重组胰岛素前体转化成人胰岛素和地特胰岛素的工艺研究 - 图文

重组胰岛素前体转化成人胰岛素和地特胰岛素的工艺研究

摘要

胰岛素前体的产量超过3.0 g/L,利用CM-Sepharose FF离子交换层析建立了简单有效的胰岛素前体的初步纯化工艺,胰岛素前体从富含色素的发酵上清中得到较好的浓缩和提纯,纯度达到88%,目的蛋白回收率达到95%,这为后续胰岛素前体的结构分析及酶切、偶联、酰化等工艺的建立和优化奠定了基础。

其次,发现了毕赤酵母表达的胰岛素前体N末端的不均一性现象并分析了原因。本文通过质谱和N末端测序证实,利用重组毕赤酵母发酵得到的胰岛素前体是一种N末端不均一的单链融合蛋白。实际上,在构建重组菌株时,为增加胰岛素前体的表达量,在目的蛋白的N末端引入了一段人工合成间隔肽序列(EEAEAEAEPK)。间隔肽的存在成功实现了目的蛋白的高表达,但由于毕赤酵母自身产生的二肽氨肽酶A的酶活性不足和(或)专一性差,造成了胰岛素前体蛋白的N末端不均一性。同时实验也间接证实胰岛素前体在发酵过程没有发生C末端降解现象。

然后,证实了胰岛素前体单链蛋白上的三个酶切位点在酶切时存在先后顺序。酶切过程不同酶切时间样品采用HPLC和LC-MS的分析方法,发现胰蛋白酶首先将胰岛素前体的间隔肽片断迅速去除,生成单链胰岛素前体。随后,单链胰岛素在连接肽AAK的后面被进一步酶切,生成双链胰岛素前体。最后,该双链产物再经一次酶切去除连接肽,生成了B链缺少第30位苏氨酸的缺苏胰岛素产物(desB30)。这三步的酶切速率差别很大,第一步酶切速率很快,第二步相对较慢,第三步则不能完全反应,即使过夜酶切还有近20%的双链胰岛素前体无法转变为desB30。根据胰岛素的立体结构特点和容易生成聚体的特点,对造成这种酶切顺序和酶切速率差异的原因进行了分析。通过圆二色谱实验证实,在含有低浓度有机溶剂的溶液环境中,明显降低了胰岛素前体聚体的含量,同时在此坏境下进行胰岛素前体酶切，desB30的收率由76.8%提高到95.6%,间接证实胰岛素前体形成的聚体空间结构是造成desB30收率不能进一步提高的原因。

目录

第1 章文献综述

1.1 糖尿病 1.2 胰岛素

1.2.1胰岛素的结构

1.2.2胰岛素的理化性质 1.2.3胰岛素的生物合成 1.2.4胰岛素的生理作用 1.2.5胰岛素的发展历史 1.3 重组人胰岛素制备工艺

1.3.1人胰岛素原在大肠杆菌中的表达 1.3.2人胰岛素原在酿酒酵母中的表达 1.3.3人胰岛素原在毕赤酵母中的表达 1.4 重组人胰岛素的生产

1.4.1国际知名胰岛素生产企业 1.4.2国内主要胰岛素生产企业 1.5 重组人胰岛素类似物 1.5.1速效人胰岛素类似物 1.5.2长效人胰岛素类似物 1.6 地特胰岛素

1.7 课题背景、目的及研究内容 1.7.1课题背景 1.7.2课题目的 1.7.3研究内容

第2章胰岛素前体的大规模发酵与初步纯化 2.1 前言

2.2 实验材料和方法

2.2.1工程菌株 2.2.2培养基 2.2.3种子培养 2.2.4 16 L发酵罐培养 2.2.5 300 L发酵罐培养 2.2.6胰岛素前体的初步纯化 2.2.7分析方法 2.3 结果与讨论

2.3.1胰岛素前体16 L反应器培养 2.3.2胰岛素前体300 L发酵罐培养 2.3.3胰岛素前体的初步纯化 2.4 本章小结

第3章胰岛素前体的N末端不均一性分析 3.1 前言

3.2 实验材料和方法

3.2.1胰岛素前体的反相制备 3.2.2胰岛素前体的结构分析 3.3 实验结果

3.3.1 胰岛素前体的反相制备层析

3.3.2毕赤酵母表达的胰岛素前体分子量测定 3.3.3毕赤酵母表达的胰岛素前体N末端测序 3.4 讨论 3.5 本章小结

第4章胰岛素前体酶切顺序分析及酶切

4.1 前言

4.2 实验材料和方法 4.2.1 主要试剂

4.2.2胰岛素前体的酶切

4.2.3双链胰岛素前体的反相制备及处理 4.2.4胰岛素前体酶切转化率检测 4.2.5胰岛素前体酶切样品LC-MS检测

4.2.6胰岛素前体和双链胰岛素的圆二色谱检测 4.3 结果与分析

4.3.1胰岛素前体的酶切顺序

4.3.2影响胰岛素前体切除连接肽的原因分析及对策 4.4 本章小结

第5章胰岛素前体的转肽

5.1 前言

5.2 实验材料和方法 5.2.1 片要试剂

5.2.2胰岛素前体的-步法转肽 5.2.3胰岛素前体的两步法转肽

5.2.4转肽产物的纯化、去保护及鉴定

5.2.5 IP和desB30的转化率及胰岛素纯度检测 5.3 结果与分析

5.3.1胰岛素前体的一步法转肽 5.3.2胰岛素前体的两步法转肽

5.3.3两步法制备的重组人胰岛素质量分析 5.3.4胰岛素前体一步法与两步法转肽的工艺比较 5.4 本章小结 第6章地特胰岛素的酰化及产物分析

6.1 前言

6.1.1缺苏胰岛素的保护性酰化 6.1.2缺苏胰岛素的选择性酰化 6.1.3肉豆蔻酸活化酯的制备 6.1.4本章研究目的 6.2 实验材料和方法 6.2.1主要试剂

6.2.2N-羟基琥珀酰亚胺肉豆酸酯的制备 6.2.3酰化反应

6.2.4酰化反应条件优化及放大 6.2.5 分析方法 6.3 结果与分析 6.3.1 活化酯的制备

6.3.2酰化反应产物的结构分析 6.3.3选择性酰化条件的优化和放大 6.3.4酰化目的产物的结构与活性确证 6.4 本章小结

第7章主要结论、创新点及展望

7.1 主要结论 7.2 创新点 7.3 展望

参考文献

第1章文献综述

1.1糖尿病 1.2胰岛素

有关糖尿病描述已有2000多年的历史,虽然它有很容易识别的典型症状,但直到19世纪20年代初,它依然是一种致命的疾病。1921年加拿大的外科医生Banting和他的助手Best结扎了狗的胰管并从变得萎缩的胰脏中得到了有活性的提取液,并证明这种提取液有明显的降血糖作用,后将纯化的提取物命名为胰岛素。1922年经过初步纯化的动物胰岛素便应用于糖尿病人,并取得了惊人的效果。1923年Banting因发现胰岛素获得医学和生理学诺贝尔奖。2006年联合国通过决议将Banting的生日11月14日定为一年一度的“联合国糖尿病日”。胰岛素的发现是上世纪生物医药领域最为重大的科技成就之一,引起了众多科学家的浓厚兴趣。以胰岛素的提取生产为起点,开始了对胰岛素的结构与功能、化学与生物合成等一系列的研究,収得许多突破性的成果[7]。以胰岛素的生物合成为标志,开创了生物制药的新纪元。 1.2.1胰岛素的结构

1.2.2胰岛素的理化性质

人胰岛素是由51个氨基酸组成的酸性小分子蛋白质,分子式C257H383N65O77S6,分子量5807.69,等电点pI 5.35-5.45。利用结晶沉淀方法得到的胰岛素原料为白色或类白色的粉末,在中性环境中几乎不溶于水,易溶于稀酸、稀碱。强酸和强碱均使其破坏,在pH4.5-7.0时溶解度很差。胰岛素的性质有以下几个特点：

(1)不溶于浓度超过90%以上的乙醇及其他有机溶剂,可溶于浓度80%以下的稀醇、酸、碱中。在弱酸性溶液中较稳定,pH2~4最稳定,且长时间放置容易发生脱氨。在酸性水溶液可用饱和氯化钠或硫酸钠等盐析。在碱性介质中易破坏,加热易变性,在PH8时加热10 min或在0.25%硫酸中煮沸60 min活性丧失一半。

(2)在甲酸、0.1mol/L氧氧化钠、维生素C和重金属离子作用下,胰岛素分子中的二硫键会被还原或肽键被水解,造成胰岛素的活性破坏。

(3)胰岛素在pH4.5~6.5等电点范围内溶解度很低,室温下约10ug/ml。在一般的稀酸或稀碱溶液中,溶解度大大提高。温度升高时,在水溶液中的浓度可达50--100 g/L。

(4)胰岛素在水溶液中多数以聚体的形式存在,可以形成二聚体和六聚体,甚至以多聚体的形式存在,这与其浓度、溶液的pH值和所含的离子及盐浓度等因素有关。在血液中胰岛素的浓度为10-8—10-11mol/L,是以单体形式存在并发挥生理功能的。胰岛素在极端pH或极稀的溶液条件下也以单体形式存在。在弱酸性条件下,胰岛素分子中的二硫键稳定,但易发生脱酰胺并形成共价的二聚体。若有二价锌离子和苯酚存在,二聚体可进一步形成六聚体或多聚体。

1.2.3胰岛素的生物合成

动物胰腺内的胰岛β细胞在内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖等的刺激下会分泌表达胰岛素。人前胰岛素原基因由1789个碱基对组成,包括三个外显子和两个内含子。该基因经转录和翻译后合成的是由105个氨基酸残基组成的前胰岛素原(Preproinsulin),在其N末端有20个残基左右的信号肽。前胰岛素原通过内质网膜时,被信号肽酶切去信号肽生成胰岛素原(Proinsulin),同时胰岛素原分子内形成三个二硫键,然后在高尔基体内继续加工[16]。人胰岛素原分子量约为9000,通过C肽将胰岛素的B链和A链连接起来,是一条含有86个氨基酸的单链多肽(图1.3)。C肽的N末端和C末端分别通过两个碱性氨基酸残基与B链的C末端和A链的N末端相连。不同种属动物的C肽差异较大,如人的C肽为31肽,牛的C肽为26肽,猪的C肽为29肽。尽管胰岛素原的活性仅为胰岛素活性的5~10%,但它的降糖作用较胰岛素持久,这与胰岛素原具有较长的半衰期有关。在高尔基体内的胰岛素原经过进一步的折叠和包装,进入分泌颗粒中储存起來,并在蛋白酶的作用下生成胰岛素和C肽。在两种Ca2+依赖的内肽酶和羧肽酶参与胰岛素原生成胰岛素和C肽,这个过程包括两条途径。第一条途径是在内肽酶I的作用下,胰岛素原32位和33位之间的肽键断裂形成双链(图1.3中的Site 1),随后在羧肽酶的作用下32位和31位的两个精氨酸残基被依次切除。生成的双链胰岛素原前体在内肽酶II的作用下,酶切65和66位间的肽键(图1.3中的Site2),将C肽从胰岛素原上分离下來,再由羧肽酶H去除原65位精氨酸和64位的赖氨酸残基,最终得到成熟的C肽和胰岛素。第二条途径同第一条途径顺序正好相反,先由内肽酶II先在Site2酶切,再由内肽酶I在Site 1酶切,最后由羧肽酶H去除末端的两个碱性氨基酸,得到成熟的胰岛素和C肽[15]。当体内缺乏胰岛素时,胰岛素和C肽以等摩尔的比例释放到血液中。 1.2.4胰岛素的生理作用

胰岛素是动物体内促进合成代谢、调控血糖保持稳定的主要激素。它能促进全身组织摄取和利用葡萄糖,并抑制糖原分解和糖原异生,对代谢作用的总趋向是促进营养物质以不同形式保存起来,因此胰岛素有降低血糖的作用。胰岛素分泌不足或胰岛素受体对胰岛素的敏感性下降会导致血糖升高,若超过肾脏的代谢能力,则血糖会从尿中排出,引起糖尿病。如果血液中长期含有过量的葡萄搪,易导致高血压、冠心病和视网膜血管病等病变。但是如果胰岛素分泌过多,则会引起血糖的迅速下降,导致惊厥、昏迷,甚至休克现象的发生。

胰岛素的主要生理作用是降低血糖浓度,但它并不是与血糖直接作用,而是与分布在肝脏、肌肉、脂肪等组织细胞膜上的胰岛素受体结合后,达到降低血糖浓度的目的。胰岛素受体是一种对胰岛素非常敏感的蛋白,识别性极强。胰岛素与细胞表面的受体结合后,会引起细胞内的一系列反应,胰岛素产生降血糖作用是多方面协同的结果(图1.4)[17]。 在糖的代谢调节方而,胰岛素通过共价修饰作用来增强磷酸二酯酶活性、从而使糖原合成酶活性增加來加速糖原合成,抑制糖原分解,使葡萄糖存于肝脏和肌肉中。

在脂肪代谢调节方面,在胰岛素的作用下,促进肝合成脂肪酸后转运到脂肪细胞贮存,同时促进脂肪细胞合成少量的脂肪酸。胰岛素还促进葡萄糖进入脂肪细胞,形成甘油三酯，存于脂肪细胞中。

在蛋白质代谢方面,胰岛素能促进蛋白质合成。具体来说,胰岛素能促进氨基酸向细胞内的转运,加速DNA的复制和转录过程。另外胰岛素还作用于核糖体,加快蛋白质的翻译。

血糖平衡调节是生命活动调节的一部分,是保持内环境稳态的重要条件。人体内有一套严格的调节血糖浓度的机制。这套机制以激素调节为主,以祌经调节为辅,通过两者的共同作用来保持体内血糖的稳定。当人体的血糖调节失

衡后会引起糖尿病,严重危害人体的健康。血糖平衡激素调节如图1.5所示,当血液中的血糖浓度升高时,会刺激胰岛细胞迅速释放胰岛素,将血糖浓度降至正常水平;当血糖浓度低于正常值时,则会引起胰高血糖素或肾上腺素的释放,使血糖浓度恢复到正常水平。正是由于这两类激素的精确调控,使得人体的血糖浓度总能保持在正常范围内。

1.2.5 胰岛素的发展历史

(1)动物胰岛素。动物胰岛素为从猪或牛胰腺中提取得到的胰岛素,在中国药典中统称为“胰岛素”。由于早期提取工

艺简单,分析检测手段落后,动物提取的胰岛素中含有部分的胰高糖素、胰多肽、胰岛素聚合体、胰岛素原等杂质,在临床应用中常出现致敏性的抗原反应。随着蛋白质分离纯化技术和检测方法的发展,20世纪70年代人们逐步分离出单组分动物胰岛素,减少了杂质引起的免疫反应。虽然动物胰岛素与人胰岛素的一级结构非常相近,但对人来说仍是一种异源蛋白,具有一定的免疫原性,长期使用容易出现过敏反应和注射部位脂肪萎缩等副作用,因此目前在发达国家从猪和牛的胰腺中提取的胰岛素已较少用于临床。国内养猪业发达,从猪的胰腺中提取的胰岛素价格便宜且纳入医保,猪胰岛素在一些基层医院还很常见。从国家食品药品监督管理局数据库查询,截至2011年底国内还有30多家企业具有生产提取胰岛素的资质,主是生产厂家为江苏万邦生化医药股份有限公司和上海第一生化药业有限公司。由于动物胰岛素存在的免疫原性、原料供应的限制和动物来源产品的安全性问题,提取胰岛素的市场规模己越来越小,被重组人胰岛素替代已是大势所趋。

(2)有机合成胰岛素。1955年英国生物化学家桑格确定了牛胰岛素的结构,为胰岛素的实验室合成奠定了基础[8]。1965年我国钮经义等科学家经过6年多坚持持不懈的努力,获得了与天然牛胰岛素在结构、生物活性、理化性质、结晶形状完全一致的人工合成结晶牛胰岛素,实现了世界上首次人工合成蛋白质的壮举,这也是我国在生命科学领域里做出的为数不多的世界一流研究成果[9]。

经过几十年的发展,多肽及小分子蛋白质的有机合成业已发展为一项成熟技术,大规模地应用于多肽药物合成,如注射用胸腺五肽、奥曲肽等小分子多肽药物的原料药已全部由人工合成。有机合成的纯度比从动物组织提取的要高得多,成本已降低到每克1万元人民币以下。虽然人胰岛素仅有51种氨基酸,但由于胰岛素是含有三对二硫键的双链多肽,分别合成两条链后进行的二硫键正确配对效率较低,所以这种全合成方法从技术上虽说是可以走通,但合成和纯化的成本很高,一直未能进行工业化生产。

(3)半合成人胰岛素。由于长期使用猪胰岛素会带来一系列的免疫反应,上世纪70年代初,人们尝试通过转肽的方法生产人胰岛素。生产过程中利用胰蛋白酶先将猪胰岛素的B30丙氨酸切除,然后再将苏氨酸酯从B29赖氨酸的羧基端通过转肽反应接上去,生成人胰岛素酯,然后再去保护得到人胰岛素，由于当时从猪胰脏中提取胰岛素的方法己形成相当大的生产规模,且原料成本相对低廉,所以在利用微生物发酵生产人胰岛素产业化之前,这种半合成生产人胰岛素的方法还是被一些大企业所采用,成为当时的主流生产工艺之一。1983年德国赫司特公司半合成人胰岛素的研发成功,以商品名H-Insulind在德国顺利上市。与动物胰岛素相比,半合成人胰岛素的主要优点是结构与人胰岛素完全一样,免疫原性显著下降,生物活性提高,吸收速率增快,整体疗效比动物胰岛素好。但半合成胰岛素的原料仍来源于动物提取胰岛素,受原料來源和转肽及分离纯化成本的限制,半合成人胰岛素很快就被基因重组技术生产的人胰岛素所取代。

