂的2—3倍）浸泡树脂10—15min后，都要用蒸馏水将碱液、酸液冲洗掉。 1.2装填离子交换层析柱（重力沉降法）

固定层析柱，保持层析柱垂直；将蒸馏水倒入层析柱中，以排出管道中的空气，当蒸馏水高度约为层析柱高的一半时，将层析柱下端的塑料管夹紧；用玻璃棒将树脂搅拌均匀，倒入层析柱内，松开下端的塑料管，树脂自然沉降，最后保持蒸馏水面高于树脂表面约2cm。

1.3配制0.1M磷酸钠缓冲液pH7.0 先配制 1M Na2HPO4 57.7mL，1M NaH2PO4 42.3mL将两者混合后稀释至1000mL，装于试剂瓶中。

1.4平衡离子交换树脂

0.1M磷酸钠缓冲液恒速缓慢流经树脂，直至流出液的pH值与缓冲液相同，平衡 结束。

2.柱层析法提取溶菌酶 实验材料：

起始缓冲液：0.1M 磷酸钠缓冲液（pH7.0）

洗脱液：50mM NaCl溶液200mL（溶剂：起始缓冲液）、500mM NaCl溶液150mL（溶剂：起始缓冲液） 再生溶液：0.5M NaOH溶液 仪器：磁力搅拌器等 其他材料：新鲜鸡蛋 2.1样品的预处理

取2个新鲜鸡蛋，在其一端敲一个小洞，收集蛋清，加入约其体积1.5倍的起始缓冲液，搅拌均匀，用4层纱布过滤除去不溶性物质，检查其pH值是否为7.0，否则用0.5M酸、碱调节。

2.2静态吸附和洗涤

①静态吸附溶菌酶：倾出层析柱中平衡好的树脂，倾去多余平衡缓冲液，将蛋清溶液倒入树脂中，在磁力搅拌器上轻轻搅拌，室温下搅拌吸附约45min，注意搅拌速度（勿起大量泡沫、勿打破树脂）。吸附结束，吸取 200μL上清于dorf管中、4度保存备用（标记“1”），倾倒上清。

②洗涤杂质：取与树脂体积相当的起始缓冲液搅拌洗涤树脂约5min，重复2次，每次洗涤后，吸取 200μL 洗涤液于 dorf管中、4度保存备用（标记“2”“3”），倾去洗涤液。 2.3动态洗脱

①用少量起始缓冲液将树脂调匀，重新装填层析柱，装填结束后，用起始缓冲液（用滴管沿层析柱内壁缓缓加入，勿冲击树脂面，高度约2cm即可）封闭树脂面，将层析系统组装好，核酸蛋白检测仪调基线（T档调“100”，A档调“0”），开始用 50mM NaCl洗脱液恒速洗脱杂质。（流速约2~3mL/min)。

②洗脱杂蛋白：洗脱开始，即计时，然后每隔2min，记录下吸光值和电导率值（使用LP层析系统的同学记录电导率值），当洗脱峰结束（流出液的吸光值从开始上升到下降，直至平稳），洗脱完成。在洗脱峰吸光值最大处收集少量洗脱液于 dorf管中，标记“4”）

③收集溶菌酶：更换 500mM NaCl洗脱液，同样记录，同样在吸光值最大处收集少量洗脱液于dorf管中，标记“5”），不同的是，此时是溶菌酶的洗脱峰，所以整个洗脱峰要收集于烧杯中，4度保存。 2.4再生树脂、洗涤管道、绘制层析图谱 用0.5M NaOH溶液（约1倍柱床体积）洗涤树脂，然后用蒸馏水将碱液冲洗干净，树脂回收于烧杯中，浸泡于蒸馏水中，保鲜膜蒙好，室温放置。 管道系统连接好，用约100mL 70%乙醇冲洗管道，冲洗层析柱。

以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制层析图谱，使用LP层析系统的同学，分别以吸光值和电导率为纵坐标。

3.超滤法分离溶菌酶和盐析浓缩溶菌酶 实验材料：

溶液：0.5M NaOH溶液

透析缓冲液：0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.0）

其他材料：透析袋（8000~10000Da），超滤膜（30kD），固体硫酸铵，研钵，捣杵等。

3.1超滤分离（四组同学的溶菌酶洗脱液合并超滤）

将溶菌酶洗脱液以合适的流速经过超滤膜（进口压力不超过2.0bar），收集透过液，回流液（吸取200μL于dorf管中，标记为“6”），当透过液与回流液体积比约为3:1时，超滤可结束。 3.2盐析

