实验二总糖和还原糖的测定（二）（精）

实验二 总糖和还原糖的测定（二）

──3,5－二硝基水杨酸法

目的要求：

掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法。

实验原理:

在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。

OHNO2HOOCNO2(DNS)

OH NH2+ 还原糖 HOOCNO2（3－氨基－5－硝基水杨酸）? 黄色 桔红色

试剂和器材

一、试剂

3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5g DNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000ml容量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶液325ml，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000ml。

葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖200mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml，即含葡萄糖为2.0mg/ml。

6mol/L HCl：取250ml浓HCl（35%～38%）用蒸馏水稀释到500ml。

碘－碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。 6N NaOH：称取120g NaOH溶于500ml蒸馏水中。

0.1% 酚酞指示剂。

二、材料

藕粉，小麦淀粉或玉米淀粉。

三、器材

723PC、S22型分光光度计，天平，水浴锅，电炉，试管若干等。 一、葡萄糖标准曲线制作

取5支15mm×180mm试管，按下表加入2.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水。

管号

葡萄糖标准液 /ml

蒸馏水 /ml 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0

葡萄糖含量 /mg 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2

OD540

0 0

1 0.2 2 3 4 5

0.4 0.6

0.8 1

操作方法

在上述试管中分别加入DNS试剂2.0ml，于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0ml，摇匀，在540nm波长处测定光吸收值。以1.0ml蒸馏水代替葡萄糖标准液按同样显色操作为空白调零点。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。

二、样品中还原糖的提取

准确称取 0.5g小麦（）粉，放在100ml烧杯中，先以少量蒸馏水(约2 ml)调成糊状，然后加入40ml蒸馏水，混匀，于50℃ 恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使还原糖浸出混。过滤，将滤液全部收集在50ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。

三、样品总糖的水解及提取

准确称取0.5g小麦(玉米)淀粉，放在锥形瓶中，加入6mol/L HCl 10ml，蒸馏水15ml，在沸水浴中加热0.5h，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕，冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6N NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100ml，过滤取滤液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。

四、样品中含糖量的测定

取7支15mm×180mm试管，分别按下表加入试剂： 项目 H2O/ml 样品溶液/ml 3,5-二硝基水杨酸试剂/ml OD值/540nm 空白 1 0 2 0 1 2 还原糖 0 1 2 0 1 2 总糖 0 1 2

加完试剂后，于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0ml，摇匀，在540nm波长处测定光吸收值。测定后，取样品的光吸收平均值在标准曲线上查出相应的糖量。

五、结果处理

按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量：

式中：C──还原糖或总糖提取液的浓度，mg/ml；

V──还原糖或总糖提取液的总体积，ml；

m──样品重量，g；

1000──mg换算成g的系数。

注意事项

标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色

思考题

1. 比色时为什么要设计空白管？

2. 比较费林试剂比色法与3,5-二硝基水杨酸比色法测定可溶性淀粉中还原糖和总糖的结果，这两种方法各有何优点？

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