(4)重组人胰岛素。正常情况下,一头猪的胰脏提供的经过充分纯化的胰岛素仅够一名糖尿病患者使用3天。动物来源的胰岛素因自身免疫、潜在风险及产量的原因,已无法满足临床用药的需求[22]。重组DNA技术的出现为人胰岛素的生产提供了一条全新的方法,胰岛素再也不会受屠宰厂提供动物脏器的原料限制而影响产量。随着重组DNA技术的发展及成熟,胰岛素的工业化生产过程已经历了翻天覆地的变化[5]。

1978年,胰岛素的A链和B链分别在E. coli表达成功,并在体外成功进行了二硫键的配对,使胰岛素成为最早在微生物中被表达的哺乳动物蛋白质[23]。1986年,美国礼來公司利用E.coli直接表达完整的单链胰岛素原,发酵得到没有活性的胰岛素原包涵体,经复性、酶切和纯化后得到人胰岛素。该工艺大大降低了重组人胰岛素的生产成本,使得工业化生产重组人胰岛素成为可能,目前仍是主要生产工艺之一[24],同年,丹麦的诺和诺德公司利用重组酿酒酵母表达小C肽的胰岛素原获得成功,成为另一套可以商业化运作的生产工艺,至今仍在使用。 1.3重组人胰岛素制备工艺

近二十年來,基于对胰岛素分子结构及其功能的更加深入的了解,人们对胰岛素基因密码子偏好性的筛选、表达体系的选择和改进、表达产物的加工处理等方面进行了长期系统的探索和研究,不仅实现了人胰岛素在微生物中的生物合成并推向市场,而且胰岛素原及其类似物基因在许多系统如真菌[25]、哺乳动物细胞[26]、转基因植物[27]中都得到了表达,但目前用于工业化生产的还是大肠杆菌表达系统和酵母表达系统[28]。重组人胰岛素的成功开发与上市,满足了广大糖尿病患者的临床需要,极大地推动和加快了整个生物医药的发展。在此之后几年中,多种蛋白质如干扰素、生长激素、重组人促红素等蛋白药物在不同的宿主细胞成功陆续得到表达。以重组人胰岛素的工业化生产为标志,开启了生物制药的新时代。

1.3.1人胰岛素原在大肠杆菌中的表达

大肠杆菌作为研究最早和最为透彻的模式微生物,由于其分子遗传学背景清楚,自基因重组技术发明以来,很快就被用于分子结构清楚的重组人胰岛素的生产。作为原核表达系统最重要的表达宿主,随着基因工程技术的一步步完善,人们已构建出多种大肠杆菌基因克隆和表达载体,表达策略亦多种多样。利用大肠杆菌生产重组人胰岛素主要以下有两种方法。

第一种方法较早采用,利用大肠杆菌分别表达胰岛素A链和B链,然后体外生成人胰岛素。即首先合成人胰岛素的A链和B链基因编码的DNA片段,分别在其5’端加上甲硫氨酸密码子。将目的基因插入到色氨酸合成酶基因的后面构建表达载体,转化感受态大肠杆菌。经过重组菌株筛选和发酵,分别从发酵液中提取分离出含有胰岛素A链和B链的融合蛋白,然后用溴化氰将融合蛋白在甲硫氨酸处裂解,得到胰岛素的A链和B链,再转化生成稳定的S-磺酸盐。在过量的A链存在下,提纯后的以S-磺酸盐形式存在的胰岛素A链和B链经过化学氧化反应,在B链和A链之间形成两对分子间的二硫键,同时A链内也形成一对分子内二硫键,最终生成人胰岛素[23,29]。由于胰岛素肽链上共有3对硫基,二硫键的正确配对率非常低,通常只有10-20%,所以该生产方法已不常用。

第二种方法是利用大肠杆菌直接表达完整的人胰岛素原。由于人胰岛素原蛋白分子量较小,容易被大肠杆菌的胞内酶降解,且小分子蛋白在大肠杆菌中的直接表达产量不高,所以人胰岛素原在大肠杆菌中表达时一般采用融合蛋白的形式,生成没有活性的包涵体贮存在菌体中。虽然在体外由A链和B链重组生成胰岛素的研究表明,通过还原-重氧化形成正确二硫键配对的效率远高于理论计算,但远不能与链内胰岛素原折叠中的二硫键正确配对的效率相比,因此直接表达胰岛素原生产胰岛素的方法比分别表达A链和B链然后正确配对的效率高得多具体的工艺过程如下。

在人胰岛素原完整基因的5’端设计添加甲硫氨酸密码子,插入到色氨酸合成酶基因的后面构建表达载体,转化感受态大肠杆菌。发酵表达得到的色氨酸合成酶-人胰岛素原融合蛋白以无活性的包涵体形式沉淀于细胞浆中。破碎菌体从中分离得到融合蛋白包涵体,经溴化氰裂解后得到人胰岛素原,通过反应将其转变成S-磺酸盐,分离纯化相对稳定的S-磺酸型人胰岛素原。该人胰岛素原经变性和复性,折叠成天然构象的人胰岛素原,产率可达45%。二硫键错配产物和多聚体副产物回收后可重复利用。复性后具有天然构象的人胰岛素原分别经过胰蛋白酶和羧肽酶B处理后,得到去除C肽的人胰岛素[31、32]。1986年美国礼来公司采用这种工艺路线,进行了重组人胰岛素的商业化生产,至今仍在继续使用。

C肽是胰岛素A链和B链之间的连接肽,在研究胰岛素的结构和生物功能的关系中,开始一直认为C肽含有促使胰岛素原二硫键正确配对的结构信息,可以促进胰岛素分子形成正确的二硫键。后來发现不同物种胰岛素原C肽的差异很大,发生突变的几率约为A链和B链的8倍。上世纪90年代初,科学家进行了不同长度的C肽对复性率的实验,发现胰岛素的A链和B链已经包含了足够的使二硫键正确配对的结构信息,C肽可能仅起到柔性连接肽的作用,将胰岛素A链和B链之间的反应变为一条链内的反应,使复性率得到提高[33、34]。不可否认的是,C肽可能在胰岛素的生物合成、加工、跨膜转移以及分泌之前的过程中起重要作用[35]。另外,C肽约30个氨基酸残基长度及其两端的双碱性氨基酸有利于蛋白酶酶切,促进了胰岛素原向活性胰岛素的转化。随后在很多重组人胰岛素研究中,优化设计的小C肽胰岛素原类似物可以提高表达量和复性率的实验结果也得到证实[36]。为避免胰岛素原在胞内的降解,除了采用前面介绍的融合蛋白表达的方式外,人们还尝试了在大肠杆菌中串联2--3个人胰岛素原基因,中间用甲硫氨酸分隔开來的方式来提高表达量,也取得了理想的效果[37]。 1.3.2人胰岛素原在酿酒酵母中的表达

大肠杆菌是原核生物,多数情况下表达的外源蛋白是没有生物活性的,且不会对表达的外源蛋白进行糖基化、甲基化等后期的修饰加工,所以大肠杆菌蛋白表达系统的应用受到一定的限制,特别是对有糖基化修饰有要求的蛋白来说更是如此。对于人胰岛素蛋白来说,虽然没有糖基化等后期修饰加工问题,但是其含有的三对二硫键还是给蛋白的复性带来了不少问题,最髙约45%的复性率成为胰岛素产率提高的关键限制因素之一。另外,该工艺中的包涵体变性复性操作和双酶切加工,也给下游的分离纯化带來了很多困难和挑战。

为克服和解决这些问题,以酵母分泌系统为代表的真核表达系统应运而生,成为另一种生产重组人胰岛素的重要工艺。丹麦的诺和诺德公司(Novo Nordisk)是这一工艺的奠基者。依靠这一技术,诺和诺德公司已成为全球最大的重组人胰岛素及其类似物的提供商,也是业界公认的新型糖尿病药物研发的引领者。

酵母菌是一类低等单细胞真核生物,既具有类似原核生物生长迅速、易于遗传操作的特点,又具有一般真核生物的分子生物学和细胞生物学特性,能对表达的外源蛋白进行翻译后的加工和修饰,可以表达有生物活性的外源蛋白[28]。因酵母表达系统的诸多优点,近三十年来发展迅速,被认为是优秀的外源蛋白表达宿主。酿酒酵母（Saccharomyces serevisiae ）是与人类关系最广泛、发酵中最常用的微生物,也是第一个完成基因组测序的真核生物,发现有约6000个基因[38、39]。对酿酒酵母的基因背景有了充分的了解,使它成为基因工程和现代分子生物学中最早使用且目前仍在用的真核模式生物,在科学研究和商业生产上也成为首先应用于外源蛋白表达的真核生物,为基因工程药物和疫苗的产业化作出了巨大贡献[40、41]。酵母和其他真核生物中分泌表达系统的发现是分子生物学领域的一个重大进步,在信号肽的引导下外源蛋白依次从真核细胞的核糖体通过内质网腔和高尔基体,实现了外源蛋白的有效分泌和修饰加工[42、43]。

Kjeldson和Markussen实验小组分别发现,直接用酿酒酵母表达完整的重组人胰岛素原时不能有效分泌,但用短C肽AAK、LWK和EWK等代替C肽,并去除B30 (Thr)可以有效地利用酿酒酵母分泌表达胰岛素前体类似物[12、44]。

另外,Markussen等[45]还首次报道了将表达的胰岛素前体产物在胰蛋白酶和过量苏氨酸酯存在的情况下,利用酶切转肽的方法加工成人胰岛素酯,再利用三氟乙酸脱酯并纯化后最终得到重组人胰岛素。

Thim小组[46]设计双碱性氨基酸的小C肽单链胰岛素前体(B-Arg-Arg-A或B-Arg-Lys-A)基因插入CPOT质粒中,实现了人胰岛素前体在酵母中的分泌表达。表达的含有小C肽的单链胰岛素前体不缺少B链第30位的苏氨酸,且活性高于天然人胰岛素原。与Markussen等不同,因为不缺少B30苏氨酸,所以只需要使用胰蛋白酶和羧肽酶B对单链胰岛素前体进行两次酶切,纯化后就可获得人胰岛素。由于整个工艺不需要转肽反应,相对而言较为简单。但此工艺最大的不足就是胰蛋白酶酶切反应控制问题,B链第30位的苏氨酸不可避免的被部分切除,造成酶切收率的明显下降和副产物大量生成,不利于后期的纯化,因此未能成为酿酒酵母表达人胰岛素前体的主流生产工艺。 1.3.3人胰岛素原在毕赤酵母中的表达

虽然诺和诺德公司利用酿酒酵母生产重组人胰岛素获得巨大成功,但随后人们也逐渐发现酿酒酵母作为一种外源表达系统存在的一些不足。首先,酿酒酵母是一种以发酵为主的酵母,在常规的通气发酵条件下酿酒酵母所能达到的生长速率和密度较低,外源蛋白表达量不高。其次,整合到酿酒酵母中的外源蛋白基因不稳定,容场丢失。第三,如果表达的外源蛋白存在糖基化位点,则表达产物易被过度糖基化。外源蛋白在酿酒酵母翻译后进入内质网中,其糖基化的过程与哺乳动物细胞基本一致。但在进一步转移到高尔基体后,由于缺少α-甘露糖苷酶II和N-乙酰葡萄糖胺转移酶的作用,且α-1,6甘露糖苷转移酶和α-l,3甘露糖苷转移酶活性很高,因此最后修饰加工得到的外源蛋白的N糖基化是由50-200个甘露寡糖形成的高甘露糖型糖链结构[47,48]。由于正常动物细胞表达得到的糖蛋白N糖基化多是复合型的糖链结构,所以利用酿酒酵母表达得到的糖蛋白抗原性较强,多数情况下不能作为药物应用于临床。酿酒酵母的这些不足,促使人们寻找和建立除动物细胞以外新的真核表达系统。毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统就是在这种情况下被发现的一种可代替酿酒酵母的新型表达系统。

毕赤酵母表达系统目前已发展成为应用最为广泛的外源蛋白表达系统之一。该表达系统同时兼有原核表达系统和真核表达系统的优点,培养容易,生长快速,表达量高,能对外源真核基因进行正确翻译和翻译后的加工与修饰,可分泌表达多种外源蛋白,产物易于提纯[49、50]。另外,毕赤酵母具有分泌效率高,产物不会过度糖基化,蛋白抗原性低,重组质粒融合到菌体基因组中不易丢失外源基因等优点,近年来受到广大研究者的青睐[51]。

近年来,毕赤酵母表达体系有了更为广泛的应用,表达的蛋白质包括酶、膜蛋白、抗原和抗体、调节蛋白等多种类型。与其他体系比较,它在表达真核生物蛋白方面有很好的应用[50,52]。虽然国内研究起步较晚,但用毕赤酵母已经成功表达了乙肝表面抗原、降钙素、人血清白蛋白、水蛭素等数种蛋白质。随着人们对毕赤酵母认识的日益加深,它必将在分子生物学研究以及工业应用的各个领域发挥更大的作用。

在酿酒酵母中表达完整人胰岛素原时,最终因不能有效地分泌胰岛素原而失败。毕赤酵母亦是如此。利用毕赤酵母表达人胰岛素前体的菌种构建中,借鉴酿酒酵母的做法,在编码胰岛素前体的cDNA分子中去除B链第30位的苏氨酸,用短C肽RR、AAK和EWK等代替C肽或直接将B链第29位赖氨酸与A链第一位的甘氨酸相连,然后再与酿酒酵母的前导肽因子相连,可以有效提高单链胰岛素前体的表达量[53]。采用这种策略,在生物反应器培养毕赤酵母的上清中,胰岛素前体产量接近或达到4.0 g/L的水平[17、54]。 1.4重组人胰岛素的生产

随着糖尿病患病人数的不断增多以及胰岛素新型制剂的不断上市,胰岛素类产品的市场规模还将会继续扩大,因此胰岛素市场前景广阔,经济效益巨大[55]。虽然动物提取的胰岛素价格仅为重组人胰岛素的一半,但由于其自身免疫、原料和安全方面的不足,己逐渐退出我国的一二线城市。胰岛素的生产已有90多年的历史,但基因工程生产重组人胰岛素的工业化要求相当高。原因在于:

首先,胰岛素是含有三对二硫键的比较复杂的小分子双链多肽,生产过程步骤多,工艺复杂。现在上市的基因工程胰岛素主要有2种生产工艺,分别为礼来公司的大肠杆菌表达与诺和诺德公司的酵母表达。前者需要将表达的胰岛素原进行复性和双酶切,后者需要将表达的前体进行酶切和转肽反应,两者都需要后续的高效液相纯化,生产成本和复杂程度远高于干扰素等普通的基因工程产品。

其次,胰岛素的临床使用剂量较大,大约是干扰素临床使用剂量的300倍,每支剂量接近15 mg或更高,如地特胰岛素每支超过40 mg。事实上,由于长期的技术改进和价格竞争,胰岛素已经成为国际上最便宜、用量最大的基因工程药品。这使得该产品的工业化生产年产量要达到几百公斤到几吨的规模,成本非常低、工艺非常成熟才能实现盈利。通过改革工艺和降低成本来提高重组人胰岛素的市场竞争力一直是各大公司科研投入的热点。

随着中国糖尿病人群的不断增加,胰岛素的需求量也会呈直线上升趋势。中国将成为全球最大糖尿病治疗市场,跨国企业在这个领域中与本土企业的竞争将变得更加激烈。胰岛素市场作为一个高度专业化、技术壁垒高、相对垄断的市场,世界制药巨头多数都把开发胰岛素及其类似物作为战略发展方向之一。虽然重组人胰岛素取代动物胰岛素是一种趋势,但是重组人胰岛素生产工艺复杂,技术含量高,市场竞争激烈,投资规模巨大,国内较多的动物胰岛素厂商

和许多新的企业想要进入这个市场难度较大。这也是该产品被国际上三大制药巨头(丹麦的诺和诺德、美国的礼来和法国的赛诺菲-安万特)长期垄断,新企业难以形成竞争力的主要原因。 1.4.1国际知名胰岛素生产企业

丹麦的诺和诺德(Novo Nordish)是一家在糖尿病领域最知名的制药公司,世界胰岛素治疗重大发明的开拓者。迄今为止,世界上主要胰岛素制剂和先进的胰岛素给药系统绝大部分出自诺和诺德。诺和诺德是全球胰岛素行业的龙头,在80多年的时间里始终保持着全球糖尿病研究的领先地位,开发了在生物制药方面的众多产品,其中包括人胰岛素、速效胰岛素和长效胰岛素类似物、生长激素和胰高血糖素等。诺和诺德在糖尿病、蛋白药物及给药系统研究三方面的优势,构成了其研发的战略核心。诺和诺德公司的地特胰岛素(Levemir),属长效胰岛素,每日只需注射一次。2004年在欧盟上市,2005年在美国上市,2010年在我国上市。

美国的礼来(Eli Lilly and Company)是具有136年历史的世界领先制药公司,现己发展成为全球十大制药企业之一。礼来公司1923年首次大规模商业化生产胰岛素,1943年最早大规模生产人类历史上第一种抗生素-青霉素。开发更有效的糖尿病药物,提高糖尿病的治疗水平是礼来不懈努力的目标。礼來在中国建立研发中心,专注中国的糖尿病患者,开发可以延缓糖尿病进程的新型药物。赖脯胰岛素(Lispro)为人胰岛素B链第28位的脯氨酸与第29位的赖氨酸交换得到的速效胰岛素,由美國礼來公司于1996年首次在瑞士上市,2000年在中国上市。

法国的赛诺菲-安万特(Sanofi-Aventis)是世界上第三大制药企业,也是一家全球领先的多元化医药健康企业。赛诺菲-安万特致力于医药产品的研究、开发、生产以及销售,产品主要覆盖心血管疾病、血栓形成、肿瘤学、糖尿病、中枢祌经系统、内科疾病和疫苗七个领域。由赛诺菲-安万特公司研发的甘精胰岛素来得时(Lantus) 2000年6月在德国上市,2001年在美国上市,2004年在中国上市。

