诱变育种流程及紫外诱变育种的详细步骤 -
更新时间:2023-10-05 03:18:01 阅读量: 综合文库 文档下载
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诱变育种的一般步骤:
1.首先是天然菌种的选育:
调查研究及查阅充分的资料 ↓ 设计实验方案
↓确定采集样品的生态环境 采样
↓确定特定的增殖条件 增殖培养
确定特殊的选择培养基及可能的 定性或半定量快速检出法 平板分离 ↓ 原种斜面
↓确定发酵培养基础条件 筛选 ↓
初筛(1株1瓶) ↓
复筛(1株3~5瓶)
↓结合初步工艺条件摸索 再复筛(1株3~5瓶) ↓ 3~5株 ↓
单株纯种分离
生产性能试验 →毒性试验 菌种鉴定
2.诱变菌种:
出发菌株----菌种纯化(出发菌株性能测定)----制备斜面孢子----制备单孢子悬液(悬液进行活菌计数)----诱变剂处理(存活菌数的测定并计算存活率)----平板分离(测定变异率)----挑取变异菌落并移植至斜面上----初筛(初筛数据分析,生产性状的粗测)----斜面传代----复筛(复筛数据分析,精确测定生产性状)----变异菌株(菌株参数分析)----小型或中型投产试验----大型投产试验。 诱变育种应把握的主要原则有以下几点:1)选择简便有效的诱变剂。在选用理化因素作诱变剂时,在同样效果下,应选用最简便的因素;在同样简便的条件下,应选用最高效的因素。2)挑选优良的出发菌株。最好采用生产上已发生自变的菌株,选用对诱变剂敏感的菌株,选取有利于进一步研究或应用性状的菌株。4)处理单细胞或孢子悬液。单细胞悬液应均匀而分散,孢子、芽孢等应稍加萌发。5)选用合适的诱变剂量。一般正变较多出现在低剂量中,负变较多地出现在高剂量中。6)选用高效的筛选方法。
紫外线诱变育种:
紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯,波长为253-265nm.灯与处理物的距离为30cm,照射时间依菌种而异,一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示,希望照射的剂量死亡率控制在70~80%为宜。
被照射的菌悬液细胞数,细菌为106个/ml左右,霉菌孢子和酵母细胞为106~107个 /ml。由于紫外线穿透力不强,要求照射液不要
太深,约0.5~1.0cm厚,同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌,使照射均匀。
由于紫外线照射后有光复活效应,所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。
具体操作步骤
1.将细菌培养液以3000r/min离心5min,倾去上清液,将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。
2.将菌悬液放入一已灭菌的,装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动,以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤,单细胞滤液装入试管内,一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个/ml左右,作为待处理菌悬液。
3.取2~4mL制备的菌液加到直径9cm培养皿内,放入一无菌磁力搅拌子,然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前,应先开紫外线10min,让紫外灯预热,然后开启皿盖正式在搅拌下照射10~50s。操作均应在红灯下进行,或用黑纸包住,避免白炽光。
4.取未照射的制备菌液和照射菌液各0.5ml进行稀释分离,计数活菌细胞数。
5.取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液),120r/min振荡培养4~6h。 6.取中间培养液稀释分离、培养。
7.挑取菌落进行筛选。
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