几种新型荧光分子探针的合成及性能研究

湖南大学硕士学位论文

几种新型荧光分子探针的合成及性能研究

姓名：顾峥申请学位级别：硕士专业：有机化学指导教师：向建南

2010-03

博士学位论文

摘 要

本论文研究分为两个阶段。第一阶段是在湖南大学“985”专项基金项目平台下重点研究了有机荧光分子探针的设计合成及性能研究；第二阶段是在国家留学基金委高水平大学研究生联合培养项目平台下重点研究了纳米荧光探针的合成、性能研究及在生物医学上的应用。

第一部分：几种基于DPA基团的有机荧光分子探针的设计、合成及性能研究

在第一部分中，首先概述了荧光探针研究的历史、现状和最新进展，探讨了这类电子转移反应的实际应用。分子荧光具有许多特殊性质，比如灵敏度高、响应快、可以在单分子水平上和远距离监测、易于实现人-分子之间的联系等等。同其它材料相比，有机分子有更好的可设计性和可裁接性，因此新型有机分子荧光探针的开发研究已成为人们关注的热点，设计、合成性能优异的有机分子是开发研究中的重要组成部分。我们不仅充分探讨了设计荧光分子探针时所遵循的原则性，而且更进一步强调了合成的简便性和易于向多种领域衍生的可能性。鉴于目前人们生活中对金属离子检测的迫切需要，由此本论文确定的研究目标是发展高量子产率的荧光分子探针并探讨它在多个领域的应用。本部分主要通过有机偶联的方法设计合成了几种化学荧光探针，研究了它们对不同金属离子检测的选择性以及检测的灵敏度。

(1) 芘是一种具有强荧光活性的芳香烃有机物，荧光特性和光敏感性在光化学反应中起着重要作用。同时它易于合成多种衍生物，通过胺化还原反应连接DPA基团，有助于整个荧光分子探针的亲水性质。对于一个荧光分子探针而言，DPA基团的链状敞开式结构使它能够快速与金属离子络合，保证检测的实时性。不仅便于分子在水溶液中的应用，而且为分子探针的进一步衍生和固载提供了反应活性基团，将有可能固载于聚酯、聚醚、烯烃共聚物上做成传感器器件。设计合成了一种基于PET过程作用原理的芘型DPA荧光分子探针。作为表征介质极性的荧光探针，能够快速与金属离子络合，保证检测的实时性。在300 nM的检测水平上，对于荧光探针分子Zn2+和Cd2+明显要优于其它金属离子溶液，在Zn2+为0～0.40 μM范围内的检测限达到0.26 μg/L，并对Zn2+拥有良好的单一选择性响应。同时该荧光分子探针对pH值的不敏感性，可避免生物体受到外界刺激后引起pH值变化，有应用于生物体系的发展前景。

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几种新型荧光分子探针的合成及性能研究

(2) 二苯乙烯由于具有较好的平面性、共轭性而成为常见的共轭桥，根据其特点设计的荧光分子探针将具备分子相对较小，既有亲脂性又有亲水性，有在各种不同环境检测中进行测定的可能。通过设计期望这种探针分子能够克服传统有机荧光分子探针水溶性不好、工作光谱不在可见光区、选择性不高的缺点。设计合成了一种基于ICT过程的二苯乙烯型DPA荧光探针分子。斯托克斯位移较大（74～130 nm），可避免吸收光谱干扰发射光谱，从而提高测试的灵敏度与准确性。在DMSO/H2O (10/90, v/v)和MeCN/H2O (10/90, v/v)体系中Cu2+和Cu+表现了对该荧光探针分子优良的灵敏度，在Cu2+为0～0.50 μM范围检测限达到25 nM，并对铜离子拥有良好的单一选择性响应，使荧光分子传感与检测真正成为一类常规的水质检测技术。

(3) 含有杂原子的苯并噻唑作为一类电致发光材料显示了独特的优势，同时其结构易于调整，可以通过引入双键、苯环等不饱和基团、以及各种生色团来改变共轭程度。改变材料的发光波长，其发光波长可以覆盖整个可见光范围，从而能衍生出更多的荧光分子探针结构来。设计合成了一种基于ICT过程的苯并噻唑型DPA荧光探针分子。在MeCN/H2O (10/90, v/v)体系中Sn2+和Fe3+表现了对该荧光探针分子优良的荧光猝灭效果，在Sn2+为0～0.50 μM范围内检测限达到134 nM，并对Sn2+拥有良好的单一选择性响应。这种荧光分子探针的开发具有较好的应用价值和发展前景。

(4) 异维A酸是一种含芳香环的单双键交替的π共轭体系药物分子，存在着单双键交替结构的异变性，但是该分子的缺点是共轭的萜烯链结构末端缺少荧光团的存在，同时分子的共平面性和共轭程度也不甚理想。另外，传统的炔键形成往往要涉及到羧基保护与脱保护步骤，而研究出一种新型无铜Sonogashira偶联方法用于直接偶联卤代芳香羧酸与端炔分子，将能大大简化反应流程，提高合成效率。通过不同底物的选择，拓展了在无铜Sonogashira反应条件下将卤代芳香羧酸与端炔的直接偶联。具有操作简单、产率高的优点，同时反应后处理方便，产物的分离和纯化也简单易行。并将反应底物进一步得以拓展，实现了乙炔型维A酸类药物分子和乙炔型DPA荧光分子探针的合成，表现出该体系良好的应用前景。同时设计合成了以异维A酸结构为底物，连接DPA分子形成一个类似PET过程的结构分子，考察结构特点对荧光探针分子的影响。其较强的紫外吸收能力得以保留，但金属离子的加入也不能引起化合物发生电子跃迁，同时紫外吸收波长保持稳定，通过吸收光谱的检测无法来识别金属离子。合成过程中得到了一个化合物单晶，并通过了X射线单晶衍射解析。

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第二部分：量子点的合成与纳米荧光探针的研究

在第二部分中，量子点作为一种新型荧光探针，与传统荧光染料相比，具有许多优良的光学性质，已在分子生物学、细胞生物学、医学等研究领域获得广泛应用。相对于传统的有机荧光染料,大小均匀的半导体量子点发射光谱窄且具有尺寸调谐特性、用单个波长即可激发不同的量子点、荧光量子产率高、稳定性好和具有很好的生物相容性等优点。针对当前有机溶剂中合成量子点仍然存在反应条件苛刻反应温度高、原料金属有机化合物易燃、易爆、毒性大和溶剂昂贵等缺点采用改进的绿色化学合成方法制备出了高荧光产率的分散性好的半导体量子点，研究了反应时间反应温度以及反应溶剂对量子点生长情况及性能的影响。与传统的有机荧光探针相比，表面充分钝化的量子点具有激发光谱宽，发射光谱窄且对称分布，最大发射波长位置可调，不易光解的特点，因此可以作为荧光探针对生物样品和细胞进行成功染色。若表面未加充分钝化，则量子点的荧光特性对周围环境的变化非常敏感，这是此类荧光探针检测无机离子、蛋白质、DNA的理论基础。

(5) 微波辐射法由于快速、简便、高效、绿色等优点，近年来被广泛的应用于有机合成的加速反应和无机纳米材料的合成。采用微波辐射法，在低温条件下（50 oC～140 oC），以甘油作为良好传热介质，柴油作为溶剂，油酸作为配体，没有使用有剧毒的TOPO作为配体，快速合成了CdSe量子点。考察了在不同温度、不同反应时间、不同配比、不同微波功率条件下量子点光学性能的变化规律。所合成的量子点具有良好的光学性能，量子产率最高可达70 %，发射峰半峰宽最小在28nm。该方法进一步降低了原料成本，简化了实验工艺，实现了环境友好绿色合成，进一步促进了CdSe量子点合成工艺的发展和生物上的应用。

(6) 利用羧基与Cu2+离子之间的配位作用，合成了基于聚合物Mao-mPEG包覆的水溶性CdSe/CdS型核壳量子点作为荧光探针。在其它金属离子共存的情况下能高选择性的定量测定Cu2+，在Cu2+为0～0.5 μM范围内得出量子点荧光探针的检测限达到16 nM，建立了荧光猝灭效应测定Cu2+离子的新方法，并从机理上阐释了量子点荧光猝灭的原因。选择发射波长为595 nm的量子点探针作为研究对象，可以有效的消除潜在的生物应用上的干扰，使生物样品和细胞实体分析成为可能。

关键词：荧光分子探针；偶联反应；金属离子；荧光团；离子识别；量子效率.

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Abstract

This dissertation is divided into two stages. The first part of the studies are on the design, synthesis and properties of several DPA-type organic fluorescent molecule probes under the Hunan University \the studies are on the synthesis, properties and biomedical applications of quantum dots under the State Scholarship Fund in the United States as a joint PhD student.

Section One

In the first section, we reviewed the research history and recent development of the fluorescence probes, and focused on the application of this kind photo-introduced electron transfer reactions. Molecular fluorescence has many remarkable advantages, such as high sensitivity of detection down to the single molecule, rapid “on-off” response, feasibility studies of human-molecule communication, subnanometer spatial resolution with submicron visualization and submillisecond temporal resolution. Compared to other materials, organic materials have the advantage of being designed and modified easily, and the investigation of new organic materials has attracted a lot of attention due to their potential application in chemical fluorescence probes. The design, synthesis and characterization of organic molecules have become an active and interesting subject. Highly developed organic chemistry, deep understanding of molecular recognition and increasing skills on molecular design provided the solid foundation for our research works herein. Except following the general rules of designing a new fluorescent molecular, we also emphasized the volatilities of preparation and derivation, especially. Then, the research goal of this dissertation is determined to develop fluorescent molecule probes with high quantum yield and investigate their application in many fields. Thus, in this section, several kinds of fluorescence probes based on chemical sensors, in which different metal ions was detected, were designed and synthesized by the organic coupling method. The selectivity and sensitivity of the new probes to the target ions were carefully studied.

(1) Pyrene is an aromatics organism with strong fluorescence activity. The fluorescence properties and photosensitive of Pyrene plays an important role in the photochemical reaction. Moreover, it is easy to synthesis of various derivatives, such as the hydrophilic of fluorescent molecule probe is increased by the reductive

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amination reaction with connecting DPA group. The open structure of DPA group can rapidly complex with metal ions and ensure the real-time detection. Not only facilitate molecules in aqueous solution, but also provide the reactive groups on the application of molecular probe for further derivative and load. There may be fixed on polyester, polyether, and olefins copolymer on the sensors device. Based on the principle of PET process, a kind of pyrene-DPA fluorescent molecule probe is designed and synthesized. As the polarity medium of fluorescent probe, it is rapidly complex ability of metal ions and protected the real-time detection. Zn2+ and Cd2+ are obviously superior to the other metal ions in the 300 nM level detection. The detection limit is 0.26 μg/L in the range of 0～0.40 μM, and it is good single selective response for Zn2+. The affect of the pH value is not sensitivity, so this fluorescent molecule probe can avoid the external stimuli and have the development prospects for the biological system.