2008年诺和诺德占中国重组人胰岛素市场的83.4%,占中国胰岛素类似物市场的52.2%。美国礼来是第二位进入中国胰岛素市场的医药巨头,2008年占中国重组人胰岛素市场的12.3%,占中国胰岛素类似物市场的7.7%;法国赛诺菲-安万特是全球第一个生产甘精胰岛素类似物的企业,2008年占中国胰岛素类似物市场的36.1%。2010年1--9月三大制药巨头诺和诺德、礼來和赛诺菲安万特合占中国胰岛素市场90.6%的份额,而中国最大的本土企业通化东宝占比仅3.7% (图1.6)。另外,不断有新的大型制药企业陆续进入中国胰岛素市场,比如香港联邦制药、德国拜耳等,中国的胰岛素市场竞争日趋激烈[56,57]。

2008年11月,诺和诺德宣布投资3.81亿美元巨资,在天津新建一家全球最大的胰岛素制剂与灌装工厂。新工厂已在2012年全面投产,生产多种胰岛素和注射笔产品,该工厂也成为诺和诺德在亚太地区的首家生产基地。2009年3月礼来公司对其苏州生产基地增资4200万美元,用于胰岛素产品的包装和仓储,为礼来胰岛素产品产能的进一步扩展打下基础。2009年5月,赛诺菲-安万特集团宣布将对华增资9000万美元,扩建位于北京经济技术开发区工厂的甘精胰岛素预填充预灌装生产线,扩建后产能将达5000万包装单位,并于2012年5月正式投产。至此,全球胰岛素市场三巨头诺和诺德、礼來和赛诺菲-安万特悉数增巨资扩大在华的糖尿病产品产能。这对于国内胰岛素生产企业以及广大的糖尿病相关产品的生产企业而言,无疑是一股巨大的竞争力量。 1.4.2国内主要胰岛素生产企业

面对国外主要的胰岛素生产商大举进入我国市场,国内不少企业也抓紧开发重组人胰岛素及其类似物。1998年12月,我国通化东宝药业利用大肠杆菌为宿主生产的重组人胰岛素填补了我国基因工程技术产品的一项空白,使我国成为世界上除美国、丹麦以外第三个能够生产及销售基因重组人胰岛素的国家。目前通化东宝是中国最大的重组人胰岛素生产厂家,据公司年报报道,2010年胰岛素原料药产能为3000 kg,胰岛素制剂产能为7000万瓶。目前国内人

胰岛素已批准的生产厂商还有万邦生化、珠海联邦、深圳科兴和上海生工。2005年和2007年通化东宝的关联公司甘李药业分别将胰岛素的类似物甘精胰岛素和赖脯胰岛素成功推向市场,这家公司由此成为国内最大的胰岛素类似物的生产基地。江苏万邦制药是中国动物胰岛素的龙头企业,2009年江苏万邦在中国动物胰岛素市场上的占有率超过80%。

胰岛素行业属于高技术含量的行业,不仅包括基因工程人胰岛素表达宿主(大肠杆菌、酵母)的选择、基因工程菌的表达优化、表达后产品的提取纯化和修饰、生产工艺的放大和稳定性等,更包括胰岛素制剂的配方与组分、递药系统的选择与有效性、给药器具的选择和性能等。目前,迫切的问题是提高放大工艺的稳定性和降低生产成本。整体而言,国内基因工程人胰岛素产业化基本处于起步阶段,生产规模甚小,生产成本居高不下,在资金实力、生产技术和品牌积累方面与国际企业差距巨大。因此国内在现有产品的基础上提高技术水平仍将是国产胰岛素扩大市场占有率的重要着力点。面对国内巨大的胰岛素需求和相对落后的研究水平,我国的科研工作者们以及制药企业还有一段艰难的路要走。

1.5重组人胰岛素类似物

普通胰岛素在溶液中通常以六聚体形式存在。皮下注射后,通过体液的不断稀释,解聚为单体分子后才能进入血液发挥作用,就药效时间来说属于短效胰岛素。糖尿病人一天需要不低于3次的皮下注射,这给患者带来无尽的痛苦和麻烦。为改善胰岛素的治疗效果,研究人员利用碱性、无毒和无免疫原性的鱼精蛋白易与胰岛素相结合生成难溶沉淀的特点,得到了含有不同比例沉淀的双时相胰岛素。这种与鱼精蛋白相结合生成沉淀的胰岛素注射后,须经过组织中蛋白酶分解作用,才能将胰岛素与鱼精蛋白分离,然后吸收入血液发挥生物学效应。因此该胰岛素具备了基础胰岛素的延缓作用,可以减少病人的注射次数,与普通胰岛素相比具有一定的优势。但双时相胰岛素治疗只能在一定程度上满足生理性的基础和餐时胰岛素需要,因其具有吸收变异大、作用时间短、作用峰值明显、低血糖发生率高等问题,正在被广泛使用的长效胰岛素类似物所替代[58]。

上世纪末,人们利用已阐明的胰岛素结构与功能的对应关系,采用基因工程技术对人胰岛素的氨基酸序列进行了系统性的结构分析,通过对胰岛素的氨基酸序列的局部修饰,改变胰岛素分子原有的聚合特性,使其具备了速效和长效胰岛素的生理特性,形成了新的人胰岛素类似物。人胰岛素类似物在结构上与人胰岛素存在细小差异，但免疫原性低,保持与胰岛素受体结合的能力,因此具备较强的降糖活性。人胰岛素类似物主要包括速效人胰岛素类似物和长效胰岛素类似物这两大类[59]。 1.5.1速效人胰岛素类似物

速效人胰岛素类似物能模拟胰岛素的餐时分泌,适用于餐时或餐后使用。患者还可以根据自己的具体进食量在餐后及时调整注射剂量,可以有效控制餐后高血糖。目前临床应用的速效人胰岛素类似物主要有以下三种: A 赖脯胰岛素(Insulin Lispro)是由人胰岛素分子B28位(脯氨酸)与B29位(赖氨酸)氨基酸相互交换而形成的胰岛素类似物。该结构不易形成二聚体,在溶液中以单体胰岛素存在,极易吸收入血。赖脯胰岛素与普通人胰岛素相比,能显著改善2型糖尿病患者的胰岛β和α细胞功能,促进胰岛β细胞的胰岛素分泌,减缓糖尿病患者的临床症状。 B 门冬胰岛素(Insulin Aspart)是人胰岛素分子B28位(脯氨酸)被天门冬氨酸所取代而得到的一种新型速效胰岛素类似物。与赖脯胰岛素相比,门冬胰岛素的吸收速率更快,更有利于稳定餐后血糖、恢复患者糖化血红蛋白指标到正常值。

C 赖谷胰岛素(Insulin Glulisine)是人胰岛素分子B3位门冬氨酸被赖氨酸取代,B29位赖氨酸被谷氨酸所替换而得到的一种速效胰岛素类似物。Glulisine可增强对整个血糖的控制,能模拟正常人体内的餐时胰岛素分泌,并可随时根据血糖波动进行调节。 1.5.2长效人胰岛素类似物

长效人胰岛素类似物能模拟人体内胰岛素的基础分泌,持续稳定地控制血糖。主要特点包括吸收稳定,恒速释放入血,作用时间长,重复性好。药效学与胰岛素泵相似,能提供稳定的胰岛素浓度,不仅可以有效控制空腹血糖,且较少引起血糖波动及夜间低血糖。与鱼精蛋白锌胰岛素相比,溶液澄清,用前无需摇匀,便于掌握注射剂量和注射技巧。临床应用的长效人胰岛素类似物主要有以下两种。 A 甘精胰岛素(Insulin Glargine)在胰岛素B链羧基端增加了 2个精氨酸残基,A链羧基端的最后一个天冬氨酸被甘氨酸取代,使其六聚体结构更稳定。由于一级结构的改变,等电点由PH5.4升至6.7,使Glargine在生理pH条件下更难溶解,吸收更为缓慢。添加少量的锌可以进一步延长作用时间。Glargine作用缓慢,可维持24h而无明显血药峰值,每天注射一次以保持基础状态胰岛素水平,与餐前注射超短效胰岛素联合使用,可较好地模拟生理性胰岛素血浓度水平。

B 地特胰岛素(Insulin detemir)是一种中性、可溶的长效胰岛素。它是原型胰岛素去除了 B链第30位苏基酸,通过酰化作用在B29位赖氨酸侧链氨基结合一个14碳的直链脂肪酸而成(图1.7)。酰化的脂肪酸可稳定胰岛素分子

的自身聚集,且与白蛋白可逆性结合,使地特胰岛素从皮下注射部位吸收缓慢,作用持续时间延长,在控制血糖的同时能减少低血糖的风险。胰岛素在和胰岛素受体(IR)结合发挥代谢作用的同时,还会与胰岛素样生长因子受体结合,起到促有丝分裂的作用。胰岛素类似物会不会增加促细胞增殖而引发患癌症方面的风险呢?如表1.2所示,与人胰岛素相比,门冬胰岛素(Aspart)和赖脯胰岛素对IR和IGF-IR与人胰岛素相差不大,而甘精胰岛素(Glargine)对骨肉瘤细胞和乳腺肿瘤细胞的IGF-IR亲和力和促有丝分裂潜力却增加6到8倍。相反,地特胰岛素的igf-i受体亲和力和促有丝分裂潜力分别仅为人胰岛素的1/6和1/9,远小于人胰岛素[60]。Dcjgaard等总结发现鱼精蛋白中性人胰岛素(NPH)治疗人群的癌症发生率大于地特胰岛素治疗人群的2倍以上。与人胰岛素相比,地特胰岛素在细胞水平不增加促有丝分裂能力,治疗人群有较低的癌症发率[61]。在T2DM中进行的研究表明，每天一次地特胰岛素与甘精胰岛素治疗52周后，血糖控制相似,但地特胰岛素组的体重增加显著小于甘精胰岛素组(2.3 kg vs 3.9 kg, p < 0.001)[62、63]。

随人们对胰岛素蛋白质工程的深入研究,已经和正在通过分子设计研究和制造新型胰岛素。这些新型胰岛素或者具有吸收快、迅速起效的特点,或者具有半衰期长、作用持久等优点。相信未来会有更多高活性、高疗效、低副作用或具有特殊功能的胰岛素或胰岛素类似物制品走向临床。另外随着基因工程技术的进一步发展，当前的胰岛素类似物的开发已不仅仅限于产品的表达和分离纯化等步骤的技术水平，而是更加系统的统筹考虑产品的设计和后期的加工。人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和表达质粒,工程菌株的构建应使上下游各单元操作一体化,上游能高效地表达稳定的产物,下游的纯化和后加工处理简单而有效。随着各类胰岛素的联合使用,将能更好的模拟正常人体胰岛素的生理分泌,对临床治疗控制糖尿病起到更好的效果,这将是医用重组胰岛素研究的发展方向。 1.6地特胰岛素

地特胰岛素是一种长达24 h维持基础水平的胰岛素类似物,具有维持相对平稳血糖的作用。在有锌离子存在的药液中,酰化结合的脂肪酸可稳定胰岛素分子的六聚体形式,使地特胰岛素从皮下注射部位的扩散和解聚吸收速率十分缓慢。在单体状态下,含有C14-脂肪酸链的结构又会与组织液中的白蛋白结合,进一步减慢地特胰岛素进入血液循

环的速率。当地特胰岛素进入血液循环系统后,绝大部分的地特胰岛素又重新与血浆白蛋白可逆性结合,稳定存在于循环系统中,持续性的发挥作用,因此能较大程度避免血糖波动。由于地特胰岛素与胰岛素受体和白蛋白结和力相差1万多倍,与白蛋白结合的地特胰岛素到达受体部位后,它便与白蛋白迅速解离并与胰岛素受体结合,发挥它持续维持血糖稳定的长效作用[66]。在244例口服降糖药控制不佳的2型糖尿病(T2DM)患者中的临床实验表明,每天使用一次地特胰岛素可使64.3%的受试者达到糖化血红蛋白(HbAic) < 7%的血糖控制目标,并在最后4周内,近50%的患者在没有低血糖发生的情况下达到HbAic < 7%的控制目标[63、67、68]。

地特胰岛素是丹麦诺和诺德公司历经十多年研发的一种长效胰岛素,通用名为Detemir,商品名Levemir?。2010年在我国上市,商品名为诺和平,随后进入了全国医保目录。地特胰岛素自上市以来,因其良好的疗效和较少注射次数,逐渐为广大的糖尿病患者所接受,市场份额不断增加。2007至2010年的销售额分别为4.79、7.59、9.78和12.26亿美元,年均增长率接近40% (图1.8)。地特胰岛素自研发以来,便在各国申请了多项专利。其中,中国专利有“酰化的胰岛素”[69]、 “肽的酰化方法和新酰化剂” [70]、“生产酰化多肽的方法”[71] 和“包含酰化胰岛素和锌的组合物以及制备所述组合物的方法”[72]等,美国专利有 “Processes for making acylated insulin ”[73]、“Acylated insulin\和“Acylated insulin analogs\等。该产品的专利保护即将于2014年2月2日到期,根据国内企业的实际研发水平和资金实力,地特胰岛素仿制已成为国内糖尿病药物企业低风险、低成本产品开发的热点。 1.7课题背景、目的及研究内容 1.7.1课题背景

自2009年起,中国已经成为世界上糖尿病患者最多的国家,保守估计至2012年底各类糖尿病患者至少1亿以上。另外,虽然我国在上世纪六十年代已成功合成得到结晶牛胰岛素,并在1998年由通化东宝公司利用大肠杆菌生产了重组人胰岛素,但国内的胰岛素及类似物市场仍牢牢的由国外的诺和诺德、礼来和赛诺菲-安万特等几大制药巨头所掌控,国内众多的生物公司占据了不足10%的市场份额。自我国加入WTO以来，国外胰岛素企业的垄断地位有不断增加的趋势,这对国内众多动物胰岛素生产产企和重组人胰岛素企业造成了巨大的冲击,因此研制具有技术和价格优势的国产重组人胰岛素及其类似物是一个十分紧迫的任务,这对于打破国外企业的长期垄断,提高国内企业的技术和装备水平,具有明显的社会效益和经济效益。近年來,因普通动物胰岛素的市场份额明显下降,速效、中效和长效等胰岛素类似物正在为越来越多的糖尿病患者所接受。每日只需注射一次便可稳定控制血糖的地特胰岛素已成为长效胰岛素药物中的优秀代表。国家“重大新药创制”科技重大专项明确将糖尿病等疾病的药物开发列入“ 十二五”实施计划当中，因此开发重组人胰岛素及类似物的生产新技术、新工艺具有现实和长远的意义。

鉴于重组人胰岛素及其类似物良好的市场前景和本实验室在菌株构建、发酵放大、蛋白分离纯化具备的技术实力，2006年我们实验室与山东阿华生物药业有限公司联和立项开发重组人胰岛素产品。山东阿华生物药业有限公司是隶属于央企华润集团的上市公司山东东阿阿胶股份有限公司的子公司。公司目前已有三个重组基因产品上市，

具备完善的动物细胞、大肠杆菌和酵母菌发酵和产品纯化生产线，积累了丰富的生物药物开发和产业化生产经验，为山东省生物药物产业化基地。

本项目自立项之初,便经过了仔细的市场调研和技术评审。综合比较分析目前重组人胰岛素两条主要生产工艺，即美国礼来公司的大肠杆菌表达的重组人胰岛素原经发酵、包涵体复性和酶切的工艺和诺和诺德公司的酿酒酵母表达的胰岛素前体经发酵、酶切转肽工艺。结合本实验室的技术特长，选用了类似诺和诺德公司的工艺路线，即采用毕赤酵母分泌表达胰岛素前体,然后进行酶切转肽和反相分离,最终得到重组人胰岛素。确定工艺路线后,已成功进行了以下工作:

(1)成功构建了胰岛素前体的酵母表达菌株。通过优选连接肽、引导肽,遴选毕赤酵母偏好密码子,构建高效表达菌株,并在5.0 L和16 L微生物发酵罐上进行了高密度发酵,胰岛素前体产量高达12 g/L,比诺和诺得公司利用酿酒酵母的表达菌株高出三倍多。且培养基原料中无蛋白,后续纯化收率高,成本低。胰岛素前体高密度发酵的小试生产工艺已经初步确立。

(2)完成胰岛素前体的初步纯化和酶切。胰岛素前体发酵液上清采用CM-SepharoseFF离子交换纯化工艺,一步纯化得到纯度约为85%的胰岛素前体蛋白,并有效去除发酵液中的大量色素,收集液澄清透明。利用Sephadex G25凝胶过滤层析工艺,将CM离子交换层析得到的收获液一步脱盐,方便更换到可酶切的反应体系,所得到的前体收集液经一步酶切,同时切除引导肽和连接肽,得到B链缺少第30位苏氨酸的胰岛素前体(desB30),酶切效率约为80%左右。

(3)初步建立有机相酶切转肽、脱酯和反相纯化工艺。建立胰岛素前体一步法转肽工艺,转肽产物采用反相纯化进行分离,样品脱酯后再次进行反相纯化,最终得到原型人胰岛素样品。得到的重组人胰岛素样品经分子量测定、体内活性检测与报道一致,表明制备得到的重组人胰岛素具有与上市产品一致的结构和功能。 1.7.2课题目的

利用毕赤酵母表达建立起的重组人胰岛素制备工艺虽然得到了最终的样品,但其制备工艺比较复杂,转肽收率较低,相邻的两步反相工艺使生产成本居高不下,难以实现工业化生产。必须对生产工艺进行系统优化,明显提高转肽的收率,大幅度的降低生产成本,有可能进行真正产业化生产。

在研发原型胰岛素的同时,对2009年在我国批准上市的新型长效胰岛素地特胰岛素的结构和制备工艺进行了大量调研,发现在表达胰岛素前体的基础上进行酶切和酰化,并进行适当的分离纯化就可以得到地特胰岛素,在这方面开展研究也是一项十分有意义的工作。 1.7.3研究内容