在透过液中加入研细的固体硫酸铵粉末（边搅拌边加入），硫酸铵的终浓度为35％（即100mL 溶液中 35g 硫酸铵），室温下静置约20~30min，4度、10000rpm、20min。

3.3透析除盐

取少量 0.1M 磷酸钠缓冲液（pH7.0）溶解沉淀，装入透析袋中，置于适量的0.1M 磷酸钠缓冲液室温下搅拌透析过夜，次日更换缓冲液继续透析24h。透析结束后，将透析袋内的溶菌酶样品装入离心管中，4度保存备用（标记“7”）。

4.SDS-PAGE检测溶菌酶的纯度和含量 实验材料：

制胶的试剂：30％胶贮存液：丙烯酰胺（Acr）：甲叉双丙烯酰胺（Bis)＝ 29：1

避光保存 神经毒 加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）剧毒 催化剂：10％过硫酸铵（AP ）新鲜配制 变性剂：10％SDS 室温保存

缓冲液：2×样品缓冲液： 100mmol/L Tris-HCl 4%SDS 0.2%溴酚蓝 20%甘油 200 mmol/Lβ-巯基乙醇 pH6.8

凝胶缓冲液：1.5M Tris-HCl pH 8.8，0.5M Tris-HCl pH6.8

10×电泳缓冲液：250mmol/L Tris-HCl 2.5 mmol/L 甘氨酸 1% SDS pH8.3 4度保存

染色液：考马氏亮蓝 R250 染色液 仪器：垂直电泳系统

4.1配制分离胶12％

各种溶液在洁净干燥的烧杯中混合均匀，勿使胶液产生大量气泡，迅速沿玻璃板边缘加入胶液，至短板约2/3高处，灌注胶液时避免混入气泡，迅速加入去离子水至短板顶端，覆盖住胶面，待凝胶聚合，倒去水层，并用滤纸将水分吸干。 4.2配制浓缩胶5％

迅速沿玻璃板边缘加入胶液至接近顶部，斜插入“梳子”，确保“梳齿”底端无气泡，和“梳子”水平。

4.3加入1×电泳缓冲液

加入约200mL 1×电泳缓冲液，使凝胶上、下端都浸泡在电泳缓冲液中，并且内槽缓冲液高于外槽；

确保加样孔内无无气泡，以保证电流畅通。 4.4制备样品

（1）将15μL样品与15μL 2×样品缓冲液在dorf管中混合均匀，100度煮沸

5min，8000rpm 离心 5min； （2）样品（从左至右）

①蛋白质 Marker（10μL，不加2×样品缓冲液，煮沸，离心） ②标记“1”（吸附后的上清液） ③标记“2”（洗涤后的上清液） ④标记“3”（50mM NaCl洗脱峰） ⑤标记“4”（500mM NaCl洗脱峰） ⑥标记“5”（超滤回流液）

⑦标记“6”（透析除盐后的溶菌酶样品）

⑧蛋白质 Marker（10μL，不加2×样品缓冲液，煮沸，离心）

加样：用移液枪缓慢地加入 30μL 样品于样品孔中，让样品沉于样品孔内，避免加入气泡。 4.5电泳

（1）恒压电泳 100V；

（2）当溴酚蓝迁移至凝胶底部约0.5cm处，停止电泳；

（3）小心剥离凝胶，将凝胶浸入考马斯亮蓝 R250染液中，浸泡过夜； （4）第二天回收染色液，用脱色液均匀脱去凝胶上的剩余染液。

注意事项：染色和脱色都应该均匀，所以如果条件允许，应在脱色摇床上进行。 4.6马氏亮蓝R250染色

原理：考马氏亮蓝R250通过范德华力与蛋白质结合，适用于蛋白质电泳微量蛋白质染色，当蛋白质浓度超过一定范围时，对其染色不符合Beer定律，不适合作定量分析。

灵敏度：每一条蛋白质条带最低质量为0.1μg。

实验结果与分析

1.柱层析前的准备工作

经碱－酸－碱的方法（Na型）预处理724型阳离子交换树脂后进行装柱，然后用配制的0.1M磷酸钠缓冲液平衡离子交换树脂，经1L磷酸钠缓冲液的平衡之后，树脂仍没有平衡完全，流出来的缓冲液的pH仍过碱。

讨论：可能由于在碱酸碱预处理过程中洗涤碱液不完全，造成树脂平衡缓慢。所以配制新的缓冲液继续进行平衡树脂操作，经约500ml缓冲液流过后。树脂平衡完全，可进行下步操作。

2.柱层析法提取溶菌酶

按照实验步骤进行溶菌酶的静态吸附和杂质洗涤后，按实验步骤进行动态洗脱操作。得到63组实验数据。以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制层析图谱。 如下：

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