(2) Stilbene is a common conjugate bridge for its good planar and conjugation. The fluorescent molecule probe of this structure has relatively smaller molecules, both the lipophilic and hydrophilic character, and the determination possibility in different environment. Based on the principle of ICT process, a kind of stilbene-DPA fluorescent molecule probe is designed and synthesized. The stokes shifts is 74～130 nm, so the emission spectrum can avoid the jamming of absorption spectrum. Then, the detection sensitivity and accuracy is improved. Cu2+ and Cu+ express an excellent sensitivity for this fluorescent probe molecular in the system of DMSO/H2O (10/90, v/v) and MeCN/H2O (10/90, v/v). The detection limit is 25 nM in the range of 0～0.50 μM, and it is good single selective response for copper ion. It prompts the fluorescent molecular sensors and detection becoming truly a kind of technology for the conventional water detection.

(3) As a series of electroluminescent materials, benzothiazoles shows unique advantage for containing heteroatomic. Its structure is easy to adjust and the conjugate degree can be changed by the unsaturated groups and various fluorophores. Change the light wavelengths of the materials, and the range can cover the whole of visible light. So, it can derive more structure of fluorescent molecular probes. Based on the principle of ICT process, a kind of benzothiazole-DPA fluorescent molecule probe is designed and synthesized. Sn2+ and Fe3+ express good Fluorescence quenches for this fluorescent probe molecular in the system of MeCN/H2O (10/90, v/v). The detection limit is 134 nM in the range of 0～0.50 μM, and it is good single selective response for Sn2+. This kind of fluorescent molecule probe has good application value and prospect for development.

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(4) Retinoids is a kind of alternating single drug molecule with the aromatic ring and π conjugate system. There exist is the degeneration for the alternating single structure. But the molecular conjugate shortcoming is lack the existence fluorophores on the terminal of terpene chain structure. Moreover, the total plane and molecular conjugate level is not very ideal. In addition, the classic alkynyl forming reaction tends to involve carboxyl protection and deprotection reactions. A directly copper-free Sonogashira coupling between halogenated aromatic acid and termial alkynyl molecules was developed so as to simplify the reaction procedure and improve the synthetic efficiency.

This directly copper-free Sonogashira coupling is expand by the choice of

several substrates. The advantages of this method are simple operation, high yield, processing convenience and the products are easy to separate and purify. By using this method, the acetylene-type retinoids drug molecule and acetylene-type DPA fluorescent molecule probe are synthesized. This method shows a good application prospect. Moveover, the novel retinoids-DPA molecule is designed and obtained, and the structurely characteristic of fluorescent molecule probes is studied. The strong ultraviolet absorption ability is preserved, but the compound is not happened the electronic warp by the detected of the absorption spectra and can not identify the metal ions. A crystal is obtained in the synthetic process, and the structure is determined by the X-ray diffraction analysis.

Section Two

In the second section, QDs as novel fluorescence probes have many excellent optical properties. Compared with traditional fluorescence dyes, QDs play more and more important roles in the fields of molecular biology, cell biology and medicine, et al. QDs are novel semiconductor nanocrystals with the significant advantages of narrow, size-tunable, highly stable photoluminescence, biocompatibility and QDs with different sizes can be excited at single wavelength over organic fluorephores. The preparation of QDs with high quantum yield and good monodispersity through improved ‘Green Chemistry’ in organic system. The influence of reaction time, temperature, and solvent on the growth and performance of QDs is discussed. Compared to conventional organic dyes, sufficiently passivated QDs appeare to be less susceptible to photobleaching with much narrower emission spectra and tunable maximum emission wavelength, which have been sucessfully used as fluorescent QWss in imaging of biological samples and cells. If not well passivated, the

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luminescence of the QDs becomes very sensitive to their local environment, and detections of some inorganic ions, proteins, DNA conformations were developed based on this property.

(5) The advantages of microwave irradiation technology are not only for faster reaction time, but also higher product yields, cleaner reactions, more green reactions. So microwave irradiation technology has been extensive applied in synthesis of organic and inorganic nanomaterials in recent years. CdSe semiconductor photoluminescent QDs are rapidly synthesized via microwave irradiation technology at controllable temperature (50 oC～140 oC), where glycerin served as heating medium, diesel oil as the resolver, oleic acid as the ligand, and whithout taking violently poisonous TOPO as Ligand. Different amount of reaction temperature, reaction time, molar ratio and microwave power are employed to investigate the relationship of photophysical properties in different reaction conditions. The as-prepared CdSe QDs exhibit excellent photophysical properties. Their quantum yields are up to 70 % and FWHM of the photoluminescent emission specturm peck is only 28 nm. This method reduces the cost of materials, simplifies the experimental process, and realizes the environmentally green synthesis. These QDs would benefite for the synthetic technology of quantum dot CdSe and biological applications.

(6) Using the coordination of the carboxyl group and Cu2+ ion, the water-soluble polymer Mao-mPEG coated CdSe/CdS core-shell quantum dots as fluorescent probe is synthesized. Cu2+ ion shows the high selectivity of quantitative determination in the other metal ions coexistence. The detection limit is 16 nM in the range of 0～0.50 μM, and it is good single selective response for Cu2+. The quench of quantum dot fluorescence is analysis from the mechanism. Without the interference of blood components that largely emission light at 595 nm, the quantum dot fluorescence with better emission signals offer an attractive alternative to fluorescent particles containing organic fluorophors and luminescent QDs to analyze in biological samples and cells.

Key Words: Fluorescent molecular probes; Coupling reaction; Metal ions;

Fluorophore; Ion recognition; Quantum yield.

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湖 南 大 学 学位论文原创性声明

本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。

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第一部分

几种基于DPA基团的有机荧光分子探针

的设计、合成及性能研究

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几种新型荧光分子探针的合成及性能研究

第1章 绪 论

1.1荧光分子探针概述

1.1.1基本概念

传感技术是现代科技的前沿技术，许多国家已将传感技术列为与通信技术和计算机技术同等重要的位置，称为信息技术的三大支柱之一。所谓传感技术，是人们为了对被测对象所包含的信息进行定性的了解和定量掌握所采取的一系列技术措施，而传感器就是完成相应传感功能的器件活装置。传感器大致可分为三种：（一）物理传感器是以外界的光、声、磁或温度等物理量为对象，并将其转变成电信号的装置；（二）化学传感器就是将各种化学物质的特性(如气体、离子或电解质溶液、空气湿度等)的变化定性或定量地转化成为电信号的传感器；（三）生物传感器是使用固定化的生物分子结合换能器，用来侦测生体内或生体外的环境化学物质或与之起特异性交互作用后产生响应的一种装置[1]。根据所应用的检测方法，最常见、最重要的化学传感器主要有电化学传感器、生色（紫外）传感器、荧光传感器等等。

如图1.1所示，一个具有分子器件性质的化学传感器可简单地分为3个部分：（1）外来物种的识别部分(Recognition moiety)；（2）传感器在接受外来物种后将信息传输外出的报告器部分(Report moiety)；（3）中继体部分(Spacer)。它具有体积小、费用低、不需要预处理以及远距离探测等优点，而且不管是在溶液中还是在界面上，荧光信号比较容易观测及检测的下限浓度往往较低，因此受到人们青睐。另外一些化学传感器具有渗透细胞壁的功能，可以对活细胞进行非破坏性检测，从而为更好的揭示各种离子在生命过程中所起到的作用及导致的疾病机理打下基础。

report moietyoutput siginalspaceranalyterecognition moiety

图 1.1 化学传感器的结构示意图

一般认为化学传感器(Chemical sensor)是指能连续提供其环境化学量信息的传感装置，由化学探测层与物理传感元件组成[2]。按此定义，把一次性使用或不能

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连续传感的装置叫探针(Probe)。荧光分子作为传感信号具有以下优点：最高可达单分子检测的高灵敏度、能够实现开关操作、对亚微粒具有可视的亚纳米空间分辨能力和亚毫秒时间分辨能力、原位检测(荧光成像技术)以及利用光纤进行远距离检测等等[3]。荧光分子经过特殊设计引入到待测体系中，能够将分子识别的信息转换成荧光信号传递给外界，从而使人与分子间的对话成为可能，架起宏观世界和微观世界联系的桥梁，具有这种功能的分子称之为荧光分子探针[4]。

荧光探针技术是一种利用探针化合物的光物理和光化学特性，在分子水平上研究某些体系的物理、化学过程和检测某种特殊环境材料的结构及物理性质的方法。该技术不仅可用于对某些体系的稳态性质进行研究，而且还可对某些体系的快速动态过程如对某种新物种的产生和衰变等进行监测，这种技术的基本特点是具备高度灵敏性和极宽的动态时间响应范围。随着科学发展，荧光分子在信息传递过程中，由于受到不同的环境刺激如异构体互变、离子配位、氧化还原、光电控制的电子能量转移、弱键的形成与断裂等而发生荧光变化，可以实现荧光的开、关转换，更适合于生物微观结构的识别和标记，因而近年来荧光分子作为探针在生命科学、环境科学、材料科学、信息科学等领域得到了广泛的应用。

1.1.2荧光团的选择

荧光团是荧光分子探针的最基本组成部分，作用是将分子识别信息表达为荧光信号。荧光分子探针中的荧光团通过给出荧光强度的增强和减弱，以及荧光峰值波长的位移等信息来反映微观世界的分子识别作用。然而，目前荧光分子探针中所用的荧光团却非常有限，主要为荧光素类衍生物、多环芳烃类化合物及其他可以发荧光的有机化合物和金属配合物等。它们本身或衍生产物具有很高的荧光量子产率，但最大吸收波长和荧光发射波长多小于600 nm。因此，寻找灵敏度高、选择性好、对光稳定、量子产率高、可用于荧光分子探针的新型荧光团，对于荧光分子探针的设计是非常重要的。 1.1.2.1稠环芳烃类荧光团

以蒽、芘为主要代表的稠环芳烃类荧光团一般都是具有强而稳定的荧光，在荧光分子探针研究领域里，它们作为结构最简单的荧光团经常用于基础理论的研究。特别重要的是，蒽、芘能产生激基缔合物荧光这一特征是其它种类荧光团不具备的。到目前为止，基于激基缔合物原理设计的探针，绝大多数都是以蒽和芘作为荧光团的，但是这类荧光团往往具有致癌性，吸收波在紫外区，大大限制了其作为生物荧光分子探针的应用。