为进一步提高原型胰岛素酶切转肽的效率,减少反相层析的操作步骤,必须对已有的原型胰岛素制备工艺进行优化,大幅度降低生产成本,才有可能转化为切实可行的生产工艺。在现有已构建菌株表达胰岛素前体的基础上,对酶切后胰岛素前体进行酰化并分离,就可以得到地特胰岛素。因此通过本课题的研究,建立起一套完整、低成本、产业化可行的地特胰岛素制备工艺,打破国内胰岛素类似物市场被国外大公司长期垄断的局面,是一项十分有意义的工作。预期开展以下几个方面的工作:

(1)利用前期已构建的表达胰岛素前体的毕赤酵母菌株,在已建立的16 L生物反应器小试发酵工艺的基础上(胰岛素前体产量达3.2 g/L 上清液),优化建立300 L反应器大规模高密度发酵工艺,胰岛素前体表达量不低于3.0 g/L。 (2)研究毕赤酵母表达的胰岛素前体的结构,建立胰岛素前体高效酶切的新工艺。

(3)改进胰岛素前体一步法酶切转肽生成胰岛素酯工艺,转肽收率提高到70%以上。优化转化后的纯化及脱酯工艺,减少反相纯化的步骤,降低原型胰岛素的生产成本。

(4)建立N-羟基琥珀酰亚胺肉豆酸酯一步选择性酰化desB30第29位赖氨酸ε氨基的反应工艺,目的产物收率不低于70%。优化酰化后的分离纯化工艺,得到纯度符合生物制品要求的地特胰岛素样品。

第2章胰岛素前体的大规模发酵与初步纯化

2.1前言

本实验室前期已成功构建了表达胰岛素前体的毕赤酵母工程菌株(快速利用甲醇型,Mut+),并经过筛选和鉴定。该工程菌株在16 L微生物发酵罐中,胰岛素前体上清液表达量达到了 3.2 g/L的理想水平[17]。

在利用甲醇营养型毕赤酵母表达外源基因时,尤其是快速利用甲醇型酵母,提高表达量的关键是提高菌体密度和合适的甲醇流加速度。毕赤酵母中外源基因的启动子为醇氧化酶A0X1启动子,这是目前发现的最强、调控机理最严格的启动子之一。培养基中的甲醇既是诱导外源基因表达的诱导物,同时又是唯一的碳源和能源,保持合适的甲醇浓度至关重要。过高的甲醇(>5 g/L)（0.5%）会严重抑制酵母的生长和外源基因的表达,超过3h酵母会很快中毒死亡。另外由于在生物反应器的发酵过程中,菌体密度很高,湿重可达500 g/L以上,因此细胞代谢旺盛,甲醇消耗量大。如果甲醇流加不足菌体会很快处于饥饿状态,而A0X1对甲醇浓度的变化十分敏感,也易导致细胞自溶而死亡,因此必须通

过不断调整甲醇的流加速率,特别是在诱导阶段的初期来保持发酵液中的甲醇浓度控制在合适范围内[79,80]。

重组毕赤酵母发酵表达外源目的蛋白一般分两个阶段,即菌体生长阶段和外源蛋白表达阶段。菌体生长阶段的目的是为了达到一定菌体量,多数釆用能使酵母快速生长的碳源,如甘油或葡萄糖。外源蛋白表达阶段则以甲醇作为唯一碳源和能源来诱导外源基因的表达。在生物反应器培养过程中,菌体生长阶段又可以分为两个阶段,即甘油分批阶段和甘油流加阶段。反应器内基础盐培养基中的甘油初始浓度一般为4-5%,在接种后的18~24h甘油消耗完,菌体湿重可达到90~150g/L。反应器内最初的甘油消耗完后,溶解氧(DO)会迅速升高,这时开始限制性流加50%甘油,进入甘油流加阶段。外源蛋白的表达量很大程度上取决于菌体量,本阶段的目的就是获得较高的菌体量,同时又要避免菌体以太快的比生长速率生长而导致诱导阶段表达量不高。甘油流加阶段结束时,菌体湿重一般可达到250 g/L。当菌体量达到要求后,停止流加甘油,让菌体处于约半小时的饥饿状态,使培养基中的甘油及甘油代谢产物尽可能耗尽,否则甲醇诱导阶段的蛋白表达会受到抑制。

进入甲醇流加阶段后,菌体开始边生长边表达外源蛋白。在甲醇流加初始阶段特别是前2h,酵母从利用甘油的环境转到利用甲醇的环境,需要一个适应的过程。诱导初期甲醇代谢缓慢,溶解氧控制也不稳定。.稍有不慎,可能引起甲醇在培养基中的积累而导致菌体死亡。一旦酵母经过最初2-4 h甲醇适应期后,溶解氧浓度开始变平稳,随后可以逐渐增加甲醇的流加速率并达到最大值,然后保持相对稳定流加速率直到发酵结束。甲醇流加期间,菌体仍以一定速率生长,最后菌体湿重可达500 g/L以上。

按照invitrogen公司的方法,对于 Mut+菌株在经过约6 h的甲醇适应期后,甲醇流加速率可基本保持稳定。但不同菌株因表达的外源蛋白及目的基因拷贝数的不同,甲醇的消耗速率也不一样,其他外源蛋白表达优化的甲醇流加方式不一定适合当前的工程菌株。另外,在诱导过程的前中后不同阶段,菌体的生长状态及活细胞总量不同,菌体对甲醇有不同的需求量。处于诱导表达的早期阶段菌体,菌体的生长状态较好,在适应了甲醇提供的诱导环境后,菌体量也在迅速增加,死亡菌体占的比例很小,旺盛的代谢消耗大量的甲醇,需要及时调整甲醇的流加速率。到了诱导过程的中后期,菌体长期处于甲醇诱导强氧化环境之下,生长状态逐渐变差,死亡菌体的比例明显上升,对甲醇的代谢需求下降,需要对甲醇的流加速率进行不断调整,以避免甲醇在培养基的过度积累。若按照传统方式在诱导的中后期仍以恒定速率流加甲醇,很显然不是处于甲醇诱导的最优状态。开发过程中,必须根据发酵过程的实际情况,建立切实可行的发酵工艺。

在前期16 L反应器小试发酵工艺的基础上,本章研究的目的在于通过严密监控培养基中的甲醇浓度來确定适宜的甲醇流加速率,进一步优化小规模发酵工艺,建立300 L规模的中试胰岛素前体发酵生产工艺。同时,对发酵上清中的胰岛素前体提纯工艺进行优化放大,制备足够量的胰岛素前体。制备得到的胰岛素前体一是用于优化胰岛素前体的酶切转肽工艺,用于重组人胰岛素的生产;二是用于建立并优化胰岛素前体的酶切酰化工艺,用于地特胰岛素的样品制备。

2.2实验材料和方法 2.2.1工程菌株

发酵使用的表达胰岛素前体工程菌株,标记为GS115-pic-9k:ILP (AAK),由本实验室自行构建,在本实验室液氮中冻存[17]。 2.2.2培养基

MGY (His-)种子培养基配方:依次称取13.4 g YNB和10.0 g甘油,溶解后定容1 L并分装,121℃,灭菌30min。冷却后分别无菌加入生物素母液至终浓度为0.4 mg/L。

PTM1 配方:依次称取 6.00gCuSO4-5H2O,0.08 gNal, 3.00 g MnSO4,0.20 gNa2MoO4-2H20, 0.02gHBO3,0.91 g CoCl2.6H2O, 20.00 gZnCl2, 65.00 g FeSO4-7H20,5.00 ml浓H2SO4。先在烧杯中加入少量的水,再逐一加入各种试剂,每加入一种试剂都要充分搅拌,最后加入H2SO4搅拌至完全溶解。最后加入生物素溶解完全,定容1L后无菌过滤分装,置4℃避光保存。

发酵罐基础培养基(BSM)配方:依次称取13 ml 85% H3PO4, 10.6 g KOH, 0.8 gCaSO4,18.2 g K2SO4, 14.9 g MgSO4-7H2O,13.2 g (NH4)2SO4,40.0 g 甘油,0.3 ml Antifoam204, 4.5 ml PTM1。用适量ddH2O溶解,转移至罐中定容1 L。在位115℃灭菌30min。冷却至35℃,通气过夜预培养。

甘油补料培养基:称量适宜分析纯级甘油,配成50% (w/v)甘油,并添加PTM1微量元素溶液12ml/L,避光保存使用。 甲醇诱导培养基:取适量分析纯级无水甲醇,按12 ml/L (V/V)加入PTM1,避光保存使用。 2.2.3种子培养

一级种子:从液氮中取出冻存种子,按1:50接入到50 ml MGY培养基中(接入前加生物素母液至0.4 mg/L), 30℃和220 r/min培养24 h作为一级种子。

二级种子:按1:40比例将一级种子接入到适宜体积MGY摇瓶中,30℃和220 r/min培养,或接入种子罐中培养。

当D600达到6--8时,作为反应器种子液。 2.2.4 16 L发酵罐培养

所用设备为瑞士 Bioengineering全自动微生物发酵罐。

已经过pH校正的灭菌后发酵罐,按4.5 ml PTM1/L罐内培养基的比例向罐内加入PTM1溶液。用氮水调pH至5.0并自动控制pH,调节合适转速和通气量校正 DO至100%。按10%的接种比例,将二级种子液接入罐中。 2.2.4.1甘油分批培养

接种后观察罐内DO的变化情况,及时调整转速和通气量,保持罐内DO不低于30%。当DO仍达不到30%时,通入适量比例的氧气保持DO稳定。定期取样,测定菌体湿重和镜检是否污染杂菌。 2.2.4.2甘油流加培养

培养过程中,当DO迅速上升至100以上并保持稳定时,罐内碳源(甘油)基本消耗殆尽,开始流加50%甘油。正常情况下接种20h,菌体湿重100 g/L左右时开始流加。 2.2.4.3甲醇诱导表达

合理控制甘油的流加速率,使比生长速率不超过0.3 h-,避免菌体过快生长。当菌体湿重达到250g/L,甘油流加8 h左右时,开始准备进行甲醇诱导。停止甘油补料,设定pH值为3.5。待DO回升至100后,降低转速及通气量,控制DO在50%左右。30 min后,按2ml/(L·h)速率开始流加甲醇,根据培养基中的残留甲醇浓度(气相测定)、DO变化和菌体湿重,缓慢增加甲醇的流加速率,调整转速、通气量和氧气比例,保持DO稳定在30%左右。

利用DO变化调整甲醇补料速度(溶解氧激荡法,DO spike):停止补料30 s,溶解氧值应当上升10%;如果溶解氧值上升超过10%,则说明可以加快补料速率;溶解氧值上升不足10%,说明应当降低补料速率。同时用气相色谱对发酵液中的甲醇浓度进行定期检测,防止发酵液中的甲醇浓度过低或过高。

当菌体湿重增加缓慢或胰岛素前体表达不再增加时,发酵结束。将发酵液在8000g和4℃下离心30 min,上清液-20℃冻存或立即纯化。 2.2.5 300 L发酵罐培养

所用设备为美国NBS公司20 L种子罐和300 L全自动微生物发酵罐。

300 L发酵罐发酵用的种子培养基和基础培养基配方与16 L发酵罐相同,同比例放大配制。基础培养基灭菌之前,300 L发酵罐要空消一次。接种、甘油和甲醇流加策略釆用与16 L发酵罐相类似的控制方法。 2.2.6胰岛素前体的初步纯化

所用设备为瑞典Pharmacia Biotech公司AKTAexplorer 100层析工作站。所用填料为CM-Sepharose FF离子交换介质,层析柱为XK 5.0 cm*20.0 cm (装填300 ml介质),层析流速40ml/min。层析所用平衡液为50 mmol/L柠檬酸钠,pH3.5;洗涤液为平衡液+0.10 mol/LNaCl, pH 3.5;洗脱液为平衡液+0.5 mol/LNaCl. pH3.5;盐再生液为1.0 mol/L NaCl;碱再生液1.0 mol/L NaOH。离心上清液用0.45 um的微孔滤膜过滤后,用d H2O稀释10倍,调pH 3.5。稀释后的上清液连续上样,上样量不超过介质最大结合量的70%,并用HPLC检测流穿液中是否有产物流出。上样完毕,用平衡液平衡至基线稳定,用洗涤液洗涤杂蛋白,用洗脱液洗脱收集目的蛋白。分别再用盐再生液和碱再生液对介质进行再生。

2.2.7分析方法

2.2.7.1菌体湿重测定

取样菌液混勻,准确计量体积,11180g离心5min,去上清,甩干或吸干残余液体,精密称重,单位g/L。 2.2.7.2 镜检

利用血球计数板和美兰染色法,对发酵样品不定期显微镜镜检观察细胞状态和杂菌污染情况。 2.2.7.3发酵液中残留甲醇量测定

采用气相色谱法检测甲醇含量。气相色谱仪为Agilent Technolgies公司7890A GCsystems型;DB-WAX (强极性柱)毛细管气相柱,30 m* 320um * 0.25um 参数设置:流速6.5ml/min;进样口温度150℃; FID检测器,加热器200℃,H2流量30 ml/min,空气流量400 ml/min。柱温箱升温程序设置:初始,40℃,保持5 min;以80℃/min速率升至230℃并保持5 min。

用纯度超过99.9%、含水量低于0.05%的色谱级甲醇配制成浓度为8.0 g/L(l%,v/v)、6.4 g/L (0.8%)、4.8 g/L (0.6%). 3.2 g/L (0.4%)和 1.6 g/L (0.2%)系列甲醇标准溶液,制作标准曲线。对不同浓度的标准甲醇样品进行了气相检测,并对甲醇峰面积进行了自动积分。根据测定结果,绘制了甲醇浓度标准曲线(图2.1)。利用毛细管柱测定样品中的甲醇浓度,甲醇出峰时间约1.2 min,出峰时间很快,完成整个样品检测为12.5 min。该方法测定甲醇浓度时,信号响应灵敏,重复检测误差不超过1%,得到的标准曲线线性趋势线高,结果可信。

利用得到的甲醇浓度标准曲线对发酵过程中的发酵液中的甲醇量进行了定期检测。发酵过程离心上清液经0.45

第6章地特膜岛素的酰化及产物分析

6.1前言

自1921年从动物胰脏成功提取出胰岛素以来,糖尿病不再是一种让人恐惧的疾病,许多人的生命因此得以延续。随后胰岛素经历了从动物胰岛素到人胰岛素、再到胰岛素类似物两次具有里程碑意义的历史飞跃。目前多种类型的胰岛素及其类似物的联合应用,使得糖尿病的治疗从简单的控制患者餐后血糖,演变为持续保证病人的糖代谢状态接近正常,又要最大程度地减少低血糖带来的风险,更好提高糖尿病人的生活质量,减少各种并发症的发生。

人的胰岛细胞每天都会产生胰岛素,其中部分胰岛素以前体的形式贮存起来,另一部分分泌到血液中。胰岛素的生理性分泌可分为基础胰岛素分泌和餐时胰岛素分泌,这两部分胰岛素每天的分泌量基本相同。基础胰岛素分泌是指胰岛细胞全天持续不断的分泌微量的胰岛素(约0.5-1 IU/h)进入血液中,是在无外源糖类物质刺激的条件下分泌的胰岛素,维持空腹状态下的血糖正常水平。餐时胰岛素是指在外源性刺激(如进食)后短时间分泌的胰岛素,分泌量约6~8 IU。正常人进餐后8-10 min血浆胰岛素水平开始上升,30-45min达高峰,餐后90~120 min恢复到基础水平。新型胰岛素类似物,如地特胰岛素和甘精胰岛素属长效胰岛素,能模拟人体两餐之间、夜间以及空腹期的基础胰岛素分泌,在糖尿病治疗领域占有越来越重要的地位。

每日只需注射一次便可稳定控制血糖的地特胰岛素目前已成为长效胰岛素药物中的优秀代表。地特胰岛素以其作用时间长达24 h、曲线平缓、分子安全性高、吸收变异性小、低血糖发生率低、体重增加少等独特优势,在糖尿病日益肆虐的今天,发挥着极其重要的作用[58]。地特膀岛素是一种中性、可溶的长效胰岛素类似物。它去除了胰岛素B链第30位的苏基酸,在B29位赖氨酸侧链ε-氨基酰化结合14 C脂肪酸。地特胰岛素的一级结构如图6.1所示,分子式为C267H402N64O76S6,分子量为5916.9。

6.1.1缺苏胰岛素的保护性酰化

诺和诺德公司最先完成地特胰岛素的工业化生产。从诺和诺德申请的多项专利来看，其主要采用图6.2所示的工艺路线,生产工艺较为复杂,总收率低于 20%[74]。首先,以人胰岛素或猪胰岛素为起始材料,利用牛羧肽酶A条件酶切得到B链缺少第30位苏氨酸的胰岛素desB30。然后,以desB30原料,利用二碳酸二叔丁酯 (BOC)衍生保护desB30两条链的N末端α氨基,反相分离得到N末端α氨基保护的desB30。接着,以N端氨基保护的desB30为原料,利用肉豆蔻酸琥珀酰亚胺酯酰化B29位赖氨酸的ε氨基,得到酰化后的胰岛素酯。最后,利用TFA脱保护,生成地特胰岛素。后来,诺和诺德公司又报道了一种利用重组表达的胰岛素前体生产地特胰岛素的方法。该方法不再需要N末端α氨基的BOC保护和最后的TFA去保护,收率明显提高[73]。但该方法首先需要昂贵的专一性强的赖氨酸酶在B29位置特异性酶切，将胰岛素前体酶切生成双链蛋白，然后再酰化、胰蛋白酶酶切，最后生成地特胰岛素。这种方法尽管酰化收率较高，但生产成本并没有明显降低。

