烟叶中游离氨基酸总量的测定
更新时间:2024-07-04 04:48:02 阅读量: 综合文库 文档下载
烟叶中游离氨基酸总量的测定
一、原理 游氨基酸可与水合茚三酮反应,产生蓝紫色化合物。在一定范围内,颜色的深浅游离氨基酸含
量成正比,可用分光光度计,在570nm下测得蓝紫色溶液的消光值,根据标准曲线计算未知样品中游离氨基酸的含量。 二、实验材料、仪器和试剂
1. 材料 新鲜烟叶 2. 仪器
(1)研钵、漏斗、三角瓶、滤纸 (2)具塞刻度试管20ml
(3)刻度吸管(5ml、1ml、移液枪0.1ml) (4)沸水浴电炉 (5)分光光度计 3. 试剂
(1)10%乙酸
(2)水合茚三酮试剂:称取0.6g茚三酮加入15ml正丙醇溶解,再加入30ml正丁醇及60ml乙二醇,最后加入9mlpH4.5乙酸—乙酸钠缓冲液,混匀,贮于棕色瓶于冰箱内保存,10日内有效。 (3)乙酸—乙酸钠缓冲液(PH4.5):称取54g乙酸钠(NaAc·3H2O),加入蒸馏水加热至沸,冷却后加30ml冰乙酸,用蒸馏水定容至100ml。
(4)氨基酸标准液:称取80℃烘干的亮氨酸46.8mg,以10%异丙醇溶解,并定容至100ml,取此液5ml用蒸馏水稀释至50ml,即为每毫升含氮5ug的标准液。 (5)0.1%的抗坏血酸:50mg溶于50ml水中,现用现配 (6)60%乙醇
三、操作步骤
1. 样品提取
取新鲜待测烟叶,剪碎,于研钵中加5ml10%乙酸,研磨,转移至100ml容量瓶中,用蒸馏水定容后,用干滤纸过滤至三角瓶中。
2. 标准曲线制作
取6支20ml刻度试管,按表加入试剂后,盖上玻塞,混匀,置沸水浴中15分钟,然后取出在冷水浴中迅速冷却,使加热时形成的红色逐渐被空气氧化而褪色,直到溶液呈蓝蓝紫色时,用60%乙醇定容至20ml,摇匀,在570nm下测消光值。以每管含氮量为横坐标,消光值为纵坐标作标准曲线。
试剂 标准亮氨酸 无氨蒸馏水 水合茚三酮试剂 0.1%抗坏血酸 每管含氮量(ug)
管号
1 0 2.0 3.0 0.1 0
2 0.2 1.8 3.0 0.1 1.0
3 0.4 1.6 3.0 0.1 2.0
4 0.6 1.4 3.0 0.1 3.0
5 0.8 1.2 3.0 0.1 4.0
6 1.0 1 3.0 0.1 5.0
3. 样品测定
取样品滤液1ml,放入20ml具塞刻度试管中,加蒸馏水1ml,水合茚三酮3ml,0.1%抗坏血酸0.1ml,同标准曲线方法显色、比色。根据消光值在标准曲线上查的样品的含氮量X(ug) 四、结果计算
按下式计算出100g鲜样中氨基酸的含量:
X(ug)╳ 氨基酸含量(mg/100g鲜样)= 样品提取液总体积 测定所取滤液体积 ╳100 样品重(g)╳100 五、注意事项
比色应在显色后1小时内进行;实验用水为无氨水;严格掌握抗坏血酸用量
注:缓冲液配制时可适当加热,以防结晶(乙酸-乙酸钠)(最好用无离子水); 配制水和茚三酮时,将所有醇加入后再溶解(盖盖子); 用定量滤纸(7或9cm);
过滤首次将滤液倒掉,以达到润洗三角瓶(或塑料盒等)及滤纸的目的; 抗坏血酸现用现配,贮于容量瓶中。
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