化合物1是一种新型基于Hg2+诱导脱硫而设计的分子传感器[5]。该类化合物本身没有荧光或荧光较弱，加入Hg2+后，会导致其荧光显著增强或吸收光谱的变化。化合物2中多胺配体作为识别基团固定在类似蒽的荧光团上得到了一个能识

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别Hg2+的荧光探针[6]，随着的加入荧光强度降低了18倍且选择性好。说明将多胺配体固定在荧光团上对提高选择性很重要，其配位可影响分子内的电子转移反应，实现荧光分子探针的“on-off”。化合物3作为荧光分子探针实现了肉眼方法区别了Cu2+、Hg2+，其它离子对它们的检测不构成干扰[7]。Cu2+的加入使得物质激发波长红移，Hg2+的加入使其荧光强度增加。化合物4是通过2,6-吡啶二甲酸把两个乙二胺的二萘嵌苯双酰亚胺荧光团连接起来的PB-BP探针结构[8]。该探针对Hg2+有很好的选择性，它与Hg2+作用后，365 nm的荧光信号增强，而557 nm的荧光变弱。对Hg2+的检测下限为1.0×10-8 M。

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1.1.2.2萘酰亚胺类荧光团

萘酰亚胺类化合物作为一种荧光团母核，是很重要的有机功能染料中间体，已经被广泛应用于染料、颜料、荧光增白剂、荧光墨水、涂料等方面。由于其具有良好的光化学稳定性、热稳定性以及结构修饰的多样性等特点，已引起了广大科研人员的极大兴趣，在光敏感材料[9]、化学荧光探针、DNA嵌入剂、有机电致发光材料[10]等领域的研究已经全面展开。

萘酰亚胺分子的特点主要有：（1）刚性、共平面性。一般来说，荧光物质的刚性和共平面性越强，分子与溶剂或其他溶质分子的相互作用越少，外转移能量损失越少，有利于荧光的发射；（2）具有较大共轭体系，使得离域π电子容易激发，从而容易产生荧光；（3）分子结构中具有推－拉电子体系，而这种体系中的电子很容易受到外界的光或者电场激发发生跃迁，产生荧光。目前国内外有关1,8-萘酰亚胺类化合物的研究主要集中在亚胺的变化和萘环的修饰上。

在内部电荷转移（ICT）理论基础上，化合物5中脂肪族叔胺氮原子用吡啶2-甲胺的氮原子替代，形成两个类似乙二胺结构的作用单元[11]。在水/乙醇混合溶液中与Cu2+形成1:1的金属－配体配合物后，475 nm处出现一个新的很强的荧光发射峰，荧光蓝移明显。它能高灵敏、高选择性定量检测Cu2+，这种传感器的显著光学性能有利于进一步拓宽对其它重过渡态金属离子的测定。在化合物中萘酰亚胺4-位的仲胺上再引入一个吡啶-2-甲基得到了新的荧光功能分子6，在pH=7.0的

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水/乙腈混合溶液中可作为Zn2+的荧光分子探针[12]。和Zn2+的作用导致与1,8-萘酰亚胺直接相连的仲胺去质子，N原子的给电子能力进一步增强，从而表现出紫外吸收光谱红移，荧光发射从537 nm红移至593 nm，并且荧光强度也有较大减弱，达到了选择性识别Zn2+的效果。化合物7在加入F-后再加入各种阴离子时[13]，可能由于F-强电负性使萘酰亚胺4-位胺基去质子，并导致分子电荷密度变化，紫外－可见吸收光谱从455 nm红移至550 nm。

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1.1.2.3碳菁类荧光团

碳菁类荧光团近年来应用在红外激光染料、非线性光学材料和生物大分子荧光标记等方面，是一类由两个杂环体系及中间次甲川链组成的染料，主要是以吲哚环和苯并噻唑、苯并噁唑或苯并吲哚等含氮杂环为骨架[14]。碳菁类荧光团的结构特点是通过单次甲基或多次甲基将两个含氮的环连接起来，形成共轭大π键。碳菁荧光团是目前核酸荧光探针中较新的，也是研究比较活跃的一类。不对称菁荧光团合成及性能测定的文献很多，此类荧光探针对不在活细胞内的少量细胞也很敏感，在水溶液中基本不会光退化，因此其水溶液可长期、连续地用于核酸测定。这些染料与双链核酸结合时（包括DNA和RNA），其荧光增强，当专门用于标记DNA时，必须先加入RNA酶进行处理，菁染料也可与寡聚核苷酸探针同时使用，以显示和定量分析细胞中的特定核酸序列[15]。

化合物29以三碳菁为荧光团[16]，N,N-二甲基吡啶为识别基团，有很好的细胞通透性、较大的最大吸收波长和荧光量子数。表现出很高的选择性和敏感性，在巨噬细胞中，该化合物能够对细胞中的Zn2+离子有很好的响应。化合物30与dsDNA结合后的荧光最大波长在520～550 nm之间，而随着染料分子中电荷的增加，荧光量子产率QF有明显的增加[17]。将染料－DNA化合物分别超声波降解不同时间，发现荧光最大波长不随DNA的链长度变化而改变，只是荧光强度随着降解时间的增加而有微弱减小。当染料与ssDNA结合后，荧光强度的下降取决于染料分子中的电荷。

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1.1.2.4卟啉酞菁类荧光团

一般情况下，卟啉和酞菁都是颜色较深、熔点较高的固体，对光和热相对稳定。它们最显著的化学性质是容易和金属离子反应形成配合物，根据金属离子价态、半径以及配位数的不同，形成的配合物也多种多样。

在卟啉或酞菁的基本结构中，周边取代的官能团可以是烷基、苯并基团、杂环等，它们主要有2个主要吸收带：紫外区的B带和近红外区的Q带，Q带受稠环个数、取代基数目的影响，一般分布于650～850 nm，如Lajolla Blue是一种硅酞菁衍生物（λem=680 nm，量子产率70%）具有很好的光稳定性，可用于荧光免疫分析中标示蛋白质。水溶性酞菁也以独特的吸收和荧光特性在生化分析中的应用正日趋广泛，其较深的色光和对蛋白质非特异性的强吸附使其被用作新型的蛋白质染色剂；较高的荧光量子产率和较大的Stokes位移（>300 nm）使其在荧光免疫分析中被用来标识抗体或在DNA杂交中作DNA探针。但是，酞菁类染料的缺点是合成中溶解度小、体积大，会影响生物分子其它性能[18]。

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化合物10与Z-DNA作用后[19]，原探针在633 nm的发射荧光蓝移至622 nm，且670 nm的荧光有所增强，而该化合物与B-DNA作用后，上述两个波长的荧光都被猝灭。其最大的优点是不会导致Z-DNA向B-DNA的转化。化合物11是冠醚

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酞菁中引入八个长的脂肪链后，可以制得有液晶性质的冠醚酞菁化合物[20]。可以将这种易形成聚集体的分子看作是分子导线，四周有四个离子通道，脂肪链是绝缘层。

1.1.2.5荧光素和罗丹明类荧光团

荧光素及其衍生物是重要的荧光探针材料，属于呫吨染料。荧光素和罗丹明都是非常重要的荧光染料，其特点是具有高的消光系数，激发和发射波长都在可见光区，在水中荧光量子效率高，因此在生物医学用荧光探针领域应用非常广泛。但是，它们的缺点也很明显：（1）较小的Stokes位移，使得样品背景对荧光的干扰相对较大[21]；（2）荧光量子产率对pH值敏感[22]，不适合在中性和酸性条件下使用，在生物体内的生理环境下荧光量子产率降低；（3）具有对光敏感的基团，在强光检测下容易分解[23]；（4）亲脂性差，难以透过细胞膜，因而用于细胞的研究效果差；（5）特异选择性差。尽管如此，由于目前还没有合适的替代品，它们在生物医学上的应用仍然最广泛。

HO.COOHOOAcOOOOAcAcOOOOAcOHOO.NCS12N313O14

化合物12是一种常用来标记氨基酸的衍生试剂[24]。以荧光素为荧光基团，以异硫氰酸为反应基团，通过反应基与蛋白质的自由氨基相结合形成硫脲衍生物，从而实现对蛋白质和多肽的衍生标记。化合物13具有细胞渗透性[25]，通过胞内非特异性脂酶水解成羧基荧光素。它带有特殊的负电荷，能延长其在细胞内的存留时间，所以它在检测细胞内部脂酶活性方面有着广泛的应用。在氨基荧光素基础上研制出的化合物14容易渗入细胞[26]，在波长大于3000 nm光照下能转化成活泼的氮烯物与蛋白质发生键合反应，从而完成对细胞内蛋白质的检测。 1.1.2.6氟硼类荧光团

氟硼类荧光染料（BODIPY类）与其它荧光染料相比具有稳定，量子产率高等优点，这使它代替了许多早期的荧光染料而应用在生物和化学分析方面，包括利用BODIPY荧光染料合成形形色色的金属离子荧光分子探针。

化合物15以2,2-联吡啶做为Zn2+的识别基团[27]，每一个吡啶上连有一个BODIPY基团，这个探针体系对Zn2+的作用是使探针的荧光极大的猝灭，原因是当联吡啶络合了Zn2+后，在光激发下联吡啶Zn2+络合物会向BODIPY基团转移电子，从而把整个探针分子的荧光强度降低，达到荧光猝灭的效果。化合物16则是

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几种新型荧光分子探针的合成及性能研究

以BODIPY基团为母体合成了一个Zn2+探针[28]。该探针络合锌离子后荧光增强，其pKa降到5。而真正将探针做到不受pH影响的是化合物17[29]。它也是一个基于PET机理的探针，络合锌离子后荧光增强8倍，pKa首次降低到2.1，使得其在人体内几乎不受pH影响，非常适合应用于细胞中，在锌离子探针中又迈进了一大步。

NNHN.NNNNNNN-FBNF15NNB-FFNNB-FF16NNB-FF17.