6.1.2缺苏胰岛素的选择性酰化

蛋白质的“酰化”是指在蛋白质的一个或多个游离氨基上共价引入酰基的过程。氨基的酰化是常见的蛋白质化学修饰方式之一。蛋白质的酰化反应并不容易发生,必须在一定条件下才能进行。首先,发生反应的氨基须去质子化。其次,酰基的供体须具有较高的活化能,才能获得较高的酰化收率,所以一般不利用较难溶解且低酰化收率的脂肪酸来直接参与反应,而使用活化酯、酰卤或酸酐酰化來提高收率。N-羟基琥珀酰亚胺脂肪酸酯,是一种常用的酰基提供者,是代替脂肪酸酰化游离氨基的一个有效的试剂[127]。

胰岛素或前体类似物的分子中具有3个游离的氨基,分别是位于Bl(Phe)和Al(Gly)的两个α氨基和B29(Lys)的ε氨基。正常情况下,蛋白质N末端α氨基的pKa为7.6-8.0,小于蛋白质其他部位如赖氨酸ε氨基的pKa (10.0-10.2)。在酰化反应的pH值为6.9时,由于pH接近中性,氨基不能有效去质子化,所以整体酰化效率较低,酰化反应的活性顺序为A1≈B1>>B29。在酰化反应pH值为8.5的弱碱性条件下,α氨基去质子化而ε氨基依然为离子状态,受B1侧链苯基的空间位阻和共轭双键的共同影响,导致A1位α氨基大部分被酰化,酰化反应的活性顺序为Al>Bl≈B29[128]。美国礼来公司报道了一种新的胰岛素酰化方法,即在碱性环境、胰岛素前体所有的游离氨基均都去质子化的条件下,在含有有机溶剂的极性水溶液中,胰岛素前体与溶液中的脂肪酸活化酯发生反应,可以选择性酰化胰岛素前体的ε氨基。由于在pH大于12.0的条件下会引起蛋白质的降解,所以碱性条件是指反应的pH值在9.5至11.5之间的范围。该溶液的pH值使胰岛素前体在水溶液中ε氨基处于未离子化而α氨基则被重新离子化的状态。如表6.1所示,在这样的酰化条件下,胰岛素前体的ε氨基被选择性酰化,单酰化α氨基的产率不到5%,单酰化ε氨基的产物与单酰化α氨基的产物的比例达到199,一步酰化反应收率接近80%[129、130]。“选择性酰化”反应是在游离α氨基存在的情况下,不需要酰化前将α氨基保护,酰化后再去保护的操作,因此这种制备工艺比诺和诺德的生产工艺简单,酰化的成本也会大幅度降低。

6.1.3肉豆蔻酸活化酯的制备

在选择何种脂肪酸链作为酰基的供体时,诺和诺德公司通过大量的实验证实,十四碳的脂肪链与白蛋白结合力最强,药效作用时间最长,低血糖风险低,因此十四碳的肉豆蔻酸成为酰基的供体,与胰岛素前体反应生成一种新型的长效胰岛素一地特胰岛素[131、132]。

肉豆蔻酸(Myristic acid), 又称为十四烷酸,是一种饱和脂肪酸。白色蜡状结晶固体,相对密度0.8439，不溶于水，溶于乙醇和乙醚。前面已提到，若肉豆蔻酸直接参与酰化反应，因其不溶于水和较低的活化能，酰化反应的收率很低，必须采用其活化酯的方式作为十四碳酰基的供体。N-羟基琥珀酰亚胺是最常用的活化有机酸羧基的试剂，它可以与肉豆蔻酸在常温常压下反应生成的N-羟基琥珀酰亚胺肉豆蔻酸酯。用生成的活化酯来酰化desB30将可以明显提高酰化反应的效率。

然而, N-羟基琥珀酰亚胺肉豆蔻酸酯不是常用的有机原料,价格昂贵,每克的价格接近1400元。这样的价格不适于地特胰岛素的工业化生产,因此必须解决由肉豆蔻酸来生产N-羟基琥珀酰亚胺肉豆蔻酸酯的生产工艺，才能使地特胰岛素的生产成本降低到可以接受的水平。由脂肪酸生产其相应的活化酯并不十分复杂，只要选择合适的催化剂和反应溶剂，再采用有效的分离手段，就能得到纯度合格的活化酯，用自制的活化酯来制备地特胰岛素将可明显降低生产成本。

图6.3为N-羟基琥珀酰亚胺肉豆蔻酸酯和一步选择性酰化的制备工艺示意图。第一步反应为活化酯的制备反应工艺，肉豆蔻酸和N-羟基琥珀酰亚胺在合适的条件下，一步反应就可以得到想要的活化酯。第二步反应是采用选择性酰化的方法，在未保护下游离α氨基的情况下，缺苏胰岛素desB30的ε氨基被酰化。

6.1.4本章研究目的

前面几章,我们利用毕赤酵母大规模发酵得到胰岛素前体,采用合适的纯化和酶切方法，得到了缺苏胰岛素desB30。在实现desB30大规模制备的基础上，建立一步选择性酰化desB30蛋白ε氨基的制备工艺来生产地特胰岛素，将是一项十分有意义的工作。

本章研究的重点是建立N-羟基琥珀酰亚胺肉豆蔻酸酯的制备工艺，优化一步选择性酰化的反应条件,建立地特胰岛素大规模制备的方法。同时,对制备的活化酯和地特胰岛素开展全面的质量研究,保证制备的地特胰岛素样品与诺和诺德的样品在纯度、分子量和生物活性等多种检测指标方面的一致性。 6.2实验材料和方法

6.2.1主要试剂

肉豆蔻酸(C14H28O2,MW228.37, CP 级)、四氧呋喃(THF, AR 级)、环己烷(C6H12,AR级)、乙腈(CH3CN,AR级)、硼酸(H3BO3,MW61.83,AR级)购于国药集团上海化学试剂有限公司, N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu,C4H5NO3,MW115.09,纯度>98%)、N,N-二环己基碳二亚胺(DCC, C13H22N2,纯度>98%)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI, C8H17N3·HCl, MW191.70,纯度>98%)购于上海达瑞精细化学品有限公司,柱层析用硅胶(20-300目)购于青岛黄海化学试剂公司。

N-羟基琥珀酰亚胺肉豆蔻酸酯(Myristic acid N-hydroxysuccinimide ester, MW325.45,C18H31NO4,纯度98%)、三羟甲基氨基甲院(Tris)购自Amresco,HPLC级乙腈、三氟乙酸(TFA)购自J&K Chemical,其他为国产分析纯试剂。 6.2.2 N-羟基琥珀酰亚胺肉豆蔻酸酯的制备 6.2.2.1小试制备

(1)酯化反应。684 mg肉豆蔻酸和620 mgN,N-二环己基碳二亚胺(或等摩尔1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)加入三口反应瓶中,用10ml四氢呋喃搅拌溶解。称取345 mgN-羟基琥珀酰亚胺用5 ml四氢呋喃溶解,用注射器注入三口瓶中,过夜搅拌 20h。

(2)反应液硅胶纯化。合成的N-羟基琥珀酰亚胺肉豆蔻酸酯用下列方法纯化:

（a）装柱。称取200-300目硅胶100 g,加入到200 ml环己烷中,充分搅袢溶胀,形成勻浆。在层析柱底用棉花塞紧,加入1/3体积环己烷,装上蓄液球,将硅胶匀浆一次倾入蓄液球内。打开柱下活塞,用环己烷将吸附在蓄液球内的硅胶冲入柱中。沉降完成后,加入更多的环己烷,用双联球加压直至流速恒定。 (b)上样。研钵中加入5 g硅胶,将反应液缓慢加入研钵中,在通风橱中让溶剂挥发,再加入部分反应液,如此重复,直至把样品全部加进去,挥发、拌匀。

将层析柱内环己烷放出少许,硅胶距液面2~3 cm。将吸附反应液的硅胶(分两次纯化)均勻铺到层析柱中,及时补充环己烷避免硅胶干裂。待样品全部加入后,重新铺入2-3 cm厚的新硅胶,避免洗脱时冲起吸附样品后的硅胶而影响分离效果。

(C)洗脱。采用阶段梯度洗脱方式纯化目的产物。先用环己烷冲冼1.0 CV,然后依次用环己烷与乙酸乙酯比例分别为5:1 (1.0 CV)、3:1 (1.5 CV)和2:1 (3.0 CV)的溶液进行洗脱,编号分管收集洗脱产物。最后用1.0 CV体积的乙酸乙酯洗脱。所有洗脱液用前超声20 min。

(3)样品点板检测。将标准品、反应液、各管收集液点样相同硅胶制成的硅胶板,用环己烷:乙酸乙酯为5:1溶液作为展开剂展开。展开完毕,吹风机烘干,254 nm紫外波长下检测。根据检测结果,与标准品迁移率相同,纯度超过98%收集液合并。

(4)浓缩干燥。将合并收集液45℃下旋蒸去除有机溶剂,得白色粉末。进行质谱和氢谱检测。 6.2.2.2中试制备

称取34.20 g肉豆蔻酸和28.75 g 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐,溶于500ml四氢呋喃,搅拌至完全溶解。称取17.25 gN-羟基丁二酰亚胺,溶于250ml四氢呋喃溶液中。将该溶液加入到前面反应液中,室温搅拌过夜。

装填1L层析硅胶,按照小试操作方法进行分离纯化,最后旋蒸去除有机溶剂得到目的产物。 6.2.3酰化反应

发酵得到的胰岛素前体经CM-Sepharose FF离子交换层析和C18反相层析并酶切、旋蒸去除乙腈后等电点沉淀得到desB30冻干粉末(详见第2、3和4章),为本实验的原料。酰化反应所用活化酯采用本章6.2.2.2所述的中试工艺制备而得。

初始反应采用礼來公司专利报道的ε氨基选择性酰化条件即溶剂为含50%乙腈水溶液,desB30与活化酯摩尔比为1:2.5,反应的pH为9.5,反应时间90min。

酰化反应的操作如下:

(1)称取200mg desB30粉末,溶解于20 ml硼酸溶液(50 mmol/L, pH2.5)中,搅拌使蛋白质样品全部溶解,得到desB30浓度为1.75 mmol/L溶液。用10% NaOH调节pH至9.5后加入18 ml乙腈,搅拌15min。 (2)称取50mg活化酯,用5.0 ml乙腈配制10 mg/ml (30.7 mmol/L)的活化酯溶液。

(3)将计算量的活化酯溶液缓慢滴加至已完全溶解的desB30溶液中,反应90min后,用2倍体积的1.0 mol/L醋酸溶液终止反应。取样用LC-MS检测酰化反应各产物的分子量。 6.2.4酰化反应条件优化及放大 6.2.4.1溶剂体系优化

在初步酰化反应的基础上,将酰化反应溶液中的乙腈分别更换为乙醇、甲醇、丙酮和异丙醇,其他条件不变,分别进行酰化反应。活化酯全部加完并混匀后立即取样200 ul,标记为0min样品。以后每隔l0min取样,直至反应90min。

取样后的反应液立即加入2倍体积的1.0 mol/L醋酸溶液终止反应,HPLC检测desB30、酰化目的产物和副产物的峰面积。

6.2.4.2 pH值优化

在初始的酰化反应的基础上,在乙腈体系中,将酰化反应液pH值分别设定为9.52,9.76, 10.50,10.74,其他条件不变,分别进行酰化反应。取样方法同6.2.4.1,反应液进行HPLC分析和产率计算。 6.2.4.3原料比优化

控制反应溶剂为乙腈,pH为10.50,酰化反应中desB30 与活化酯的原料摩尔比分别为1:2.1,1:1.5, 1:1.2,1:1.0,其他条件不变,分别进行酰化反应。取样方法同6.2.4.1,反应液进行HPLC分析和产率计算。 6.2.4.4酰化产物的制备

采用优化后的小试反应条件,将酰化反应规模放大10倍。反应结束后,用2倍体积的l.0mol/L醋酸溶液终止反应,进行反相层析。

所用层析系统为瑞典Pharmacia Biotech公司AKTAexplorer 100层析工作站。层析柱为美国GE公司的FineLINETM Pilot 35反相层析柱,规格为200 mm x 35 mm (柱体积192 ml,自装,理论塔板数不低于12000/m)。填料为美国GE公司SOURCE 30RPC。

层析中,所用A相为0.1% TFA ddHaO, B相为100%乙腈;流速20 ml/min; 30 % B相平衡反相柱至基线稳定;用醋酸终止反应的酰化反应液经0.45 um的微孔滤膜过滤后上样,上样量不超过50 mg/ml gel; 30% B再平衡,洗脱梯度为40 min B相由30%上升至55%,收集洗脱峰。收集液旋蒸去除有机相后,加入Zn(Ac)2至Zn2+终浓度0.5 mmol/L,用NaOH溶液调pH5.8,过夜沉淀。4℃和10000 g离心30 min收集沉淀,用4℃冷水洗涤沉淀两次,冻干得酰化目的蛋白粉末。

6.2.5分析方法

6.2.5.1 desB30转化率检测

所用仪器及分析软件同第3章胰岛素前体纯度检测。流动相A: 0.1% TFA;流动相B: 0.1%TFA+100%乙腈;超声脱气 20 min;进样量20u1,流速 1.0 ml/min; 28% B 平衡,线性梯度冼脱程序为 28-48% B (15 min),48-80% B (7 min), 80% B (8 min)。desB30转化率根据酰化样品HPLC图谱的相关峰计算得到。desB30转化率为B29单酰化产物的峰面积/(desB30峰面积+B29单酰化产物峰面积+二酰化产物峰面积)。 6.2.5.2酰化产物的分子量测定

酰化样品的LC-MS检测:6.2.3酰化反应终止样品和单酰化冻干产物(酰化样品多次HPLC检测收集得到,未专门分离制备)经DTT还原后的样品做LC-MS检测。为避免质谱检测时负离子峰过强,液相分析时B相不添加TFA,其他液相条件同6.2.5.1。质谱操作条件见相应图谱说明。

使用ABI公司的MALDI-4800-TOF-TOF进行对酰化分离后的目的产物进行分子量测定。波长为355 nm的固体激光源,线性方式,飞行管长1.22m,加速电压;20kV,基质为肉桂酸,采集正离子。该项目委托中国科学院上海生命科学研究院生化与细胞研究所蛋白质组研究分析中心检测。 6.2.5.3酰化的产物的全序列测定

采用质谱法,使用ThermoFinnigan公司的LTQ-Velos质谱仪对酰化目的产物进行全序列测定。进样方式为Micro spray,毛细管柱规格0.15 mm x 15 cm,温度170℃,扫描范围30-1600 Da。该项目委托中国科学院上海生命科学研究院生化与细胞研究所蛋白质組研究分析中心进行检测。 6.2.5.4酰化目的产物的生物活性测定

参照中国药典2010年版二部附录XIIG下《胰岛素的生物测定法》,委托中国食品药品检定研究院激素室开展酰化目的产物的生物活性研究[133]。实验动物为昆明种、SPF级雄性小鼠,体重18-20 g。对照品为高纯度胰岛素国家标准品,比活性为27 IU/mg。用pH值为2.5的含0.2%苯酚的生理盐水将标准品稀释成60 mIU/ml (标准品高剂量,SH)和30 mIU/ml (标准品低剂量,SL)的溶液,供试品同样稀释成60 mIU/ml (供试品高剂量,TH)和30 mIU/ml (供试品低剂量,TL)的溶液。实验过程采用小鼠血糖双交叉法,即随机把小鼠分成4组,每组10只,逐只编号,各组小鼠分别自皮下注入一种浓度的标准品或供试品稀释液,每鼠0.3 ml,注射后每只准确计时40min后,按给药顺序分别自眼眶静脉丛采血,用罗氏血糖仪测定血糖值。相隔3 h以上,按表6.2双交叉设计原则,对每组各鼠第2次给药,并测定给药后40 min的血糖值。

图2.7为该步纯化过程中上样液、流穿液和收集液的HPLC检测图谱。该步层析能较好去除色素（色素不与介质结合），上样过程没有发现胰岛素前体流穿且结合量不低于30mg/ml介质。通过离子交换层析，收集液中前体纯度为88%（图2.7 C），绝大部分的色素分子得以去除，收集液呈现很淡的黄色，说明胰岛素前体得到很好的浓缩和提纯。根据HPLC检测的结果，CM层析过程中未发现有胰岛素前体的流穿，纯化得率达到96%。 2.4本章小结

本章中，我们建立了胰岛素前体和甲醇浓度的测定方法，利用毕赤酵母的小试发酵工艺，成功进行了300L规模的胰岛素前体发酵，并对发酵液上清进行了初步纯化，制备了大量胰岛素前体样品，为以后的前体结构分析、酶切、转肽和酰化等工艺的建立与优化奠定了基础。

(1)利用甲醇诱导毕赤酵母分泌表达外源蛋白,甲醇浓度的控制十分关键。本章采用气相色谱毛细管柱方法绘制了甲醇浓度标准曲线来测定发酵液的甲醇浓度,测定时间短,信号响应灵敏,误差不超过1%。结合DO激荡法,发酵的一次成功率大大增加。在300 L发酵罐发酵时,按比例进行体积放大,一次放大成功,得到胰岛素前体约320 g,相当于16 L发酵罐约20批的产量,而且还有进一步提高的潜力。这为将來的工业化生产奠定了良好的基础。 (2)建立了胰岛素前体的初步纯化工艺,对于后面开展相关研究工作打下了坚实的基础。利用CM-Sepharose FF离子交

换层析从富含色素的发酵上清中提纯胰岛素前体是一步有效的工艺。上样过程中色素绝大部分流穿而产物与介质良好结合,且结合量不低于30 mg/ml介质。经过一步离子交换层析,收集液中的前体纯度达到88%,前体得率达到96%,说明胰岛素前体得到较好浓缩和提纯。

