pfu问题集

今天用taq酶将我的目的基因扩出来了，但是相同条件用pfu却没扩出来。目的片段长度1。4kb，pcr程序是， 94℃ 5min 94℃30sec 50℃30sec 72℃1min30sec 30个循环 72℃10min

请问该如何改进才能适合pfu的扩增？

可能含有uracil污染，uracil会抑制pfu的活性，你可以加用dUTPase试试，或者100倍稀释模板试试

见笑，uracil是什么啊？模板浓度高也会影响pfu的活性吗？

uracil是脱氧尿嘧啶。会干扰高保真酶的3’－5’外切酶的活性，稀释模板的目的是为了稀释其中高保真酶抑制剂的浓度

另外taq酶的延伸时间可以按1kb/min，pfu呢？另外，退火温度是不是和taq酶的有所不同啊？

pfu比taq的力量稍弱。 可试：

1. 0.25单位的pfu，在25ul中。

2. 减少在94℃ 中的时间；降低延链的温度为68℃ 。 94℃ 3min 94℃ 15 sec 50℃ 15 sec 68℃ 1 min 30 sec 35 个循环 68℃ 5 min

延伸时间可能不够吧，有说法，PFU的延伸速率是600bp/min,我 扩2KB片段，要延伸时间4分钟才能出条带。2分钟以下都是非特异的扩增。

Pfu酶在扩增２kb以下的DNA片段和Taq没有多大差别。 但不同公司的酶，或运输保存的差异等，会出现酶效力的变化。 我用它扩1.7kb的，12.5ul2分钟35周期，挺好的。

pfu的特点 1）保真度最高

2）合成速度最慢，600bp/秒，可据此设计延伸时间

3）扩增片段不长，一般不要超过2kb，如果你要扩的超过2k，建议换酶或分段

4）退火好象没什么特别的

此外，PCR不成功的原因很多，引物有时更重要

可以用混合酶，20:1 普通酶和PFU酶。 缓冲液直接用pfu的。

pfu的缓冲buffer与一般的Tag酶是不一样的（主要是盐浓度不一样），查查说明书比较一下就知道了。在普通Tag酶的退火温度的基础上提高5度以上，就可以了。 试试吧，如果成功的话，别忘了给我回一个帖子。

Pfu的效率最低的，想方便的话，用TAKARA的LA taq 酶，想省钱的在PFU里加点普通Taq酶

用RT-PCR产物作为模板？大概是用RT的产物作为模板吧。 首先检查一下buffer有没有问题，Pfu有专用的buffer。

大于2kb的片段最好不要用Pfu扩增，Pfu扩增长片段不灵。可以用Taq plus(Taq和Pfu的混合物，也很便宜)扩增较长的片段，既兼顾了保真性和扩增效率而且可以用T载体克隆目的片段。

你可以用Clontech公司的Advantage cDNA 聚合酶复合物（Advantage? cDNA PCR Kit & Polymerase Mix），它具有高效率、高度真实性及能有效扩增长片段DNA等特点，且可以直接作T-A 克隆。

要注意4点

1.PFU的TM值要比Taq酶低1到2度。 2.酶的量要为Taq酶的2到3倍。 3.延伸时间稍稍延长。 4.采用热启动的方式。

理由如下：PFU的扩增效率较低所以要加大酶的量和延长延伸时间，又由于PFU具有3'-5'的外切酶活性，而这种活性在单链情况下依然有效，所以很有可能将引物切短从而在正常复性温度下不能与模板结合，但是在延伸温度下PFU的延伸效率大于外切效率，故采用hotsart的方式可以有效避免此现象产生！！

酶活性不太好了吧？Pfu酶扩增效率本来就比Taq酶低 试试提高Mg离子浓度是一种方法 再不行，该换一支酶了

按你的体系再适当增加mg++的量，同时延长循环次数比如35次。

pfu最重要的优点就是保真度高，相对普通taq酶而言在扩增效率上没有什么优势，对PCR反应体系及扩增条件要求较高。对于扩增2kb DNA来说，我认为可以不用pfu，宝公司的LA具有3‘外切活性，有一定保真度。以前我做RT-PCR扩增3kb片段，开始用EX，死活扩不出来，换了LA以后，同样的条件，一把就出来了，经过大量测序证明，2-3kb根本就没什么变异。如果模板质量不好或者量很少的话，LA还是很有优势的。

我要扩增2kb的DNA，买了鼎国的高纯度pfu（μ/μl）。想请教有没有那位大侠用过，采用什么样的体系比较好呢？谢谢。

pfu就是高保真性DNA聚合酶，使用上与一般Taq酶没有多大区别。

我没用过鼎国的pfu酶，但是用过promega的，觉得它的专一性还可以，但是扩增产物浓度不高。体系如下： 10Xbuffer 5ul

dDTP（各2.5mM） 4ul 引物1（10um） 2ul 引物2（10um） 2ul

模板DNA（100-300ng/ul） 1ul pfu 0.25ul 加水至 50ul

用taq plus 大概比例是 taq/pfu=4:1

当taq＋pfu酶 混合成taq plus 酶 时 用的taq：pfu 的比例通常为10：1。

TAKARA

pyrobest 保真性相当于pfu,扩增4-5kb

LA taq，保真性高于Taq,低于pyrobest,扩增10kb 扩增能力是我们验证过的，保真性也没出过问题 这些酶比其他进口酶便宜

pyrobest扩增3kb没扩出来

LA Taq保真性实在是太差，最近扩1-3kb的东西都出现错误，做表达实在是勉强

pyrobest 我们还没有测到过突变，曾经成功扩增4-5kb ，但也有2-3kb扩增失败的例子，但这种酶的产量和扩增能力确实不错。影响PCR的因素很多，长片段扩增对反应条件要求更苛刻。 LA taq扩增的东西我们没有测过序，但这种酶的产量和特异性不错。

1） pfu，保真性最高的高温聚合酶，产量低，扩增片段小（2KB以内），国产的价格低（7-8毛

钱/单位，也许还有更便宜的）

2）pyrobest，大连Takara的特色产品，据说（公司说的）保真性等于pfu，但我们发现了其3'加尾活性，使用该酶，我们没有遇到过突变，该酶可扩增4-5KB的片段，价格3.2元/单位

3）LA taq，大连Takara的又一特色产品，保真性略低于pyrobest，该酶可扩增10KB的片段，价格2.0元/单位 这几种酶性价比较高

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