1.1.2.7金属配合物类荧光团

金属配合物为发色团的荧光化学传感器，识别结合基团与识别对象结合后，引起金属与配体之间跃迁能量的变化，这种变化可以表现为荧光光谱的变化，从而实现有效的识别。金属配合物类长寿命荧光探针大多是无机配合物，并在阴离子识别的研究比较多。许多过渡金属离子、稀土离子(Eu3+，Tb3+等)，具有较长的荧光寿命，但荧光量子产率较低。利用共振能量转移原理，人们将这些金属离子与适当的有机荧光体结合，发展了各种各样的金属配合物类长寿命荧光探针。

ON.O2SNNNNSO2NNN181920OOO2+OOO.NZnNNNRuOHOHONCONReCOCO

化合物18是由两个探针分子与一个锌离子形成配位络合物[30]。配位后荧光的最大激发波长和发射波长都有变化，并且在469 nm处的荧光强度时配体的24倍。同时还发现其它离子对该探针的干扰很小。有些荧光分子开关是通过结合某些过多吡渡金属离子的氧化或还原态(Ni3+/Ni2+, Cu2+/Cu+)猝灭或恢复荧光分子的荧光。啶Ru2+络合物19加入Pb2+后[31]荧光光谱红移了38 nm，而且荧光强度随之增强。这是由于Pb2+与识别基团（双羧基）配位后，改变了中心离子的d轨道能级所至，而其它阳离子的加入对于荧光光谱则没有变化。化合物20则是以另一种无机发光

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基团修饰的冠醚作为Pb2+的荧光探针[32]。在水溶液中，荧光强度随着Pb2+浓度的增加而增强。由于PET过程会受连接基团的影响，连接大环和吡啶配体之间的链的长度对于选择性和灵敏度也有较大的影响。

1.1.3识别基团的选择

荧光分子探针中的识别基团（也称受体部分）是体现探针分子识别功能的主要部分，它决定了荧光分子探针和客体结合的灵敏度和选择性。其中识别基团空穴的大小与客体之间的关系是选择性分子识别的首要标准。此外，识别基团中所包含的配位点的数目和客体的配位数，以及配体的种类，包括配体的酸碱性也会影响选择性。识别基团对客体的识别不仅限于对金属阳离子，而且也涉及阴离子和中性分子等，对于不同类别化学物质的识别有其特定的要求。为了能实现高度的专一性识别，在对识别基团的选择和设计时，关键是要实现识别基团与客体间的高度互补，其中包括形状，尺寸以及作用点分布等的相互匹配。因此，设计合成具有作用点合理排布的三维结构体系，可认为是荧光分子探针的设计中最高标准所在。

1.1.3.1多胺及冠醚类识别基团

自从1987年Nobel化学奖授予Pedersen、Cram和Lehn以来，冠醚化学得到了长足的发展，并已经取得很多令人注目的成就[33]。冠醚由于其具有对介质的两亲性、选择性与阳离子中性分子、阴离子配位等优点，因而是分子识别中一类最主要的识别基团。冠醚类识别基团（包括单环冠醚，穴醚，开链冠醚）对阳离子客体有较好的亲和性，主要用于碱金属，碱土金属及氢氧根离子的识别。将其和荧光团连接组成的超分子体系是研究最多的一类荧光分子探针。作为一类人工合成的识别基团，如何设计对单一金属离子具有高选择性的冠醚，一直是人们所面临的具有挑战性的课题。

全氧杂冠醚一般的含氧数为4-10个。冠醚荧光分子探针的合成，大多是利用苯并冠醚的苯环的反应活性、芳环上取代基的反应活性，或通过冠醚环外侧链上的脂肪族反应性基团将荧光团引入。另外，冠醚中的氧原子为硬碱，对碱金属和碱土金属离子有较强的络合能力，而硫原子为软碱，当冠醚中部分氧原子被硫原子所替代后对重金属或过渡金属离子有特异的络合能力，能形成稳定的络合物。

氮杂冠醚按环中氮原子的数量可分为单氮、双氮、多氮或全氮杂冠醚。氮杂冠醚由于空腔及杂原子的不同，表现出对不同的金属离子显著的选择性。不仅因为它的配位选择性，同时氮杂冠醚与荧光团连接方便，并且识别信息容易通过PET、ICT等方式影响荧光信号。所以这类冠醚在荧光分子探针中应用最为广泛。

化合物21在乙腈溶液中对铅离子具有荧光增强识别效果，荧光增强40倍并伴有15nm的荧光光谱红移，而其它能产生干扰的离子则没有影响[34]。这种识别

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现象是铅离子配位时影响了分子探针的光诱导分子内电荷转移及分子的构象刚性的结果。化合物22对Cd2+和Zn2+有着“络合－荧光增强”的作用，并且Cd2+络合物相对于Zn2+的荧光，有大约60 nm的红移。此后，Ertas[35]以及Charles等[36]分别将此分子探针接上光纤设备，并用于检测海水等样品中的Cd2+，检出下限达到了10-9 M。化合物23是带有冠醚识别基团的氟硼荧类染料的首个分子探针[37]，该分探针系统加入Mg2+后可以使整个检测溶液子探针对于Mg2+的识别能力相对较强，

的荧光增大倍数超过1000倍，荧光寿命也相应的变长。

SN.OOOPb2+SSN.OONOOPb2+SOOONNHHNHNHNNHNNNB-FF23OONOO2122

1.1.3.2多吡啶及开链类识别基团

近年来，吡啶衍生物作为荧光分子探针的识别基团得到了广泛的应用。由于吡啶基团具有很好的水溶解性，同时又具有很好的与金属离子络合配位的能力，所以人们利用吡啶类基团构建了很多巧妙的分子结构，特别是双(2-吡啶甲基)氨（DPA基团）被经常用于各种荧光分子探针中。

这类探针研究得非常活跃。例如，DPA基团24被经常用于Zn2+的荧光分子探针中，是明确的中性Zn2+配体。化合物25是一种中性鳌合剂，和Zn2+有很好的亲和性，但和Ca2+的亲和性较弱[38]。DPA氨基上的氮原子在PET和ICT探针中都是电子给体。化合物26是早期的选择DPA为Zn2+识别基团的PET型质子和Zn2+荧光分子开关[39]。加入Zn2+后，荧光量子产率增大77倍。

NN.NZn2+NNNΝNNN.242526NN

Lippard报道的化合物27在荧光素上连有两个DPA，并引入吸电子基团以减小pH对分子探针荧光强度的影响[40]。在水溶液中几乎没有荧光的化合物在加入Zn2+后降低了接受基团上N原子上的孤对电子的还原能力，使得猝灭体系荧光的

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PET反应受阻，体系重新发射荧光。在此基础上，Lippard还成功实现对活细胞中Zn2+浓度的检测，但对pH的敏感性问题仍然需要解决。由分子探针公司开发的化合物28虽然对Zn2+的荧光增强很大[41]，但对Zn2+的亲和性比较差。所以，在配体分子中额外引入能和Zn2+配位的给体，会加强对Zn2+的亲和性。2007年，Peng等利用二吡啶氨基为识别基团[42]，设计合成了化合物29，实现了对细胞中Cd2+的实时检测。另外，Xu等报道了多胺类基团为识别基团的Cu2+荧光分子探针[43]。加入Cu2+以后，溶液的颜色由黄色变化到粉红色，这种肉眼可见的颜色变化增强了分子探针的实用性。

NNNHO.XYYY27ONNNOXCO2HYNFOO28FNO-29B-FFNNNNN.N

1.1.3.3小分子含氮杂环类识别基团

小分子含氮杂环作为识别基团是近年来研究的一个重点，最早的应用是在催化领域。常见的用以作为识别基团的杂环主要有噁唑、噻唑、噁唑啉、吡啶、吡咯以及在识别过程中产生的具有部分环状性质的类杂环等。小分子杂环作为识别基团的优势在于设计方便、合成简单，合成的识别基团选择性往往很高，但是最大问题是设计的目的性和可预见性不强，往往不是有的放矢。小分子含氮杂环主要有五元环、六元环以及一些识别过程中具有部分环状性质的类杂环等。

H3COOCH3COO2NN.ONN.H2N30NH3COO31OCOOCH332HNNNNCOOCH3

化合物30不仅可以用单光子激发[44]，还可以用双光子激发，当用单光子激发(339 nm)时，检测范围在pH为3.5～6.5；用双光子激发(712 nm)时，监测范围在pH为4.5～7.5，并且较早地将双光子染料用到了水介质中，为双光子染料在pH探针中的应用奠定了基础。Y-型咪唑衍生物31可用作荧光化学传感器检测氟离子

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[45]

。加入F-后，其乙腈溶液由绿色变成棕色，并且荧光最大波长从490 nm红移至

565 nm。化合物32是一个开关式的荧光探针[46]，可用于活神经元细胞和巨噬细胞中NO的检测。与铜离子形成的配合物不产生荧光，而当NO与配体的氨基反应后，生成有荧光的化合物，检测下限在纳摩尔级水平。 1.1.3.4环糊精类识别基团

自1891年Villers发现环糊精(CD)至今已逾百年，是继冠醚后的第二代识别基团，已经发展成为超分子化学最重要的主体之一。环糊精是由葡萄糖通过1,4-糖苷键相连形成的一类筒状化合物，其内腔疏水而外部亲水。环糊精的分子结构独特，而且易于衍生，所以可以被用来设计目的不同的具有特殊结构和高度选择性的主体分子。一般是将荧光团连接在环糊精上，在水溶液中，荧光团进入环糊精的疏水空腔，在与识别基团结合时，客体将荧光团从空腔中逐出，导致荧光变化，这类探针多用来识别中性分子。

环糊精的分子识别过程涉及到范德华力、疏水作用力、偶极-偶极、诱导偶极-偶极、静电力和氢键等多种非共价键力的协同作用。然而，母体环糊精的识别能力是有限的，因此，目前设计和合成具有功能性基团的新型环糊精衍生物作为超分子主体，探讨主-客体分子的相互识别作用规律及其功能性基团的特性已成为近年来化学、生物学和药学领域的一个新的研究热点。基于激基缔合物原理的环糊精荧光探针比较常见，例如将芘连在环糊精上的荧光探针处于水溶液中时，芘在环糊精内腔中，两个芘发射团得以靠近并在激发时形成激基缔合物，发射强烈的激基缔合物荧光。当溶液中加入新的客体分子时，能进入环糊精内腔，将芘取而代之，使激基缔合物荧光大大降低，而出现芘单体荧光。

HN.aHNnbnNHNHNHb.a = α-CD, n = 133b = β-CD, n = 0,1,2,334

化合物33是将芘荧光团通过三乙胺桥连接到氨基环糊精上[47]。其荧光强度在pH为5～10的范围内成线性，是一个较宽范围的pH荧光探针。化合物34在引入Cu2+后，主体分子对几种染料分子的键合能力得到扩展[48]。原因是Cu2+引入后主体化合物的构象相对稳定，同时发生客体与配位铜离子的静电相互作用。在pH为7.2时，主-客体间的尺寸匹配、疏水作用和范德华力决定所形成配合物的稳定性。在pH为2.0时，主客体间的静电相互作用和疏水作用成为超分子配合物形成的主要驱动力。

1.1.3.5杯芳烃类识别基团

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杯芳烃是由对位取代的苯酚与醛在碱性或酸性条件下反应得到的一类环状缩合物，是继冠醚和环糊精之后出现的“第三代”主体分子。它能与离子、中性分子形成主客体包结物，这是集冠醚(客体为离子)和环糊精(客体为中性分子)两者之长。杯芳烃的空穴大小的调节具有较大的自由度，目前已合成了4～20个苯酚单元所构成的不同环腔尺寸的杯芳烃。杯芳烃下缘的酚羟基、上缘的苯环对位及连接苯环单元的亚甲基都能进行各种选择性功能化，得到不同的衍生物，获得许多含有杯芳烃衍生物识别单元的光学功能分子。在诸多大环配体中，杯芳烃在化学传感器的灵敏度、选择性以及配位的效率上都有着独特的优点，同时由于杯芳烃的大小、电子给体的类型以及取代基的位置对于离子的选择性也有很大的影响，因而在设计时有着较大的自由度[49]。