第3章胰岛素前体的N末端不均一性分析

3.1 前言

毕赤酵母是目前应用最广泛的的外源蛋白表达系统之一，大约有近30%外源蛋白的表达使用该系统。利用毕赤酵母表达胰岛素前体是近来的一个研究热点[28、81-84]。据Kjeldsen等报道[12,53]，在酿酒酵母中表达完整人胰岛素原时，因不能有效地分泌胰岛素原而导致失败。但若在编码胰岛素原cDNA的分子中去除B30位的苏氨酸，用短C肽代替或直接将胰岛素原的B29与A1相连，然后再与酿酒酵母的α交配因子相连，能明显提高单链胰岛素前体的分泌表达水平。如图3.1所示，我们实验室在2006年构建毕赤酵母表达人胰岛素前体菌种时，借鉴这种方法，用短C肽AAK替代C肽，并去除B30(Thr)，实现了胰岛素前体在毕赤酵母中的有效分泌表达，胰岛素前体在16L微生物发酵罐中产量达到了3.2g/L，并建立了初步的酶切转肽和分离纯化工艺[17]。

在图3.1中可以发现，在目的蛋白N末端，引入了一段人工合成间隔肽(Spacer peptide,图3.1中用\表示)序列。这段间隔肽序列是由十个氨基酸EEAEAEAEPK组成，包含多个EA重复序列。引入此段序列的目的，一是提高目的蛋白的表达量，实验证实多数外源蛋白的表达量可增加50%以上；二是增加毕赤酵母自身产生的重要信号肽酶—双氨基内肽酶（Kex2）的酶切活性，减少未切除信号肽的融合蛋白的分泌[44,85]。虽然间隔肽的引入对于提高信号肽的活性和增加外源蛋白的有效表达有明显的促进作用，但间隔肽如何完全或部分均一切除也是一个较为棘手的问题。对于一个药用蛋白，如果N末端不均一，无法获得上市许可。虽然酵母本身可以产生二肽氨肽酶A（Ste13酶）在间隔肽中的谷氨酸丙氨酸（EA）后进行酶切，但该间隔肽中含有三个这样的酶切位点（图3.2），表达得到的产物是否均一是个值得探讨的问题。

与酿酒酵母相似，在毕赤酵母高密度发酵分泌表达外源蛋白过程中，也发现表达的外源蛋白出现C末端或N末端氨基酸被降解的现象。如重组水蛭素HV2在毕赤酵母表达的上清中至少存在三种C末端依次被降解1-3个氨基酸的产物[86、87]。毕赤酵母表达的外源蛋白N末端不均一性的情况也有报道,对其内部各种酶的研究也较多利用毕赤酵母分泌表达得到的胰岛素前体,在发酵上清中是否也存在上述的不均一现象?本章通过对发酵上淸中胰岛素前体的再次纯化,得到了纯度超过了 96%的胰岛素前体样品,并对该样品进行了分子量的精确测定和N末端测序。发现分泌到发酵上清中的胰岛素前体N末端存在不均一现象,但未发现其C末端存在降解现象。该胰岛素前体的N末端结构的不均一性存在怎样的规律?是什么原因造成这种现象的发生? N末端不一致的前体是否也会造成最终生成的人胰岛素或地特胰岛素N末端不一致?本章对这些问题进行了深入的的研究。

3.2实验材料和方法

主要试剂HPLC级乙腈、制备级乙腈和三氟乙酸(TFA)购自J&K Chemical,其他为国产分析纯试剂。 胰岛素前体纯度检测同第2章2.2.7.4中的胰岛素前体表达量测定方法。 3.2.1胰岛素前体的反相制备

样品:为胰岛素前体工程菌发酵罐培养上清,经CM-Sepharose FF离子交换层析得到的CM收集液,详见第2章。 设备及层析柱:层析系统为大连依利特分析仪器有限公司生产的P270型制备型高效液相色谱,配有2泵和DAD检测器。层析柱为瑞典AkzoNobel公司的Kromasil?半制备型色谱柱,规格为250 mm x 21.2 mm,填料为C18-10um-100?。

层析方法:A 相为 0.1%TFAddH2O,B 相为 l00%CH3CN;流速 20 ml/min; 20%B相平衡反相柱至基线稳定;CM收集液经0.45um的微孔滤膜过滤后上样,20% B再平衡。线性梯度洗脱程序为0~20 min,20-40% (B),收集洗脱峰。收集液旋蒸去除有机相后,冻干得胰岛素前体蛋白粉末。 3.2.2胰岛素前体的结构分析

用MALDL-TOF方法测定胰岛素前体的分子量(MALDI-4800-TOF-TOF,美国ABI公司)。检测波长为355 nm的固体激光源,线性方式,飞行管长1.22 m,加速电压20 kV,基质为肉桂酸(CHCA),采集正离子。该项目委托中国科学院上海生命科学研究院生化与细胞研究所蛋白质组研究分析中心检测。

胰岛素前体的N末端测序采用Edman降解法,使用SHIMADZU公司的PPSQ-33A型全自动蛋白质多肽N末端氨基酸序列分析仪,测定胰岛素前体N末端15个氨基酸。该项目委托中国科学院上海生命科学研究院生化与细胞研究所蛋白质组研究分析中心进行检测。 3.3实验结果

3.3.1胰岛素前体的反相制备层析

经CM离子交换层析后,得到重组人胰岛素前体收集液,颜色呈现较淡的黄色,OD280/OD260比值在1.55--1.65之间,HPLC测定纯度接近90%,表明收集液仍含有少量色素分子或其他杂质,仅通过这一步CM离子交换层析没有完全去除。部分色素分子的存在,不利于表达产物的结构鉴定,因此需要增加纯化步骤来提高人胰岛素前体的纯度。根据胰岛素前体在有机溶剂中相对稳定的特点,结合CM收集液的高盐特性和色素性质,选择反相层析来进一步提高纯度。图3.3所示为胰岛素前体CM收集液经制备级反相层析后的色谱图。上样后的CM收集液部分色素流穿(P1峰),经平衡洗涤后,又有部分杂质被去除(P2峰)。开始梯度洗脱后,目的产物被洗脱下来(P3峰)。最后用高浓度有机溶液再生反相柱,将少量结合牢固的杂质洗脱下来(P4峰)。图3.4为HPLC检测图谱。经反相层析后的目的蛋白溶液澄清透明,经HPLC检测纯度提高到96%以上。反相收集液旋蒸去除有机溶剂后,冻干得到胰岛素前体粉末,可用于后续的分析检测和做为胰岛素前体的标准品。

3.3.2毕赤酵母表达的胰岛素前体分子量测定

经过CM离子交换和C18反相层析的胰岛素前体冻干样品,委托上海生科院蛋白质组研究分析中心进行MALDI-TOF-MS检测。从测定结果(图3.5)可以看出,纯度超过96%的胰岛素前体,分子量并不均一,主要出现了四种不同分子量的产物。图3.5中左边第一个峰为分子量6385.05的产物,与胰岛素前体N木端少6个氨基酸理论分子量为6384.40的产物相一致,将该产物编号为“⊿N(1-6)IP”。第二个峰为分子量6511.34的产物,与胰岛素前体N末端

少5个氨基酸理论分子量为6513.52的产物相一致,将该产物编号为“⊿N(1-5)IP”。第三个峰为分子量6713.62的产物,与胰岛素前体N末端少3个氨基酸理论分子量为6713.71的产物相一致,将该产物编号“⊿N(1-3)IP”。第四个峰为分子量7042.78,与胰岛素前体N末端完整理论分子量为7043.07的产物相一致,将该产物编号为“IP”。各检测产物的结构和分子量的对应关系见表3.1。因此,根据对胰岛素前体的分子量测定结果和对应的结构分析,可以证明毕赤酵母表达的胰岛素前体的N末端结构不一致,存在着明显的不均一现象。

3.3.3毕赤酵母表达的胰岛素前体N末端测序

经过CM离子交换和C18反相层析的胰岛素前体冻干样品委托上海生科院蛋白质组研究分析中心采用Edman降解法对N末端15个氨基酸测序。表3.2为胰岛素前体N末端测序后经分析整理的检测结果。胰岛素的前体中至少含有两种不同产物，分别与⊿N(1-6)IP和⊿N(1-5)IP产物的N末端15个氨基酸序列相一致。通过对胰岛素前体N末端测序报告的分析还可以发现，仍存在其他不同的N末端序列，只是含量较低，因此较难解析出具体的N末端序列。根据对胰岛素前体N末端测序结果的分析，可以再次证明，利用毕赤酵母表达得到的胰岛素前体的N末端是不一致的，存在不均一性的现象,且该结果与质谱检测结果相一。

3.4讨论

毕赤酵母分泌表达外源蛋白时,都需要将目的蛋白融合在α交配因子引导肽的后面。在引导肽的C末端,设计有Arg-Lys两个碱性氨基酸组成的Kex2双氨基内肽酶的酶切位点(图3.1中Kex2箭头指示位置)。在Kex2内肽酶酶切位点的后面,引入了一段由10个氨基酸EEAEAEAEPK组成的间隔肽序列。间隔肽后是重组人单链胰岛素前体序列,包括人胰岛素B链(B1-B29)前29个氨基酸及人胰岛素A链(A1-A21) 21个氨基酸,两条链之间通过连接肽AAK将B

链的第29位LysineB29与A链的第一位GlycineA1相连。在引导肽的作用下,胰岛素前体可进行有效分泌、折叠和二硫键的正确配对。

在前言已介绍,间隔肽序列的存在可以提高Kex2双氨基内肽酶在引导肽C末端双碱性氨基酸处的酶切活性,减少未切除信息肽的融合蛋白的分泌,同时明显提高了目的蛋白的表达量。胰岛素前体工程菌的发酵已证实构建的菌株取得令人满意的表达量,胰岛素前体的分子量测定也没有发现含有信号肽的胰岛素前体融合蛋白产物,这充分说明引入的间隔肽起到了原先设定的作用。

本章研究证实,间隔肽的引入将导致发酵得到的重组胰岛素前体N末端氨基酸序列的不均一。推测这种不均一性产生的原因可能是分泌途径中另一个关键酶即二肽氨肽酶A(Stel3酶)的加工能力不足或(且)专一性不强所导致[90]。Stel3酶可以打开Glu-Ala序列中Ala的C端肽键,但由于较短的间隔肽中同时存有三个Stel3酶的酶切位点,而Stel3酶无法保证在同一酶切位点进行酶切,造成了胰岛素前体N末端序列的不均一性。在分子量测定中,除了发现含量相对较低保持完整间隔肽的产物外,应该还有三种在图2中所示Stel3理论酶切位点产物,但实验中仅发现在间隔肽N末端缺少3个氨基酸和5个氨基酸的两种产物,而没有N末端缺少7个氨基酸的产物。更让人意外的是,MALDI-TOF-MS实验表明,主产物分子量为6385.05,与酶切位点发生在间隔肽第六位谷氨酸羧基端的理论结果相一致,即酶切发生在EEAEAE↓AEPK中箭头所示位置,而非在Stel3酶最适的丙氨酸羧基端。推测在此位置发生酶切的原因是在多个EA重复序列存在的情况下,Stel3酶对酶切位点专一性识别能力下降,最终造成这种酶切产物的生成。

同时本研究还间接证实,在毕赤酵母分泌表达胰岛素前体过程中,末发生羧肽酶降解C末端氨基酸的情况。在毕赤酵母重組表达水蛭素HV2的发酵过程中,曾发现由于菌体死亡导致羧肽酶从细胞中释放出来,水蛭素的C末端出现了较为明显的降解现象,降解产物所占比例超过总产物的60%[91、92]。通过对胰岛素前体和水蛭素HV2的一级结构序列比对发现,胰岛素前体的一级结构中存在三对二硫键,其中一对二硫键正位于C末端倒数第二位的Cys上,而正是该二硫键的存在对于胰岛素前体的C末端降解起到了很好的阻碍作用,而水蛭素HV2因没有二硫键的阻碍作用因此生成的降解产物很多。胰岛素前体C末端的完整性对于利用毕赤酵母工业化生产胰岛素前体,并进一步将前体酶切转肽生成重组人胰岛素或酶切酰化生成地特胰岛素具有重要意义[66]。 3.5本章小结

本章中采用一步反相层析方法,将CM收集液中的胰岛素前体纯度从90%左右提高到96%以上。胰岛素前体纯度的提高对于制备胰岛素前体标准品,对其分子量测定、N末端分析和以后酶切转肽及酰化反应都有重要意义。

本章通过实验证实,利用毕赤酵母表达得到的胰岛素前体存在N末端不均一的现象,并间接证实了胰岛素前体在发酵过程没有发生C末端降解的发生。这些现象的发现为后续的工艺采取相应的措施,解决制备的重组人胰岛素或地特胰岛素N末端不均一性问题具有指导意义。

第4章 胰岛素前体酶切顺序分析及酶切

4.1前言

在上一章中,如图4.1所示,通过实验证实,毕赤酵母分泌表达得到的胰岛素前体其N末端是不一致的,存在明显的不均一现象,占最大比例的是N末端缺少6个间隔肽氨基酸的产物。显然这样的N末端不均一的产物,如果无法通过后期的加工保证N末端均一性,是难以做为药用前体来使用的。

从图4.1还可以看出,毕赤酵母直接分泌表达的N末端不均一的胰岛素前体是一个单链蛋白,其多肽链存在有三个胰蛋白酶的酶切位点,分别在Sitel (间隔肽的最后一个氨基酸赖氨酸的C末端)、Site2 (B链第29位氨基酸赖氨酸的C末端)和Site3 (连接肽最后一个氨基酸赖氨酸的C末端)。在利用胰蛋由酶进行酶切的时候,如果这三个位点都能被切开,就可以得到N末端均一的产物,即B链缺少第30位氨基酸(苏氨酸)的产物desB30。然后以desB30为前体,经转肽生成人胰岛素或酰化得到地特胰岛素[93]。

在对胰岛素前体的酶切实验中发现,在正常的酶切条件下酶切24 h,仍有部分酶切中间体没有转换成目的产物desB30。即使对酶切条件进行优化,如酶切温度、酶的用量及更换酶切体系,胰岛素前体仍不能全部转化。实验中还发现胰岛素前体三个酶切位点的酶切顺序并非随机发生而是存在一定的规你,因此对胰岛素前体的酶切规律进行探索,对酶切条件进行优化,都是值得研究的问题。本章通过对不同酶切时间所得到的产物进行HPLC分析和LC-MS检测,來探索胰岛素前体不能完全转化的原因及找到优化酶切条件的方法。

本章中,有一些称谓需要特别说明。单链胰岛素前体,指胰岛素前体经胰蛋白酶第一次酶切后得到的N末端均一的产物,英文为single-chain insulin precursor (single-chain IP)。双链胰岛素前体,指单链胰岛素再经胰蛋白酶一次酶切后,在连接肽AAK后断成双链的胰岛素前体,英文为 double-chain insulin precursor (double-chain IP)。 4.2实验材料和方法 4.2.1主要试剂

胰蛋白酶(Trypsin)购自Sigma,三羟甲基氨基甲烷(Tris)、二硫苏糖醇(DTT)购自Amresco, HPLC级乙腈、制备级乙腈和三氟乙酸(TFA)购自J&K Chemical,其他为国产分析纯试剂。 4.2.2胰岛素前体的酶切

实验样品为发酵胰岛素前体经CM-Sepharose FF离子交换层析和C18反相层析后得到的冻干粉末,详见第3章。 用50 mmol/L、pH 8.0的Tris缓冲液把胰岛素前体蛋白粉末配制成2.0 mg/ml的溶液。按胰蛋白酶与胰岛素前体为1:200 (W/W)的比例,加入胰蛋白酶,混匀。分别在酶切0.0 h(加酶混勻后立即取样)、0.25 h、0.5 h、 1.0 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h、8.0 h 和 24.0 h取样。不同酶切时间样品取样后,立刻加入2倍体积的1.0 mol/L乙酸终止酶反应,并标记酶切时间。

4.2.3双链胰岛素前体的反相制备及处理

样品:另取酶切l.0h大体积样品,加入两倍体积的1.0 mol/L乙酸终止酶反应。 所用设备及层析柱:同第3章3.2.3中胰岛素前体的反相制备层析。

层析方法:所用A相为0.1%TFA,B相为100%乙腈;流速20ml/min; 25% B相平衡反相柱至基线稳定;1.0 h酶切终止液经0.45 的微孔滤膜过滤后上样,25% B再平衡,线性梯度洗脱程序为0--20 min,25--50% (B),收集最大产物峰。收集液旋蒸去除有机相后,冻干得双链胰岛素前体蛋白粉末。

双链胰岛素前体样品用50 mmol/L (pH 8.0)的Tris溶液溶解,加入终浓度为20mmol/L的DTT进行还原处理,反应2.0 h。

4.2.4胰岛素前体酶切转化率检测

所用仪器及分析软件同第2章2.2.7.4中的胰岛素前体浓度测定方法。流动相A:0.1%TFA;流动相B: 0.1% TFA+100%乙腈;超声脱气20 min;进样量20 ul,流速1.0 ml/min;15% B平衡,线性梯度洗脱程序为0--20 min, 15~50% (B)。

酶切样品进行HPLC检测。酶切产物转化率为HPLC图谱中酶切产物峰面积/(未酶切胰岛素前体峰面积+各酶切产物峰面积之和)。

4.2.5胰岛素前体酶切样品LC-MS检测

4.2.2中酶切1.0 h终止反应样和双链胰岛素前体经DTT还原后的样品做LC-MS检测。为避免质谱检测时负离子峰过强,液相分析时B相不添加TFA, 其他液相条件同4.2.4。质谱操作条件见相应图谱说明。

4.2.6胰岛素前体和双链胰岛素的圆二色谱检测

胰岛素前体和双链胰岛素分别用50 mmol/L Tris (pH 8.0)和50 mmoI/L Tris (pH 8.0)+ 30%乙腈的溶液制成0.1 mg/ml的溶液,用英国Applied Photophysics公司的Chirascan圆二色谱仪检测。圆二色谱仪操作条件见图谱说明。 4.3结果与分析