Me2NNMe2NMe2NMe2OOOO.O2SO2SSO2NHNHHNHNSO2OOOOOOOOOONHOOOOOOOOOO.353637

化合物35是一种高选择性、高灵敏度的Pb2+传感器[50]，一次引入四个萘磺酰胺基团，大大提高了检测的灵敏度和光化学稳定性。同时由于氨基的存在，pH值对传感器有着一定的影响，在pH为5.2时的络合能力达到最佳。在515 nm和565 nm两处的荧光强度比值同[Pb2+]成正比，可用于定量检测，检测限达到10-7M。含有荧光团的化合物36在酸性条件下和碱金属K+、Rb+形成配合物时发生荧光猝灭现象[51]，而对于相同条件下的其它碱金属却未发生猝灭。这主要是因为化合物可以和K+、Rb+形成稳定的配合物。化合物37可有效地识别Cu2+，具有有很好的选择性[52]。随着Cu2+浓度的不断增大，溶液的荧光强度逐渐降低，但最大发射波长却不发生变化。更为有意义的是该荧光试剂和Cu2+形成配合物后，对于D-(+)-葡萄糖酸内酯具有很好的识别作用。最大发射波长位置没有发生变化，荧光强度却逐渐增强。

1.1.3.6其它类型识别基团

除了以上介绍的几种常见的识别基团外，还有许多其它类型的识别基团被用来开发阳离子荧光分子探针。例如，磺酰胺化合物38对Pb2+有选择络合性质，并

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引起化合物的荧光猝灭[53]。该类检测器能选择性的提取Pb2+，且提取率达到100%，在Zn2+有很好的应用前景。多羧酸类化合物39是一种新的“off-on型”分子探针[54]，和Cd2+存在下荧光增强，而且Cd2+使得其荧光有60 nm的红移。这种不同可直接用于Zn2+和Cd2+的区分。而钾盐的形式存在保证了水溶性，从而增强了实用性。

OOSNH.NHOSONMe23839NMe2KO2CKO2CCO2KCO2KNMe2OSNGluOH40CysGluGlu.

另外，在生物领域也不断发现新型的识别基团用于荧光分子探针的研究。例如，DNA(脱氧核糖核酸)可以被组合优化而产生类似酶的选择性催化功能，基于其催化剂原理得到了新型的Pb2+荧光分子探针[55]。以四肽为识别基团的Pb2+荧光分子探针40则是用对探针所处微环境的极性十分敏感的N,N-二甲基氨基萘磺酰胺作为荧光团，用一个四肽作为识别基团[56]。在同Pb2+络合后四肽的构象发生改变，因而整个分子所处的极性发生改变，进而影响到分子的荧光性质，实现对Pb2+的定性、定量检测，灵敏度可达10-8M。

1.2荧光分子探针的设计原理与检测机制

1.2.1荧光分子探针的结构特点

荧光化合物大多数表现为有机芳香族化合物或它们与金属离子形成的配合物，这类化合物在紫外光区和可见光区的吸收光谱和发射光谱，都是由该化合物的电子跃迁引起的。已知大量的有机物中，仅有小部分会发生强烈的荧光，它们的激发光谱、发射光谱和荧光强度都与它们的结构有密切的关系。

其结构有以下特点：（1）含有共轭双键体系，通常增加分子内π电子共轭体系长度可提高荧光效率并使荧光红移；（2）具有芳环或杂环。芳环越大，其荧光峰越向长波长方向移动，荧光强度往往也越强。苯、萘仅在紫外区有荧光，随着芳环的增加，它们的荧光光谱可以进入可见光区；（3）具有刚性结构和平面结构的π电子共轭体系。闭环可以增加分子共平面性和刚性而使荧光增强，许多本身无荧光或者荧光很弱的化合物与金属螯合产生具有环状结构的螯合物时显示较强荧光；（4）空间位阻效应的存在能破坏分子的共平面性和共轭程度，从而使荧光减弱，立体异构现象对于荧光也有显著的影响，顺式和反式同分异构体往往具有不同的荧光性质[57]。

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另外，取代基的性质对物质荧光特性和荧光强度都有很大影响。芳基上引入取代基可改变荧光的量子产率和荧光波长，通常邻、对位定位基可使荧光增强，间位定位基使荧光减弱。根据作用不同大致可分为三类：（1）增强荧光的取代基，属于这类取代基的有-NH2，-NHR，-NR2，-OH，-OR（R=-CH3，-C2H5等）等给电子基团。含这类取代基的荧光物质，其激发态的产生常常是取代基的O或N上的非键电子被激发到π*键上造成，取代基的孤对电子参与荧光分子的共轭大π键，扩大了共轭体系，使最大吸收波长和荧光发射波长比未含取代基的母体化合物的波长红移，荧光强度也有显著增加；（2）减弱荧光的取代基，如C=O, -NO2, -COOH, -CHO, -COR（R=-CH3, -C2H5等），-N=N-，卤素等吸电子基团。荧光减弱的原因则各不相同，如硝基、偶氮基能发生预解离阻止荧光的产生；重原子(如Br、I等)一般有“重原子效应”而影响系间跨越跃迁的速度使荧光量子效率降低；分子两端分别连接给电子和吸电子基团可使荧光波长发生红移并伴随强度的增强。

从化合物荧光性能与结构的关系来看，一个强荧光物质一般需要具备的特征是需要有大的共轭π键结构、刚性的结构，特别是平面结构以及较多的给电子取代基[58]。一个荧光探针分子的识别基团识别被测物后，识别信息按照某种传递机制传递给荧光团，从而产生荧光信号响应。它通常由三部分组成：识别基团、蕴涵传递机制的连接臂和荧光团。其中识别基团和荧光团分别代表着微观和宏观，也是目前研究的最广和最为成熟的两部分。传递机制则是连接微观与宏观之间的桥梁，直接决定着信号的性能，从而影响到整个识别事件的表达。对传递机制的研究也是荧光探针领域最为绚丽多彩的部分，出人意料而又引人入胜的荧光响应信号总能激发起人们对内在机制探索的兴趣，神秘的信息读取和传输过程也赋予了人们无穷无尽的想象空间。很多被分析物都可以用荧光方法测得，如阳离子(H+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Pb2+和Cd2+等)，阴离子(卤离子、羧酸根、磷酸根和ATP等)，中性分子(糖类)和气体(O2、CO2、NO等)。

因此在荧光化学传感器的设计中，一般要考虑两个部分：一是对被测物（客体）具有高选择性的荧光团的设计；二是高灵敏度识别基团的设计。另外还需要在识别基团和荧光团之间设计一种被测物与识别基团之间相互作用能迅速响应，并影响发光体发光信息变化的结构，使得体系对受测物识别的信息能够及时传递，因此还可能涉及到整个分子化学性质、空间构象等因素的影响。

1.2.2荧光分子探针的识别原理

近几年，利用荧光分子传感器，实时、原位分析过渡金属和重金属离子的研究受到了广泛的关注[59]。由于这类金属离子多数都对有机染料分子的荧光具有内在的猝灭作用，最近的许多研究多致力于设计具有金属络合诱导荧光增强的分子探针。Kimura认为理想的传感器应具有以下特征：荧光分子探针自身稳定，对某

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种金属离子高选择性、高敏感性、快速可逆响应(实时)、微米水平上原位响应并易于操作[60,61]。荧光分子探针的主要应用领域是生物、医学和环境监测，所以在水溶液中的识别更具有潜在的广泛应用价值。另外，在水溶液中通过缓冲溶液控制稳定的pH值，使识别研究的结果更可靠[62]。

通常评价荧光分子探针的性能应主要考虑其灵敏性、选择性、实时性和原位检测性能等四方面因素。其中影响灵敏性的因素有很多，如荧光分子探针与被检测物的结合强度是识别灵敏性的前提、识别信息的荧光信号转换效率同样影响识别灵敏性、荧光增强的探针一般会比荧光猝灭的探针灵敏性高等等。而选择性则主要取决于探针与被检测物特异性的结合，还与被结合的客体性质有关，专一选择性是最好的。实时性主要包括识别响应的速度和可逆性两方面，如果可逆响应的速度快于或与被检测客体的变化速度相匹配，则可称之为实时响应探针；原位检测性能主要取决于分子探针与被检测体系的相溶性，探针能以独立的分子状态分散于被检测体系并发出识别信号。

1.2.3荧光分子探针的检测机制

目前，在研究荧光功能分子过程中，成功的应用光诱导电子转移(PET)、分子内电荷转移（ICT）、能量转移(EET)和激基缔合物的形成等多种光物理原理设计合成了许多新型有效的荧光分子探针和荧光分子开关。 1.2.3.1光诱导电子转移 (Photoinduced Electron Transfer, PET)

在各种阳离子荧光分子探针中，以PET为设计原理的荧光分子探针是人们最为广泛研究的一种荧光分子探针[63,64]。相比较其他类型的化学传感器，荧光化学传感器具有检测方便快捷和灵敏度高等优点。典型的PET体系是由包含电子给体的识别基团(Receptor)，通过间隔基(Spacer, 如-CH2-CH2-)和荧光团(Fluorophore)相连而构成的。

图 1.2 PET荧光分子探针的识别原理

PET荧光分子探针的识别原理如图1.2所示，PET荧光分子探针中，荧光团与识别基团之间存在着光诱导电子转移，对荧光有非常强的猝灭作用，这是由于荧光团受光激发后激发态的能量足以氧化分子探针的识别基团，识别基团的最高占

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有轨道(HOMO)电子便向荧光团的HOMO转移，使得荧光团的激发态电子能够回落到原来的基态，从而阻止了荧光团的荧光发射过程。与客体相结合，光诱导电子转移作用受到抑制，甚至被完全阻断，氧化电位升高，使得受体的HOMO在能量上低于荧光团的HOMO，结果是会发射荧光。由于与客体结合前后的荧光强度差别很大，呈明显的荧光“关-开”过程，这类探针又被称作荧光分子开关。