4.3.1胰岛素前体的酶切顺序

对胰岛素前体不同酶切时间点的样品进行了 HPLC检测(图4.2 A-F)。在胰蛋白酶的作用下,酶切后产物的出峰时间与胰岛素前体明显不同,表明酶切产物的结构与胰岛素前体相比发生了改变。从不同酶切时间的HPLC图谱比较中可以看出,随着酶切时间的延长,在胰岛素前体的峰后依次出现几个不同的产物峰,根据产物的出峰时间和峰面积变化,结合胰岛素前体存在的三个酶切位点,初步判断酶切产物之间存在着明显的先后衍生关系。由此推断胰岛素前体三个胰蛋白酶的酶切位点并不是随机在某个位点酶切,而是首先在某一位点先切开,生成某一中间产物,这一中间产物随后又被进一步酶切生成另外一种中间产物,再经历最后一次酶切,生成酶切的最终产物。

在第3章中,我们已经发现,毕赤酵母表达得到的胰岛素前体是N末端不均一的产物,其中多是N末端缺少6个间隔肽的产物,分子量为6384.4。根据酶切过程中间体含量的变化情况,选择酶切1.0 h正处于酶切中间阶段(各酶切中间产物的含量都相对较高)的样品进行HPLC-MS分析,来测定各酶切产物的分子量。如图4.3所示,对总离子流图中的P1、P2和P3三个产物峰的分子量进行了精密计算。根据质谱的计算结果,这些产物的分子量依次分别为5959.1 Da、5977.6 Da和5707.2 Da,而这三种产物分别与完全切除间隔肽得到的单链胰岛素前体、单链前体再被酶切生成双链胰岛素前体和双链前体切除连接肽生成最终产物desB30的分子量相一致。

对不同酶切时间各酶切产物的峰面积进行统计计算,绘制了不同酶切时间各产物所占比例的分布图(图4.4)。胰岛素前体的三个酶切位点的酶切速率有明显的区别。酶切的第一步是在图4.1中Site 1位置酶切,即切除N末端剩余间隔肽的速度很快,不到0.5 h绝大部分胰岛素前体被酶切,得到切除间隔肽的单链胰岛素前体。若不设定0.25 h取样点,几乎看不到最初的胰岛素前体峰。同时部分单链前体又进一步在图4.1中Site 2或Site 3位置被酶切,生成双链前体。酶切第二步比第一步要慢一些,到酶切2 h时仍可以看到明显的单链胰岛素前体。酶切的第三步更慢,至酶切反应进行到4.0 h时,仍有近20%的双链胰岛素前体未能转换成最终产物desB30。即使酶切时间进一步延长至24h,desB30的收率也未见明显增加,目的产物desB30的最终酶切收率约为80%。

根据图4.2确定酶切的产物的生成顺序和图4.3确定的酶切产物的分子量,可以判定胰岛素前体第一步酶切发生在图4.1的Site 1位点,以很快的速度切除了剩余的间隔肽,生成单链胰岛素前体。第一步酶切完成后,下一步酶切是将单链胰岛素前体切成双链，酶切可能发生在图4.1中的Site2或Site3位点，在这两个位点酶切得到的都是分子量为5976.9Da的产物,仅通过产物的分子量无法判定第二步酶切发生在Site 2或Site3,或者在这两点同时发生酶切,必须通过进一步实验来证实。如果胰蛋白酶在Site 2和Site3处的酶切是随机的，那么酶切

得到的双链胰岛素前体在被还原打开二硫键后，LC-MS检测应该出现表4.1中的四个不同分子量的产物。如果在Site 2和Site 3位点之间存在先后酶切顺序,则得到的双链胰岛素前体经还原后,只能生成两种不同分子量的产物。

为确定第二次和第三次酶切位点的先后顺序,将胰岛素前体酶切1.0 h的样品用醋酸终止反应。利用C18半制备柱将该样品分离后,得到切除间隔肽且断成双链的胰岛素前体,即分子量 5977.6 Da的产物(图4.3的P2峰),纯度超过98%。将产物用DTT还原后进行LC-MS检测,图4.5为该产物还原后的LC-MS图。该双链胰岛素前体经 DTT还原后，仅生成两个明显产物峰,经计算分子量分别为3599.7 Da 和 2384.0Da。由表4.1可知,正好是单链胰岛素从She 3位置被酶切双链,然〗,被还原生成的两个产物。由此可以判定,第二次酶切反应发生在Site 3位点生成双链胰岛素前体，第三次酶切发生在Site 2位点,把AAK从双链胰岛素前体上切除得到desB30。

通过以上的实验证明,毕赤酵母表达的胰岛素前体,在胰蛋白酶的作用下,按照一定的顺序依次进行酶切图4.6。首先在Site I位点将剩余的间隔肽迅速去除,生成单链胰岛素前体。随后单链胰岛素在连接肽AAK的后面Site 3位点被进一步酶切,生成双链胰岛素前体。该双链产物在 Sitc3位点再经最后一次酶切,去除了连接肽,生成了重要的B链缺少第30位苏氨酸的胰岛素产物desB30。

4.3.2影响胰岛素前体切除连接肽的原因分析及对策

通过前面的研究,我们已经确定胰岛素前体在被胰蛋白酶酶切时,三个酶切位点之间存在着先后衍生关系。实验也发现,胰岛素前体在酶切生成最终产物desB30时,始终约有20%的双链胰岛素前体不能被有效切除连接肽AAK生成目的产物。在对温度、酶的用量和更换不同的缓冲体系(如NH4HCO3)等酶切条件进行优化后,酶切转化率始终未有明显的提高。为什么这部分前体分子的连接肽不能有效切除?探究其原因对于提高酶切转化率具有实际意义。

胰岛素分子是一个容易形成聚体的双链蛋白,商业化的胰岛素制剂也多数是以聚体的形式存在,除非胰岛素分子浓度在10-8mol/L以下才有可能以单体形式存在[94-96]。胰岛素前体在酵母中表达时,在高尔基体通过Kex2信号肽酶切除引导肽生成单链胰岛素前体时,便形成在结构上与胰岛素分子十分相近的聚体形式[44、97、98]。在发酵过程中,胰岛素前体在分泌途径中通过自身形成二聚体或多聚体降低分子浓度来增加前体产量[99]。由此可以认为,我们研

究的胰岛素前体在毕赤酵母分泌表达时,也是以二聚体或多聚体的形式來分泌到发酵液中的。在形成胰岛素二聚体时,B链第28位的脯氨酸与另一胰岛素分子的B20至B23的U形转角正好具有互补相互作用,使胰岛素前体分子与分子之间以反向平行的方式形成稳定、非共价键结合、β折叠的二聚体。若溶液中同时存在二价金属离子(如Zn2+)和苯酚,依靠静电、疏水相互作用、氧键和范德华力来维持相对稳定的二聚体构象,二聚体可进一步形成更为稳定的六聚体或多聚体[100、101]。

从上述的胰岛素聚体结构分析,我们据此推断,利用毕赤酵母表达得到的胰岛素前体在酶切的环境中依然以聚体的形式存在。由于第一步酶切位点(Site 1)靠近胰岛素前体的N末端,这是一段自由度很大的肽段,胰蛋白酶很容易识别和结合,酶切的速率很快。第二步酶切位点(Site3)处于聚体的边缘,空间位阻对胰蛋白酶识别和结合酶切位点造成了一定的影响,这步的酶切速率与第一步酶切相比明显慢了很多。第三步的酶切位点(Site 2)正处于两个胰岛素前体形成的反向β折叠内部,再加上B22位精氨酸上的胍基能与A21位天冬酰胺上的羧基形成一对离子键,还有B28位脯氨酸本身的环状侧链,空间位阻效应使得胰蛋白酶要进入到聚体的内部來识别和结合酶切位点來发挥作用变得更加困难,因此第三次的酶切速率更慢。

虽然胰岛素前体很容易形成聚体,但在改变溶液的环境,如pH、疏水性等条件后,胰岛素前体分子间的作用力减弱,溶液中的聚体含量会明显降低。将胰岛素前体溶液pH值调至低于2或超过9,胰岛素前体分子因自身电荷的相互排斥作用,较难形成聚体,但这样的环境却不是胰蛋白酶酶切的最佳条件,也不利于胰岛素前体的稳定,不宜进行胰岛素前体的酶切[102]。若在溶液中添加适当浓度的有机溶剂来降低溶液的极性,增加溶液的疏水性,则是降低胰岛素前体生成二聚体或多聚体的较好方法之一。胰岛素前体是一种小分子蛋白,能够耐受一定浓度的有机溶剂。胰蛋白酶性质相对稳定,在低浓度的有机相中,酶切活性不会受到明显影响[103、104]。因此,如果在酶切的反应液中添加适量浓度的有机溶剂來抑制胰岛素前体及其酶切产物生成二聚体或多聚体,将有利于酶切反应的顺利进行。

为进一步证实这种推测,采用园二色谱的方法来测定胰岛素前体和双链胰岛素前体在含有部分有机溶剂和不含有机溶剂溶液的环境中二级结构的变化情况。构象的变化反映了这两种蛋白二级结构的变化。图4.7为胰岛素前体和双链胰岛素前体分别用50mmol/L Tris (pH 8.0)和 50 mmol/L Tris (pH 8.0) + 30%乙腈制成 0.1 mg/ml 的溶液,然后进行圆二色谱检测的对比图。胰岛素前体和双链胰岛素前体蛋白在这两种不同的溶液中都发生了明显的变化,双链胰岛素前体的变化更为明显。利用CDNN软件来分别计算这两种蛋白在水溶液和含有部分有机溶液的反向β折叠含量变化情况,胰岛素前体的反向β折叠含量由6.3%下降到3.8%,双链胰岛素前体由8.7%下降到2.6%。反向β折叠结构的存在是胰岛素前体聚体存在的主要标志,其含量的降低表明溶液中的聚体含量也有一定程度的下降[99]。乙腈的存在是这两种溶液最大的区别,也正是由于乙腈的作用才导致这种变化,才显著降低了这两种多肽的聚体在溶液中的浓度。

那么聚体含量的降低是否进一步有助于提高酶切转换率呢? 用 50 mmol/L Tris (pH8.0)和50 mmol/L Tris (pH 8.0) + 30%乙腈的溶液将胰岛素前体分别配制成3.0 mg/ml溶液,按胰蛋白酶与前体之比为1:200的比例加入胰蛋白酶酶切4.0 h,用2倍体积的1.0mol/L乙酸终止反应,HPLC检测酶切转换率。图4.8为胰岛素前体在酶切前和两种不同溶液中酶切图谱。在水相中前体酶切转换率为76%, 而在低浓度的有机相中酶切转换率提高到95.6%,比在水相溶液中的酶切高出近20%。由此证明,在乙腈存在的情况下有效降低了胰岛素前体聚体浓度，而聚体的减少使得胰蛋白酶更容易发挥作用，有助于酶切转换率的提高。

4.4本章小结

毕赤酵母表达的胰岛素前体是一种N末端不均一性单链蛋白。将该胰岛素前体转化成重组人胰岛素或其类似物时,若不能很好解次N末端不均一性的问题,则得到的产品难以作为药用蛋白来使用。巧妙的是，间隔肽序列EEAEAEAEPK末端正好设计了一个胰蛋白酶的酶切位点,在胰岛素前体被胰蛋白酶酶切时,N末端剩余的间隔肽和连接肽AAK 一起,可以被胰蛋白酶有效去除,生成了 B链缺少第30位苏氨酸的产物desB30。这种产物可以进一步通过转肽反应生成重组人胰岛素或通过酰化反应生成地特胰岛素。

通过对胰岛素前体不同时间点酶切样品的HPLC和质谱分析,发现胰岛素前体的三个酶切位点在酶切时存在着明显的先后衍生关系。胰蛋白酶首先将剩余的间隔肽迅速去除,生成单链胰岛素前体。随后，单链胰岛素在连接肽AAK的后面被进一步酶切,生成双链胰岛素前体。最后,该双链产物再经一次酶切去除连接肽, 生成了 B链缺少第30位苏氨酸的产物desB30。这三步的酶切速率差别很大,第一步酶切速率很快,第二步相对较慢,第三步酶切即使酶切时间达到24 h仍有近20%的双链胰岛素前体没有转变为desB30。根据胰岛素的立体结构和容易生成聚体的特点,对造成这种酶切顺序和不同酶切速率的原因进行了分析,初步认定胰岛素前体形成聚体的空间立体结构是造成酶切速率差异的主要原因。在含有30%的乙腈溶液中,降低溶液的极性,增加溶液的疏水性,圆二色谱检测证实明显降低了胰岛素前体聚体的含量,在此环境下进行胰岛素前体酶切,desB30收率提高了近20个百分点。

第5章膜岛素前体的转n

5.1前言

在第1章中我们已了解到,人胰岛素的生产有多种方法,包括从猪、牛等提取的动物胰岛素半合成转化成人胰岛素,或者利用重组微生物表达得到的胰岛素前体经转肽反应生成人胰岛素。这两种生产方法都涉及到一个重要的化学反应,即转肽反应,也叫做肽键的酶促合成反应。转肽反应是利用蛋白水解酶的逆转反应所进行的肽键合成,对某个位置的氨基酸或者小肽段进行转换,得到所需要的目的产物[105,106]。实验证明,许多蛋白水解酶,如胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等,在一定的条件下都可以催化转肽反应[107、108]。

在动力学上,转肽反应属于一级反应。要提高转肽反应的收率,可采取的措施包括提高反应物的浓度,降低产物的浓度,选择合适pH和缓冲液等[109]。另外,还可以通过加入有机溶剂,如正丁醇、1,4-丁二醇或二甲胺等,來降低水的浓度和增加反应物的溶解度,提高反应物羧基的pK值来提高转肽收率。尽管酶促转肽合成反应是水解反应的逆反应,但多数情况下它和水解反应的最适条件相差较大。进行转肽反应的酶除了具有较强的专一性外,还应具有较好的稳定性和较高的纯度。转肽反应的酶浓度虽然不导致合成反应的平衡常数的变化,但提高酶浓度可以增加反应速率,缩短反应时间。转肽反应多在含有较高浓度有机溶剂的水溶液中进行,蛋白酶的活性和稳定性会受到一定的影响,需要较高浓度的酶来保持其活性的持续发挥[110]。整体而言,影响转肽反应收率的各种因素和条件又随着反应物的不同而改变,对于每一个转肽反应,都要寻找对应的最适反应条件。酶促合成也经常伴随着一些副反应,如多位点水解和连续转肽合成生成新的副产物,蛋白酶自溶产生的小肽也会参与到转肽反应中去,引起更多的副反应。这些都给后续的分离纯化带來不利影响。

在前面两章的实验中已证实,利用毕赤酵母分泌表达的胰岛素前体是N末端不均一的单链蛋白,在胰蛋白酶的作用下经过三次酶切,生成B链缺少第30位苏氨酸的缺苏胰岛素desB30[111、112]。缺苏胰岛素已被证实是具有与人胰岛素或猪胰岛素几乎相同生物活性的胰岛素类似物[113、114]。尽管desB30具有较好的生理活性,但与人胰岛素相比,在药代和药效方面没有明显的优势。虽然desB30制备工艺相对简单,但一直未能作为药用蛋白获得上市许可,必须通过特定的转肽反应生成人胰岛素才具备药用价值[115-117]。

目前已报道的文献中,利用毕赤酵母表达的单链胰岛素前体生成人胰岛素醋的转肽反应多数是在含有较高浓度有机溶剂的水溶液中一步完成的[54、118-121]。虽然利用一步转肽的方法简化了操作步骤,但为得到较高的转化率,价格昂贵的叔丁醚苏氨酸叔丁酯与胰岛素前体的摩尔比要接近或超过100。另外在含有较高浓度有机溶剂的反应中,胰蛋由酶的活性不能长久保持,所以转肽反应中的胰蛋白酶与前体的质量比为1:5。因此在一步法转肽反应过程中, 叔丁醚苏氨酸叔丁酯和胰蛋白酶用量很大,生产成本较高。另一方面,虽然一步法将酶切和偶联两个反应放在一个体系进行,但总体生成速率并不高,获得相对较高的转化率通常需要12 h以上[45、122、123]。反应时间越长,副产物就会越多,增加下游纯化的负担,纯化收率也会降低。因此一步法完成的转肽反应不是最佳的生产工艺,需要通过优化进一步降低成本。

虽然一步进行的转肽反应可以直接得到目的产物胰岛素酯,但整个过程实际上包括两个反应。第一个反应是酶切反应,胰蛋白酶在胰岛素前体的三个位点进行三次酶切,生成desB30。第二个反应是偶联反应,生成的desB30仍在胰蛋白酶的作用下,在B29赖氨酸的C末端偶联接入一个叔丁醚苏氨酸叔丁酯,生成重组人胰岛素酯。这两步反应虽然可以在同一条件进行,但其最佳反应条件却相差较大。胰蛋白酶进行的酶切反应最佳条件为pH8.0左右的弱碱性的水溶液或含有低浓度有机溶剂的水溶液环境,而偶联反应的最佳条件却是PH6.5附近的含有高浓度有机溶剂的水溶液环境。由于偶联反应在酶切的条件下很难进行,所以结合在一起的一步反应条件显然适于偶联反应却不利于胰岛素

前体酶切。胰岛素前体生成desB30需要三次酶切反应,所以在一步法转肽的条件下,胰岛素前体的酶切转化率不高,导致一步转肽的整体反应速率较低,胰岛素前体转化率不高,不适于工业化生产。

本章以纯化后的胰岛素前体为起始原料,分别用一步法转肽和先酶切再偶联的两步法转肽来制备胰岛素酯,比较胰岛素酯的收率和成本。采用先酶切再偶联的两步法转肽与一步法相比,胰岛素前体的转化率有了显著提高,反应时间大幅缩短,副产物少,成本较低,这为利用毕赤酵母表达规模化生产重组人胰岛素提供了一种简捷高效的方法。 5.2实验材料和方法 5.2.1主要试剂