NNCOO-COO-COOOONF41NF4344-NO.NOOOSSOSS.NOB-42

已知的PET荧光开关分子中，多数是以脂肪氨或氮杂冠醚作为识别基团，且分子多是以蒽作为荧光团，亚甲基或酰胺键作为间隔基连接不同的识别基团所构成的PET荧光分子探针。化合物41在甲醇中和K十络合后，荧光量子产率从0.003增加至0.141。化合物42对pH不敏感[65]，其pKa被降低到2.1，它的细胞渗透性很好，在细胞内Zn2+的荧光显微成像研究获得了满意的结果。化合物43则利用识别基羧酸基团形成的空穴可以有效地螯合碱土金属Ca2+ 和Mg2+[66]。大多数PET荧光分子探针的设计是基于识别基团与客体的结合，使光诱导电子转移受到抑制，荧光团荧光恢复的原理设计的(“off-on”开关)。化合物44的识别基团为硫杂冠醚

[67]

，虽然与Cu2+有很强的亲和能力，但不同的是配位后产生从荧光团到金属离子根据离子参与的电子转移反应原理设计出的化学荧光探针的优点主要表现在

的PET过程，导致荧光猝灭。这是PET过程的另一种表现形式，即“on-off”开关。 以下方面：（1）具有高的灵敏度，检测限可以达到单个纳米数量级别；（2）具有良好的“off-on”性，信号变化大且易于识别；（3）快速响应，时间分辨率可达10-7秒；（4）识别基团与荧光团单独分离的构建体系将更加方便的通过化学或物理手段来进行修饰；（5）高的选择性，由于涉及到能级匹配的问题，PET过程对离子的识别更专一[68,69]。

1.2.3.2分子内共轭电荷转移 (Intramolecular Charge Transfe, ICT)

基于ICT过程设计的分子是具有共轭结构的分子内电荷转移化合物，在分子的两端存在着推－拉电子效应。典型的ICT荧光分子探针是由荧光团与识别基团直接相连构成[63,64]。如图1.3所示，在荧光团的两边分别连有吸电子基团(电子受体)与给电子基团(电子给体)，并且给电子基或吸电子基本身又充当识别基团或识别基团的一部分。

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图 1.3 ICT荧光分子探针的识别原理

当发生光的激发作用时，就会发生从荧光团到识别基团的电荷转移，同时产生的偶极距变化导致体系微环境的改变，一般用Stokes位移来描述。例如，当阳离子与荧光分子的电子给体一端发生作用时，阳离子减弱了电子给体的给电子能力，降低了体系共轭程度，吸收光谱蓝移，摩尔吸光系数减小；而当阳离子与电子受体一端相互作用时，将提高电子受体的接受电子能力，共轭程度加强，吸收光谱红移，相应的摩尔吸光系数增加，同样，荧光光谱的变化遵循和吸收谱图一样的规律，而且荧光量子效率和荧光寿命也都将发生变化。一般情况下，ICT荧光分子探针对荧光强度的影响不如PET探针那么显著。

典型的ICT荧光探针的荧光团是一个强的推－拉电子共轭体系，即通常所说的D-A型分子。共轭体系受光激发后会产生从电子给体到电子受体的电荷转移（ICT）。当络合了被分析物之后，给电子部分或吸电子部分的电子能力被改变，整个体系的π电子结构重新分布，形成不同的基态，从而带来吸收光谱、激发光谱以致荧光光谱的移动，通常被定义为“主动型”ICT荧光探针。

NMe2FNONOO.OONONOOOOO46[70]

BFNONCF3OOOOO47ONOO48O.OO45

化合物45是典型的ICT荧光探针，氮杂冠醚既是推－拉电子体系中的电子给

体，又是分子探针中的识别基团。当冠醚与Ca2+络合时，由于金属离子的吸电子效应，降低了氮杂冠醚中氮原子的给电子能力，发生荧光蓝移并增强。多数ICT荧

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光分子探针在结合金属离子后，荧光强度的变化不如PET分子探针明显，但化合物46是一个特例。分子中二吡咯甲基硼和氮杂冠醚均为电子给体，与Li+络合后荧光强度增大90倍，而与Mg2+络合后荧光强度增大2250倍[71]。化合物47与Ca2+结合后吸收光谱红移，荧光略有下降[32]。这是由于在键合金属离子后，一种类似羰基氧的构型促进了荧光团向苯并冠醚的电荷转移。识别基团是电子受体的ICT荧光探针，如化合物48分子中二甲氨基与氮杂冠醚均为电子给体[72]。当冠醚与Ca2+结合后，冠醚的吸电子能力增强，使整个体系成推－拉电子体系，荧光发生红移。

在ICT中，有一种情况被称为扭曲的分子内电荷转移(Twisted intramolecular charge transfer, TICT)。即具有推－拉电子共轭体系的荧光分子中，如果给电子基(如二甲亚胺)通过可旋转的单键与荧光团相连，当荧光团被光激发时，由于强烈的分子内光诱导电荷转移，连接电子给体与荧光团的单键会发生扭转，使与芳环共平面的电子给体扭转为正交状态。原来的共轭体系被破坏，部分电荷转移成为完全的电子转移，形成TICT激发态，原有的ICT荧光则猝灭。

NCN.CNCNNON49NOO50ONHHN51HNO52ONOO.

TICT态往往无荧光或者发射非常弱的长波长荧光，也有时出现ICT与TICT双重荧光现象[73]。化合物49是典型的双荧光的TICT荧光分子探针[74]，以该化合物发展的衍生物被广泛地用于TICT双荧光现象的各种研究中[75,76]。化合物50表现为双重荧光[77]，短波发射带是局部激发态产生的，长波发射带来源于TICT态。与阳离子结合后，由于氮杂冠醚与阳离子的相互作用，长波吸收带强度下降。化合物51表现出非常特殊的三重荧光[78]，第三重荧光的产生取决于溶剂、pH值和键合阳离子的微扰作用。化合物52被光激发时TICT态是无荧光的[79]，当络合H+和Ag+时，这些离子抑制了没有荧光的电荷转移TICT态的形成，荧光就被恢复。 1.2.3.3单体－激基缔合物 (Monomer－Excimer)

单体－激基缔合物是利用激发缔合物的形成和破坏引起的荧光变化来判别被测物是否被识别。形成激基缔合物和激基复合物的条件是：分子具有平面性，相互间距离达到大约3.5×10-10 m；在溶液中分子有足够的浓度；分子间的相互作用是相互吸引的等。荧光团间的距离是激基缔合物的形成和被破坏的关键，可以利用

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几种新型荧光分子探针的合成及性能研究

分子间作用力改变两个荧光团之间的距离。激基缔合物与激基复合物可以是二元络合物，也可以是一个激发态分子与二个基态分子生成的三元激基缔合物。

图 1.4 单体－激基缔合物的工作原理

如图1.4所示，单体－激基缔合物的形成原理是：一个激发态分子以确定的化学计量与同种或不同种基态分子因电荷转移相互作用，而形成的激发态碰撞络合物分别称为激基缔合物和激基复合物。激基缔合物或激基复合物形成时，其发射光谱不同于单体，表现为一个新的位于长波方向强而宽的、无精细结构的发射峰

[64]

。双荧光就是在单体的荧光之外还可以观察到一个激基缔合物发出的位于长波

方向、无精细结构宽的发射峰。单体、激基缔合物之间荧光强度的比例和分子的流动性以及微粘度有关[80]。

芘、萘、蒽等平面形的高度离域的大π键电子共轭体系荧光团由于具有较长的激发单线态寿命，易形成激基缔合物，常常被用于此类探针中。这类荧光开关已经广泛的被用于生物体系来研究核酸、磷脂以及小肽等在生理条件下的构型和活性变化。

OOO.OONOONOOO5354OHNOOOO55OONHO.

化合物53具有双芘荧光发色团[81]，氮杂冠醚络合K+或Ba2+后，荧光强度增大，同时单体/激基缔合物的荧光强度比发生变化。化合物54的醚链金属配位形成类冠醚状，改变了两个芘荧光团的位置，导致单体和激基复合物荧光发生变化[82]。与Ca2+和Cd2+作用时两个芘分子被拉远，激基复合物荧光下降，单体荧光增加。而有意思的是与Cu2+作用时两个芘被拉近，单体荧光下降，增加激基复合物荧光，并

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伴随着波长的蓝移。化合物55则是第一个利用调控静态及动态缔合物荧光原理设在乙腈溶液里既可以发出385 nm的单体荧光也能发出482 计的氟离子荧光探针[83]，

nm的激基缔合物荧光，但随着氟离子的加入，482 nm的激基缔合物荧光会蓝移到470 nm处。

1.2.3.4荧光共振能量转移 (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)

荧光共振能量转移是指在两个不同的荧光团中，当能量给体荧光团D与能量受体荧光团A相隔的距离远大于D-A的碰撞直径时，只要D与A的基态和第一激发态两者的能级间能量差相当，或者说D的发射光谱与A的吸收光谱能有效重叠，就可能发生从D到A的非辐射能量转移，又称为长距离能量转移 (甚至相距远达70-100 ?)。当D-A发生能量转移时，除了光谱重叠外，还必须以适当的方式排列[84]。

图 1.5 基于FRET原理的Ca荧光探针

2+

如图1.5所示，分别以蓝色荧光或黄色荧光蛋白作为能量的给体和受体，Ca2+

的结合能够加强荧光蛋白间的能量共振转移，从而使得长波荧光增强。FRET类型荧光分子探针近年来广泛的应用在生物大分子的动态分析中。生物大分子不仅结构复杂，而且多变，用X-射线衍射法或NMR法都不能满足生物大分子的多样性和动态研究的要求。当生物功能大分子中引入D-A荧光团后，观察二者的能量转移可以间接检测功能激活前后的结构变化[85]。其中最有代表性的是Tsien等研究出的Ca2+荧光探针[86]。

ONHClOOOH56OOOPOOHNHCOOHHNONONH2HOOO57

化合物56是一个检测磷酸二酯酶活性的荧光探针[87]，其能量供体和受体分别是香豆素和荧光素类荧光染料。化合物本身发生能量共振转移，主要发射荧光素的荧光。当磷酸二酯被磷酸二酯酶水解后，香豆素和荧光素分离，FRET停止，以

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发射香豆素的荧光为主。化合物57由萘酰亚胺与蒽通过烷基链相连，二者间距离较远，FRET效率低，当用长波激发时，只能观察到萘酰亚胺在550 nm发射的荧光

[88]

。当用短波激发时，可以同时观察到两个荧光发射峰。随pH的增加，蒽的发射

峰强度急剧降低，而萘酰亚胺的荧光强度变化很小，可以用于氢质子的识别。 1.2.3.5基于其它原理的荧光分子探针

大多数金属离子荧光分子探针是基于上述几种原理设计合成，但有些分子探针是按照其它原理设计，甚至是意外所得，但常常有出奇制胜的效果。

NNNiNHNNONNO258NNB-FF59N60NHO61NHNHHNNHONNO2SOSNNNHH.N.