胰蛋白酶(Trypsin)和叔丁醚苏氨酸叔丁酯(Thr(tBu)-OtBu)购自Sigma,三羟甲基氨

基甲烷(Tris)和二甲基亚砜(DMSO)购自Amresco, HPLC级乙腈和三氟乙酸(TFA)购自J&K Chemical,胰岛素标准品(rh-Insulin standard)购自中国食品药品检定研究院,其他为国产分析纯试剂。 5.2.2胰岛素前体的一步法转肽

样品为胰岛素前体经CM-Sepharose FF离子交换层析和C18反相层析后得到的冻干粉末,详见第2章2.2.6和第3章的3.2.3。

在一步法转肽过程中,先称取摩尔比为1:100的胰岛素前体蛋白冻干粉和叔丁醚苏氨酸叔丁酯,用二甲基亚砜完全溶解,再依次加入1,4-丁二醇,0.5 mol/L (pH6.5) Tris缓冲液,其中DMSO、0.5 mol/L Tris (pH6.5)、1,4-丁二醇的体积比为15:15:70,胰岛素前体的终浓度为5 mmol/L。最后加入胰蛋白酶,胰蛋白酶与胰岛素前体的质量比1:5,25℃搅拌反应。0h (所有反应物全部加入混匀后立即取样)、1 h、2h、4h、10 h、20 h和24 h分别取样,立即用1.0 mol/L乙酸稀释30倍终止转肽反应。HPLC检测IP不同转肽时间的转化率。 5.2.3胰岛素前体的两步法转肽

酶切过程:胰岛素前体经C18反相制备层析(详见第3章的3.2.3)后,在C18反相层析后的收集液中加入Tris至终浓度为50 mmol/L,调节pH为8.0,按胰蛋白酶与前体之比为1:200的比例加入胰蛋白酶酶切3.0 h。酶切反应结束,35℃旋蒸去除乙腈。用1.0mol/L的HAc调节不同pH,分别取样后4℃静置10 h。沉淀悬液在10000g和4℃下离心30 min, HPLC检测上清中desB30残余量。选择最适pH值,大量酶切制备desB30蛋白,冻干得蛋白desB30粉末。

偶联过程:用desB30蛋白代替胰岛素前体蛋白,控制desB30蛋白在溶液中的终浓度为5mmol/L,其他条件同一步法转肽。25℃下搅拌反应。0 h (所有反应物全部加入混匀后立即取样)、0.5 h、1 h、2 h和3 h分别取样,并立即用1.0 mol/L HAc稀释30倍终止转肽反应。

偶联反应配方优化:保持desB30蛋白在溶液中的终浓度为5mmol/L,分别取摩尔比为1:100、1:50和1:25的desB30蛋白冻干粉和叔丁醚苏氨酸叔丁酯,胰蛋白酶与desB30质量比分别为1:5、1:10、1:20和1:40,其他条件同前,进行desB30偶联反应。

5.2.4转肽产物的纯化、去保护及鉴定

胰岛素酯纯化:两步法转肽反应产物用加入3倍体积的1.0 mol/L HAc终止反应,用0.45 um微孔滤膜过滤,上样反相半制备柱纯化。所用设备及层析柱及层析方法同第4章4.2.3。收集最大洗脱峰。收集液旋蒸去除有机物后,冻干得胰岛素酯粉末。

胰岛素酯去保护:按每mg胰岛素酯加入50ul TFA的比例进行脱酯反应。为避免生成的人胰岛素降解和脱氨,每mg胰岛素酯脱保护时分别加入0.05 mg L-谷氨酰胺和L-色氨酸。脱酯后的人胰岛素按上法再次进行反相纯化,收集最大主峰,旋蒸去除乙腈后,等电点沉淀、离心和冻干得到生成重组人胰岛素,-20℃长期保存。

纯化制备的人胰岛素酯、人胰岛素和人胰岛素标准品,用10 mmol/L的HCl溶解,配制成l.0mg/ml溶液用于HPLC分析。制备的人胰岛素样品和人胰岛素标准品,用10mmol/L HCl溶解,配制成0.1 mg/ml溶液用于ESI-MS和圆二色谱分析。

5.2.5 IP和desB30的转化率及胰岛素纯度检测

所用仪器及分析软件同第2章2.2.7.4中的胰岛素前体浓度测定方法。流动相A:0.1%TFA;流动相B: 0.1% TFA+100%乙腈;超声脱气20 min;进样量20ul,流速1.0 ml/min;20% B平衡,线性梯度洗脱程序为0-20 min, 20-50% (B)。

IP转化率为HPLC图谱中胰岛素酯的峰面积/(胰岛素前体峰面积+各酶切中间产物峰面积+胰岛素酯的峰面积)。desB30转化率为HPLC图谱中胰岛素酯的峰面积/(desB30峰面积+胰岛素酯的峰面积)。 5.3结果与分析

5.3.1胰岛素前体的一步法转肽

利用HPLC法可直接对一步法的转肽反应产物进行分析并计算转化率。图5.1所示为胰岛素前体一步法转肽生成胰岛素酯的不同反应时间的HPLC图谱。从图中可以看出,转肽反应速率很低,反应1 h、2h、4 h的图与反应10 h

图谱基本相同,没有重复列出。胰岛素前体(P1峰)先经过一步酶切,生成去除间隔肽的单链胰岛素前体(P2峰),然后应再经两次酶切生成desB30 (未发现有明显的该产物峰),最后经转肽生成胰岛素酯(P3峰),整个反应过程速率很低。图5.1中各产物峰通过LC-MS结果来确定。当反应进行到10 h时,仅有不到30%的胰岛素前体被转肽生成胰岛素酯。转肽反应进行到20 h时,转化率达到最高,但也只有43.9%。转肽反应进行到24 h吋,副产物有所增加,转化率下降到42.1%。反应时间越长,反应副产物的比例有上升的趋势。

通过图5.1与第4章图4.2的比较可以发现,在一步法转肽反应的环境中,虽然胰蛋白酶的浓度很高,但胰岛素前体的酶切效率却降低。图5.1的P2峰为切除间隔肽的单链胰岛素,这个反应在图4.2的酶切中不到0.5 h就基本完成,而这个反应体系中即使进行到24 h仍发现有明显的胰岛素前体存在,这说明酶切反应的效率被大大降低。后两步的酶切反应由于酶切速率更慢,没有发现有明显的双链胰岛素前体和desB30产物峰。相对于酶切反应,该条件更适合于偶联反应。由于偶联速率较高,生成的desB30很快转换成最终的产物胰岛素酯(P3峰)。由此说明,在一步法反应条件下,胰岛素前体的酶切过程成为整个反应的限速步骤,是造成整个体系反应慢的主要原因。一步法进行的转肽反应,实际上选择的是一个更适合于偶联反应的条件,酶切反应虽然可以进行,但是效率很低。但若选择在适于酶切的水相条件,则偶联反应基本上不会发生,即使发生效率也会很低。在一个系统里同时进行这两个反应,为保证整体的转化率,只能首先保证条件更为苟刻的偶联反应的要求。

为进一步证实一步法转肽的各产物成分和反应时间延长副产物增多的现象,将一步法转肽反应延长至48 h,取样进行LC-MS分析(图5.2)。随着反应的延长,反应体系的副产物明显增加,在B22(Arg)处发生了明显的非目的酶切反应,生成了脱八肽人胰岛素(DOI,P2峰),且生成的DOI被进一步转肽生成脱八肽人胰岛素酯(DOI-T,P4峰),这个副产物成为反应体系最主要的成分,而转肽目的产物人胰岛素酯(desB30-T,P5峰)的含量明显降低。在长时间转肽反应中,还发现胰岛素前体链间二硫键被打开,B链在B22(Arg)处被酶切生成了产物B1-21 (P7峰)和B23-29 (P1峰),B23-29被进一步转肽生成产物B23-29-T (P6峰)。这些副产物通过LC-MS的检测分析都可以确认。表5.1为胰岛素前体一步法转肽48 h后利用LC-MS确认的产物一级结构与分子量对应数据。

另外,由于一步法转肽反应时胰蛋白酶浓度较高,在长时间的反应过程中,很难避免有部分胰酶发生自切反应,生成的产物也可能参与到转肽反应中去。因此,LC-MS图谱中还有不少产物峰,不能确定它们的结构。通过本实验可以确定,一步法转肽反应尽管总体转肽速率较慢且转化率不高,却不能依靠延长反应时间來提高转化率。这是一个不解的难题。

5.3.2胰岛素前体的两步法转肽

胰岛素前体两步法转肽的过程是将原來一步完成但效率相对较低的的反应拆成两个独立的过程来完成,酶切反应和偶联反应都在其最适合条件下进行。第一步反应是先将胰岛素前体酶切生成desB30,第二步反应是将desB30偶联叔丁醚苏氨酸叔丁酯生成胰岛素酯。

在第4章中,实验证实胰岛素前体在水溶液中酶切时,始终有近20%的双链胰岛素前体不能有效切除连接肽AAK而转化为desB30。在酶切反应液加入30%乙腈,胰岛素前体的酶切转化率提高了近20%。在胰岛素前体的反相纯化过程中,胰岛素前体正好在含有30%乙腈附近的浓度时被洗脱下来,因此我们尝试了在C18反相层析后的收获液中直接酶切的工艺。结果表明,在反相收集液中直接酶切,胰岛素前体的酶切转化率超过95%, 且未发现B22(Arg)处酶切生成DOI的现象。

由于胰岛素前体N末端的不均一性,切除剩余的间隔肽后主要生成四种不同的小肽,可以用生物软件来计算它们

的等电点[124]。这些小肽的理论等电点分别为PI6.05(AEPK)、pI4.53 (EAEPK)、pI4.25 (EAEAEPK)和 pI3.98 (EEAEAEAEPK)。切除的连接肽AAK的理论等电点为pI8.8,胰蛋白酶的等电点为pI10.5,目的产物desB30理论等电点为pI 5.39。考虑到酶切后的目的产物desB30在酶切反应液中的含量很高,与其他蛋白质的理论等电点都有一定的差别,选择合适的pH值可以用等电沉淀的方法将desB30从溶液分离出来,同时可以去除大部分的间隔肽、连接肽和胰蛋白酶。在一步法转肽反应中,这些因酶切产生的中间副产物仍存在于反应体系当中,会产生更多的偶联副产物。显然纯度更高的desB30更有利于偶联反应向生成目的产物的方向进行。

胰岛素前体纯化的反相收集液中含有约30%乙腈。乙腈的存在虽然降低了胰岛素前体的聚体含量提高前体的酶切转换率,但乙腈的存在也增加了各种酶切产物的溶解度,在等电点时难以将目的蛋白desB30充分沉淀出來。胰岛素及其类似物属于小分子多肽,具有较好的物理和化学稳定性[102、125]。因此可以采用35℃旋蒸的方法去除溶液中的乙腈。去除乙腈的酶切溶液用1.0mol/L HAc调节不同pH寻求最佳的沉淀等电点。图5.3为desB30在不同pH值等电点沉淀后离心上清中的残余量。在pH5.3(与理论等电点基本一致)时,沉淀上清中的desB30的含量降至最低,为酶切反应结束时溶液中含量的6.3%,绝大部分的目的蛋白形成沉淀。离心得到的蛋白沉淀物,短时间冻干便可得到desB30冻干粉,用于下步的偶联反应。

图5.4为反相收集液中酶切沉淀后得到的desB30样品ESI-MS图谱。经计算产物分子量为5707.8,与desB30的理论分子量相一致,说明在含有乙腈反相收集液中进行酶切,不但可以将不均一的N末端剩余的空间肽序列全部切除,而且可以较充分地去除连接肽。在酶切过程中未检测到ArginineB22位点酶切产物。

利用desB30与叔丁醚苏氨酸叔丁酯直接进行偶联反应,desB30的转化率明显提升。如图5.5所示,与胰岛素前体的直接转肽相比,desB30偶联速率大大加快。当偶联反应进行0.5 h时,有近一半的desB30被迅速偶联生成胰岛素酯。当偶联反应进行到2.0h时,desB30的转化率达到最高为84.2%。偶联反应进行到3.0 h时,因有少量副产物生成,转化率降低到75.9%。在利用胰岛素前体一步法直接转肽时,即使转肽反应进行到20 h,转化率最高也仅有43.9%。

desB30偶联反应速率很快,为了节省成本,对偶联反应的配方进行了调整，降低了叔丁醚苏氨酸叔丁酯和胰蛋白酶的用量。如表5.2所示，在反应时间仍为2.0h，叔丁醚苏氨酸叔丁酯用量仅为胰岛素前体直接酶切转肽用量一半的条件下，desB30偶联反应的转化率基本保持不变。在此基础上，适当降低胰蛋白酶用量，当胰蛋白酶用量仅为原反应用量的四分之一时，desB30偶联反应的转化率仅比原反应下降了1.9%。 5.3.3 两步法制备的重组人胰岛素质量分析

经两步法转肽得到的人胰岛素溶液,用1.0 mol/L Hac终止反应，反相纯化得到胰岛素酯。经ESI-MS测定计算分子量为5924.6(图5.6A)，与理论分子量一致。胰岛素酯用TFA脱酯去保护，脱酯收率达到98%以上。脱酯纯化后得到的重组人胰岛素，ESI-MS测定分量为5808.3 (图5.6 B),与人胰岛素理论分子量5807.7相一致。

将两步法制备得到的人胰岛素与重组人胰岛素标准品在相同条件下进行HPLC检测,两个样品的出峰时间相同,制备得到的人胰岛素样品纯度达到98%(图 5.7B),初步表明两种样品为同一种物质(图5.7)。

将两步法制备得到的人胰岛素与人胰岛素标准品配制成相同浓度的溶液,采用圆二色谱方法比较两种样品的二级结构(图 5.8)。两步法制备得到的人胰岛素与人胰岛素标准品在不同波长扫描下的曲线几乎完全一致，说明两步法制备得到的人胰岛素没有改变其构象,适合于将来的工业化生产。

通过对两步法制备的人胰岛素和胰岛素标准品在分子量、HPLC和圆二色谱分析中可以得出，用两步法制得的人胰岛素和重组人胰岛素标准品具有相同的性质和结构,两步法转肽反应在工艺上是合理可行的。 5.3.4胰岛素前体一步法与两步法转肽的工艺比较

两步法转肽制备重组人胰岛素酯与一步法转肽相比,虽然在操作上从一个过程变成二个过程,但在生产成本上却具有明显优势。从表5.2中可以看出,两步法进行的酶切与偶联,虽然两个过程都使用了胰蛋白酶,但胰蛋白酶的总用量仅为一步法的四分之一, 叔丁醚苏氨酸叔丁酯用量仅为一步法的一半。将胰岛素前体转换为人胰岛素酯,这两种试剂最重要,成本最高。两步法大幅度减少了这两种试剂的用量,生产成本将明显降低。同时,两步法的酶切与偶联的总的转化率比一步法的43.9%提高到73.7%,提高幅度超过60%,这对于生产的经济性更有价值。另外值得关注的是,胰岛素前体一步法转肽时,达到最高的转肽收率时反应时间长达20 h,反应结束时有明显的副产物生成,这既降低了整体的转化率,也增加了后续纯化的负担。两步法中desB30的偶联速率非常快,2 h就可以达到最高的转化率,此时反应副产物基本没有出现,后续的分离纯化操作将变得相对简单。

偶联反应得到的胰岛素酯和脱酯反应后的人胰岛素样品中副产物少,目的产物纯度较高,反相纯化时得率可达以90%以上,初步计算从胰岛素前体得到人胰岛素的总得率可达60%。由于反相层析对设备的要求高,流动相成本高,这给工业放大带来很大的成本压力,因此这方面的工艺优化还有大量的工作要做。

5.4本章小结

胰蛋白酶作用下的酶切与偶联反应,实际上是一对可逆反应,酶切为肽键的断裂,偶联为肽键的形成。然而,这一对可逆反应,各自的最佳反应条件却相差很大。胰蛋白酶作用下,酶切反应的最适pH在8.0附近,水溶液或含有低浓度有机溶剂的水溶液有利于反应进行,酶切转化率可达95%以上;偶联反应的最适pH在6.5左右,含有高浓度的有机溶剂的水溶液环境更有利于反应进行。因此,在一步法转肽反应中,选择的是更适合肽键生成的偶联反应环境,这不利于蛋白质的酶切反应。

利用毕赤酵母分泌表达的胰岛素前体是一个在N末端有间隔肽的单链蛋白。胰岛素前体采用一步法转肽生成人胰岛素酯时,该前体需要经过三次酶切才能生成desB30,然后偶联叔丁醚苏氨酸叔丁酯生成重组人胰岛素酯。由于酶切转化率的不高,导致desB30生成很慢,影响了最终的转化率。同时由于整体的反应速度很慢,副产物生成较多,不利于后续的纯化。

胰岛素前体的转肽反应是重组人胰岛素生产工艺中的关键步骤,该步骤的收率和成本对重组人胰岛素的生产成本起着决定性的作用。本研究将酶切和偶联两个过程分开,釆用了两步法转肽代替现有的一步法转肽将人胰岛素前体转化成人胰岛素酯。两个反应分别在各自的最佳条件下进行,转化率有了大幅度提高。在第4章中证实胰岛素前体及酶切中间体聚体的存在是胰岛素前体酶切转化率无法进一步提高的原因,而低浓度的乙腈溶液可以降低聚体的浓度。由此结合胰岛素前体的纯化工艺,我们建立了 一种直接在胰岛素前体的反相收集液加入Tris和胰蛋白酶后直接酶切的方法。该方法不但解决了酶切转化率不高的问题,而且利用等电沉淀提高了 desB30纯度,简化了操作工艺,同时未发现ArginineB22位点酶切产生的非目的产物。直接利用desB30进行偶联反应,整体的转化率比一步法提高60%,反应时间缩短为原來的十分之一, 叔丁醚苏氨酸叔丁酯用量减少一半,胰蛋白酶的用量减少四分之三,副产物少,总收率更高,成本更低。这为利用毕赤酵母表达规模化生产重组人胰岛素提供了一种更为简捷高效的方法。

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