化合物58在弱酸的缓冲溶液中，加入了Cu2+后，绿色荧光猝灭，溶液颜色从橙色变为黄色，该识别过程被称为光学双通道识别图[89]。近年来也发现化合物59在水溶液中，当探针系统加入Hg2+后，荧光猝灭达98%以上，同时溶液颜色从亮的橘红色变为没有荧光的普通红颜色，完全可以通过肉眼观察到，而其它金属离子则影响很小，保证了很好的专一性识别功能[90]。这些双通道识别具有很好的选择性，也为这些离子的检测提供了方便、直观的方法。通常与探针结合的过渡金属离子的不同价态对荧光团的荧光影响不同，可以通过结合的金属离子的氧化还原实现荧光分子的开关。在配合物60中，三价镍离子通过激发态丹磺酞胺荧光团向金属离子的电子转移将荧光猝灭，相应的一价配合物则不与荧光团间发生电子转移，荧光处于“开”的状态[91]。以罗丹明为母体的化合物61在PBS缓冲溶液中加入汞离子后荧光显著增强并红移[92]，进一步检测发现生成了脱硫产物。这类不可逆的化学计量性的识别分子也被称为化学计量剂(Chemodosimeter)。

另外，还有许多基于其它设计原理的探针也具有良好的识别效果，如光致异构荧光识别、分子自组装界面膜及两亲分子溶液中自聚集荧光识别、重原子效应、激发态质子转移(ESPT)和与外来物种络合使接受体的构象发生变化等[93]。

1.3课题选择的背景和研究内容

1.3.1课题选择的背景

通过最近十多年的研究发展，人们已经在荧光分子探针上积累了大量的理论

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与实验基础，为以后进一步的改进和创新铺平了道路。目前，如何将相关领域如电子转移、超分子化学以及纳米科学的最新成果应用到荧光化学传感器的设计和合成，有着重要的价值和前景。而通过对不同荧光分子探针的结构分析，可以看到荧光分子探针包含着荧光团和识别基团，识别过程中还要涉及与被识别物种的结合。不能孤立的看待荧光团和识别基团，而是要把它们当作一个超分子体系，也因此受到了化学家、生物学家、环境学家等的高度重视。

对于开发一个具有高灵敏、高选择性等优点的荧光分子探针来说，不仅荧光团和识别基团的选择非常重要，而且两者的连接方式和空间构象也是必须考虑的重要因素。体系的复杂性大于组成体系的个体复杂性之和，简单地拼合荧光团和识别基团常常不能达到预期的目的。在荧光探针的实际应用中靠单一的某种识别基团结构，往往不能做到高选择性、高灵敏度的识别，这是由于客体分子的多样性，复杂性决定的。有的识别过程并不是单靠识别基团完成的，而是由识别基团和荧光团上的取代基共同完成。尽管荧光分子探针的设计已有一些指导原理，但分子结构的差异对探针的影响还是难以预测的，因此需要合理的思考和设计，并通过大量的试验和测试来验证。

荧光分子探针的应用领域主要是生物、环境、医学等领域，因此水溶液中具有识别功能的荧光分子探针才具有更广泛的使用价值，而已有的许多荧光分子探针对过渡金属及重金属离子的识别研究是在有机溶剂中完成的，所以实现水溶液中的荧光识别是相对更具实用性的研究工作。水分子与有机溶剂相比，对金属离子具有更强的溶剂化作用，并且与识别基团的相互作用一般也比有机溶剂强。实现水溶液中的荧光识别具有非常大的挑战性，所以目前能设计、合成出在有机溶剂中对过渡金属或重金属离子具有可靠选择性识别的新探针已属不易，依然具有非常重要的实践意义。

1.3.2研究内容

本论文根据荧光分子探针的基本原理，主要进行了过渡金属及重金属离子荧光分子探针的设计、合成及识别研究，以期获得新的、性能更加优越的荧光分子探针。希望通过系列的工作进一步丰富荧光分子探针的研究，为新型荧光分子探针的结构设计和合成积累经验，努力将荧光探针分子能够运用在各种不同环境检测中进行测定，从而提高测试的灵敏度与准确性。具体研究内容如下：

（一）芘荧光团是一个易于合成多种衍生物的荧光团，通过胺化还原反应连接DPA基团，有助于整个荧光分子探针的亲水性质。对于一个荧光分子探针而言，DPA基团的链状敞开式结构使它能够快速与金属离子络合，保证检测的实时性。不仅便于分子在水溶液中的应用，而且为分子探针的进一步衍生和固载提供了反应活性基团，将有可能固载于聚酯、聚醚、烯烃共聚物上做成传感器器件。拟研

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究一种基于PET过程作用的芘型DPA荧光分子探针D1。（第2章）

+NCHOCHO.NNH2NNN.D1

（二）二苯乙烯由于具有较好的平面性、共轭性而成为常见的共轭桥，根据其特点设计的荧光分子探针将具备分子相对较小，既有亲脂性又有亲水性，有在各种不同环境检测中进行测定的可能。通过设计期望这种探针分子能够克服传统有机荧光分子探针水溶性不好、工作光谱不在可见光区、选择性不高的缺点。拟研究一种基于ICT过程的二苯乙烯型DPA荧光分子探针D2。（第3章）

NCNNBrNCBr+OHCNO2NN

（三）带有杂环结构的苯并噻唑分子化学结构易于调整，可以通过引入双键、苯环等不饱和基团、以及各种生色团来改变共轭程度，改变材料的发光波长，其发光波长可以覆盖整个可见光范围，从而能衍生出更多的荧光分子探针结构来。期望合成的荧光分子探针在进一步研究的基础上，能够在环境科学和生命科学的研究领域得到应用。拟研究一种以杂环结构的苯并噻唑分子为荧光团，以DPA基团为离子受体的荧光分子探针D4。（第4章）

D2SH.NH2+OClNO2NBrSNNNN.D4

（四）异维A酸是一种含芳香环的单双键交替的π共轭体系药物分子，存在着单双键交替结构的异变性，但是该分子的缺点是共轭的萜烯链结构末端缺少荧光团的存在，同时分子的共平面性和共轭程度也不甚理想。在二苯乙烯型DPA荧光分子探针研究的基础上，对含有炔键的荧光分子探针中电子转移情况的研究显得十分必要。传统的炔键形成往往要涉及到羧基保护与脱保护步骤，而研究出一种新型钯催化无铜Sonogashira偶联方法用于直接偶联卤代芳香羧酸与端炔分子，将能大大简化反应流程，提高合成效率，具有很强的创新性。以异维A酸结构为底物，连接DPA分子形成一个类似PET过程的结构分子D6，考察结构特点对荧光探针分子的影响。同时，拟将该方法应用于乙炔型药物分子D7的设计或者乙炔

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型DPA荧光分子探针D8的构建，有可能开发出一系列有特色的有机化合物。（第5章）

HOH3COCOOHCOONCHONNH3COD6BrOHCOOH.+H3COH3COD7SO3HSO.NN+SNNNONIND8- 25 -

.

.

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第2章 基于PET过程的DPA荧光分子探针

2.1前言

光诱导电子转移(PET)是一种重要的光物理过程，基于分子荧光发射强度对PET过程的依赖性以及对PET过程的物理结合调控、氧化还原调控和复杂结合调控，人们设计制备了一系列对分析物具有不同响应行为的开关型荧光传感器。与一般的荧光传感器相比较，这类荧光传感器具有响应快速、使用方便等特点。在已有的文献中，基于PET原理设计的荧光分子探针所使用的识别基团主要是冠醚、杯芳烃冠醚等大环化合物，这些大环化合物一般情况下合成过程复杂、产品收率低。这类探针通常使用蒽、芘等易形成基激复合物的荧光分子构造识别伴随荧光波长红移的探针。这类基于基激复合物原理设计的荧光探针，荧光发射波长较短，易受生物背景荧光干扰。经过多年努力，人们已经设计合成了多种能够识别H+、碱金属离子、葡萄糖和HPO42-等物质的PET型荧光传感器。随着新型受体结构的出现以及荧光发色团与受体搭配模式的改变，功能更加复杂多样的基于PET过程的开关型荧光分子探针将不断问世。

芘和芘的衍生物大多有强荧光并且化学性质稳定。芘可以作为表征介质极性的荧光探针，其I1/I3值(荧光发射第一谱带与第三谱带强度之比)与介质极性有很好的相关性[94,95]。由于极性小，制成敏感膜之后不易向水中泄漏，可以测定水中的有机或无机猝灭剂。另外，由于芘单线态寿命长，单体态发射光谱精细结构对微环境极性敏感，在特定的环境下能形成激基缔合物，而且可作为非辐射能量转移过程的受体，因而被广泛应用于水溶性聚合物的研究[96]。芘微溶于水，也可以作为自由“探针”加入体系探测环境极性的变化与疏水微区的形成。而离子型的芘衍生物由于良好的水溶性，可以同相反电荷的聚电解质发生静电键合，最近已经被用来研究聚电解质多层膜的结构[97]。

近年来，吡啶类衍生物作为荧光分子探针的识别基团得到了广泛应用，特别是二(2-吡啶甲基)氨（DPA基团）被经常用于的荧光分子探针的设计合成中。由于其自身提供三个氮原子，是明确的中性金属配体，DPA基团上的氮原子在PET探针和ICT探针过程中都是电子给体。另外，结构中的链状敞开式使它能够快速与金属离子络合，从而保证检测的实时性。芘荧光团是一个易于合成多种衍生物的荧光团，通过胺化还原反应连接DPA基团，有助于整个荧光分子探针的亲水性，不仅便于分子在水溶液中的应用，而且为分子探针的进一步衍生和固载提供了反应活性基团，将有可能固载于聚酯、聚醚、烯烃共聚物上做成传感器器件。所以，

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本文基于PET过程原理，从简单的荧光分子探针设计入手，选择了芘作为荧光母体，根据光诱导电子转移，通过还原胺化反应连接DPA基团作为识别基团，观察分子探针对金属离子的选择性及灵敏性。

2.2合成路线

如图2.1所示，以吡啶-2-甲醛和2-氨甲基吡啶为原料在室温下反应生成席夫碱，再用硼氢化钠还原得到中间体二(2-吡啶甲基)胺M1（DPA）；以2-芘甲醛和M1为原料，三醋酸基硼氢化钠为催化剂通过还原胺化反应得到荧光探针分子化合物D1。

CHONNNH2+NCHONaBH4NNHNNa(AcO)3BHNNM1D1

图 2.1 芘型DPA荧光分子探针的合成路线

2.3实验部分

2.3.1实验药品

吡啶-2-甲醛(AR)，2-氨甲基吡啶(AR)，2-芘甲醛(AR)，硼氢化钠(AR)，三醋酸基硼氢化钠(AR)，均购自美国Sigma-aldrich公司；其它所用试剂和溶剂均为AR级。所用试剂和溶剂除特别说明外，使用前均未经过处理。各种不同金属离子溶液的配制为：Al3+, Mg2+, Ni2+, Pb2+和Zn2+由其硫酸盐配制；Co2+, Mn2+由其醋酸盐配置；Ag+由其硝酸盐配制；其他金属离子由其氯化物配制。柱层析用200-300目硅胶购于青岛海浪硅胶干燥剂厂；TLC由烟台市芝罘黄务硅胶开发试剂厂生产的薄层层析硅胶板(GF254)测定。

2.3.2实验仪器

FA-2104型电子分析天平（上海恒平科学仪器有限公司）；Millipore RiOs/Elix 5型纯水系统（美国Milli-Q公司）；ZF-7A型手提紫外检测灯（上海顾村电光仪器厂）；INOVA400型核磁共振谱仪（美国Varian公司）；JMS-SX102/SX102A/E型质谱仪（日本电子株式会社）；UV-2401PC型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；FluoroMax-2型荧光分光光度计（美国Instruments SA公司）。

2.3.3实验步骤

2.3.3.1二(2-吡啶甲基)胺（M1）的合成

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在150 mL的圆底烧瓶中加入吡啶-2-甲醛 (2.142 g, 0.02 mol)和99 %的乙醇 (50 mL)，搅拌下慢慢滴加2-氨甲基吡啶 (2.168 g, 0.02 mol)，滴加完后分批次加入硼氢化钠 (1.514 g, 0.04 mol)。室温下搅拌3 h，过滤，滤液中用盐酸酸化至pH值为4，加入60 mL乙醇和100 mL乙醚，静置过夜。有大量固体析出，乙醇淋洗后得到M1的盐酸盐。将固体用10 mL水溶解后，加入氢氧化钠溶液调节pH值为8，用二氯甲烷分三次萃取后，用饱和NaCl溶液中和一次，真空旋蒸溶剂后，得到1.635 g黄色油状物，为中间体二(2-吡啶甲基)胺M1（DPA基团），收率为42.6 %。

1

H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 8.48 (d, J = 3.6 Hz, 2H), 7.56 (td, J = 1.6, J = 8.0

Hz, 2H), 7.28 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.07 (td, J = 4.8, 7.2 Hz, 2H), 3.89 (s, 4H), 2.63 (s, 1H, NH); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 159.8(2), 149.4(2), 136.6(2), 122.4(2), 122.1(2), 54.9(2).

2.3.3.2芘型DPA荧光分子探针D1的合成

在50 mL的单口瓶中加入2-芘甲醛 (0.582 g, 2.52 mmol)、三醋酸基硼氢化钠 (0.697 g, 3.25 mmol)、双吡啶甲基胺 (0.524 g, 2.52 mmol)和二氯甲烷 (6 mL)，在氮气保护下室温搅拌反应5个小时。反应完毕用碳酸氢钠溶液中和体系，并用乙酸乙酯萃取有机相，有机相用盐水萃取一次后浓缩的粗产物。粗产物用柱层析分离（淋洗剂为二氯甲烷:甲醇=9:1）分离得到浅黄色油状液体0.493 g，收率为47.3 %。

展开剂为乙酸乙酯:石油醚=1:1，Rf=0.3。UV(CHCl3) λmax: 347.3, 330.1, 277.9, 267.8 nm; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 8.52 (dd, J = 2.4 Hz, J = 4.8 Hz, 2H), 8.37 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 8.17-7.96 (m, 8H), 7.59 (dt, J1 = 2.0 Hz, J2 = 7.6 Hz, 2H), 7.48 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.11 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 4.39 (s, 2H, -CH2), 3.91 (s, 4H, -CH2). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ: 159.7(2), 149.0(2), 136.5(2), 131.5, 131.0, 128.5, 127.6(2), 127.3, 127.2(2), 126.0, 125.2, 125.1(2), 124.9, 124.7, 124.3(2), 123.5(2), 122.2(2), 60.7(2), 57.3 ppm. HRMS (APCI) m/z Calcd for [(C29H23N3) + H]+: 414.19647. Found: 414.19594.

2.3.4表征及性能研究方法

我们采用紫外光谱仪、核磁共振仪和高分辨质谱对产品的结构进行了表征，并通过紫外光谱仪、荧光光谱仪来研究合成的部分配合物的化学性能，测试前样品均作干燥处理。

核磁（NMR）在Varian公司INOVA400核磁共振谱仪上测得，TMS为内标。

1

131H、C NMR谱的观测频率分别为400和100 MHz。H NMR谱的观测谱宽为10,000

Hz，脉冲角30o，脉冲重复时间10 s。13C NMR谱采用Waltz去偶技术，观测谱宽为25,000 Hz，脉冲角30o，脉冲重复时6.2 s，累加次数521~2048次。测试温度为20 oC。高分辨质谱（APCI-MS）数据在JEOL JMS-SX102/SX102A/E型质谱仪上

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测得。电离能38 Ev，离子化电流600 μA，加速电压10 kV，选择性双离子监测，分辨率 >10000，PFK质量定位。

样品溶液的紫外-可见光谱在上海天美科学仪器有限公司UV-2300型紫外可见分光光度计上得到，溶剂为三氯甲烷，样品浓度为1.0×10-5 mol/L。实验中溶剂的影响被扣除。荧光谱图由日本Hitachi公司F-2500型荧光光谱仪给出（狭缝宽度为2.5 mm，450 W Xe灯），测试工作均在室温下（约20 °C）进行。准确称取待测化合物，将其移入5 mL容量瓶中，用二氯甲烷定容，配制成浓度为2.0×10-5 mol/L的溶液。分别移取0.5 mL溶液于10 mL容量瓶中，用氮气吹干二氯甲烷，再用DMSO溶剂（10 mL）定容，待样品完全溶解后配制成浓度1.0 μM的溶液。各金属离子水溶液的配置，控制浓度c = 2×10-6 mol/L。

2.4结果与讨论

2.4.1合成方法的研究

还原胺化反应的方法研究及机理探讨

还原胺化反应又称鲍奇还原（Borch reduction），是一种简便的把醛酮转换成胺的方法。根据反应步骤可分为两种：由醛(或酮)、胺(氨)和还原剂直接作用得到胺，不需分离亚胺或亚铵离子中间体的过程为直接还原胺化；先生成亚胺，然后还原得到胺，这样分步进行的过程为间接还原胺化。

在20世纪发展了许多还原胺化方法，主要有两类：一是Pd、Ni、Pt等金属催化氢化的还原胺化，属于非均相反应[98]；二是氢化物还原剂进行的还原胺化，如NaBH4、NaBH3CN、Na(OAc)3BH等，另外硼烷和锡烷还原试剂也被应用。关于金属络合物催化氢化进行的还原胺化在化学选择性方面的应用已经比较成功，而在立体选择性方面仍然需要提高，高效、高对映选择性、适于工业生产的还原胺化金属络合物催化剂亟待开发。硼氢化钠能够成功地还原C＝N成C-N，同时也可容易地将醛(或酮)羰基还原成醇，因此该方法必须分步进行，尽管需要两步才能完成胺化过程，源于NaBH4的NaBH3CN和Na(OAc)3BH在直接还原胺化时有更好的化学选择性，能够避免羰基还原成醇的副反应，因而可以使醛(或酮)与胺发生“一锅”反应，直接进行还原胺化。NaBH3CN易溶于质子溶剂，在不同pH值的溶液中显示出不同的还原能力，pH值为6～8时活性最好，但后处理时往往产生少量剧毒的HCN和NaCN副产物。Na(OAc)3BH是另一种广泛应用的还原胺化试剂。Abdel-Magid曾详细研究了Na(OAc)3BH用于各种醛和酮与不同胺的还原胺化反应[99]，均取得比较好的收率，即使对碱性较弱的芳香胺与酮进行还原，同样得到比较高的收率。在本章中，我们选用最为“绿色”、高效的Na(OAc)3BH来进行胺化还原反应，得到了理想的目标化合物，反应条件温和且收率高。其反应

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机理如图2.2所示。

N.OR1HNHNH2OR1HAcOAcOBAcOR1HNHHNR1HNNNNNNN.R1 = Pyrene

图 2.2 使用Na(OAc)3BH胺化还原反应的反应机理

将羰基跟胺反应生成亚胺（席夫碱），然后用三醋酸基硼氢化钠还原成胺。反应直接在室温下进行，体系的弱酸环境一方面使羰基质子化增强了亲电性促进了反应，另一方面也避免了胺过度质子化造成亲核性下降的发生。同时醋酸基的吸电诱导效应削弱了硼氢键的活性，使得三醋酸基硼氢化钠只能选择性地还原席夫碱而不会还原醛的羰基，从而避免了副反应的发生。用Na(OAc)3BH作还原剂，二氯甲烷做溶剂的反应条件要优于硼氢化钠或者氰基硼氢化钠，可以缩短反应时间并显著提高产率。

2.4.2化学结构解析

2.4.2.1紫外解析

考察了芘及其衍生物在氯仿中的紫外吸收谱图，无论是原料还是合成的目标化合物均具有较强的紫外吸收谱图，这是由于分子结构中共轭体系的π→π*跃迁所产生的。通过胺化还原反应引入DPA基团后，可以明显的发现目标化合物D1的λmax发生了迁移，同时在短波部分出现新的吸收带，说明新化合物的生成。

Pyrene-CHO Pyrene-DPA

1.0

Absorbance0.5

0.0

300

400

500

600

Wavelength / nm

图 2.3 2-芘甲醛和目标化合物D1的紫外吸收光谱图

如图2.3所示，2-芘甲醛由于自身多个苯环相连而在397.2、364.6和290.2处表现出较强的吸收。形成带DPA基团的探针分子后，吸收带均产生蓝移，长波部分的吸光度更高。五个新的吸收峰的谱带强度特征为：347.3 > 277.9 > 330.1 = 267.8

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博士学位论文

> 316.5 nm，这是由于形成新的化合物后结构中有吡啶环的介入而形成新的共轭体系所致。同时原有吸收峰的消失说明胺化还原反应完全。 2.4.2.2核磁共振谱解析

在目标化合物D1中，芘环以稳定的刚性结构的形式存在，胺化还原反应后生成新化合物吸收峰变化较小。

NNN

图 2.4 目标化合物D1的1H NMR谱图

如图2.4所示，在1H NMR谱中，原料9.87处-CHO质子峰的消失和4.39处新的亚甲基吸收峰的出现是鉴定化合物的重要方法之一。DPA基团中两个亚甲基的化学位移在3.91 ppm处。同时芘环中的各个吸收峰保留，与DPA基团中吡啶环上的H原子具有相似的化学位移，以多重峰的形式体现。

NNN

图 2.5 目标化合物D1的

13

C NMR谱图

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