预先静脉注射维生素C 对家兔肠系膜上动脉—最新版.总结

机能学设计性实验

福建医科大学

2012级临床医学8中班

邱凉凉陈志龙尹哲黄国堡汪声祺

预先静脉注射维生素C对家兔肠系膜上动脉缺血-再灌注损伤的保护作用预先静脉注射维生素C对家兔肠系膜上动脉

缺血-再灌注损伤的保护作用

【目的和原理】根据休克的缺血-再灌注损伤理论，通过静脉注射环磷酰胺封闭家兔肝脏网状内皮吞噬系统功能，24h后夹闭肠系膜上动脉若干时间，然后恢复血流灌注可造成小肠缺血-再灌注损伤，肠源性内毒素入血而发生休克[1]。研究表明，对组织造成损伤的主要因素，不是缺血本身，而是恢复血液供应后，产生大量的自由基攻击这部分重新获得血液供应的组织内细胞，造成肠内皮细胞保护屏障的损伤，肠道毛细血管通透性增高，肠粘膜损伤加重，并出现广泛上皮和绒毛分离，上皮坏死，引起肠道内细菌毒素入血，从而产生类似感染性休克的结果[2]。已有实验表明，维生素C 具有很强的抗氧化（清除氧自由基）和降低肠道细菌易位发生率和易位量的作用，因此预先静脉注射维生素C可使超氧化物歧化酶(SOD)活性增高、血清丙二醛（MDA）含量下降[3]，起到保护肠粘膜屏障的作用。

基于以上原理，本实验旨在学习肠系膜上动脉闭塞性休克动物模型复制的方法，探讨维生素C对缺血—再灌注损伤休克的保护作用，从而进一步拓展维生素C的临床应用价值。

【实验动物】家兔9只，体重2 kg以上，雌雄不拘。

【实验器材与药品】RM6240多道生理信号采集处理系统或BL-420生物机能实验系统、压力换能器；手术台、急性动物实验动物手术器械、动脉夹、气管插管、三通管、30ml注射器、玻璃试管、可调节移液枪（100μl 和1000μl）、滴管、秒表、纱布、细丝线；0.5%肝素钠生理盐水（625U/ml）、

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环磷酰胺、20%氨基甲酸乙酯溶液（或3%戊巴比妥钠溶液）、1%普鲁卡因溶液、显色基质鲎试剂盒、无热原的真空采血管、无热原试管等。

【实验步骤与观察项目】

1、手术操作

（1）术前动物处理：取家兔9只，随机分为三组，分别编号A、B、C，实验前24h各耳缘静脉注射环磷酰胺60mg/kg，禁食，自由饮水。

（2）麻醉与固定：家兔称重，耳缘静脉缓慢注射20%氨基甲酸乙酯溶液

5ml/kg或3%戊巴比妥钠溶液1ml/kg麻醉动物，注射时应密切观察动物的肌张力、心跳、呼吸、瞳孔大小、角膜反射和皮肤夹捏的疼痛反映等。麻醉后将动物仰卧固定于手术台上，注意颈部要放正。

（3）气管插管：剪去颈部的毛，自甲状软骨到胸骨上方沿正中线切开皮肤及皮下组织（切口长约5cm），分离皮下组织和肌肉，暴露气管，气管下方穿一根丝线，在甲状软骨下方的气管上做一倒“T”形切口，插入气管插管后结扎固定。

（4）颈总动脉插管：分离左侧颈总动脉2~3cm，近心端用动脉夹夹闭，远心端（尽量靠近头端）用线结扎，在结扎下方剪一切口，向心脏方向插入注满0.5%肝素钠生理盐水的动脉插管，用另一丝线结扎固定。打开动脉夹，用注射器经三通管向动脉内注入0.5-1cm的0.5%肝素钠生理盐水，再旋转三通管的开关，使动脉插管与压力换能器相通，即可记录动脉血压。

（5）右颈总静脉插管：颈总静脉位置较浅，位于颈部肌肉外缘，用血管钳轻轻钝性分离并在下方穿两根丝线，结扎远心端，以结扎线作为牵引线提起颈总静脉，并将一手指垫在颈总静脉下。用眼科剪在近心端血管壁上呈45°角剪一小口，插入带三通开关、已充满生理盐水的静脉导管并深入至相当右心房位置（5~7cm，该长度需在插管前在导管上做标记），遇有阻力应往回退一小段，切不可硬插（易插破静脉进入胸腔）。此时旋动三通管开关，使静脉插管与压力换能器相通，即可测得中心静脉压，观察插管是否成功。若导管插管成功，则可见中心静脉压数值在0~12cmH2O范围并随呼吸而上下波动，结扎固定。三通管连上输液瓶，不测压时使导管与输液管相通，缓慢输入生理盐水（5~10滴/分），保持静脉通畅。

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（6）暴露肠系膜上动脉：自剑突下1.5cm起沿腹正中线向下做一个正中切口，切口长约8cm，打开腹腔后，用温生理盐水纱布将内脏轻轻推向左前方，暴露出脊柱和腹膜后组织、在脊柱稍右可见黄色的右肾上腺，于右肾上腺右上方可见肠系膜上动脉，用血管钳钝性分离周围组织，然后在肠系膜上动脉穿线备用。

（7）B组轻轻提起肠系膜上动脉的穿线，用动脉夹夹闭肠系膜上动脉60min 后,除去动脉夹，分别在松开动脉夹后0min、5min、15min、30min、60min、90min、120min于家兔耳中央动脉采血2ml置于含肝素钠抗凝剂的无热原试管中待用,并描记颈动脉血压曲线同时观察血压变化；A组仅暴露但不夹闭肠系膜上动脉，取血与描记颈动脉血压曲线操作与B组同；C组于动脉夹松开前15min（即夹闭后的第45min）由三通管注射维生素C 0.500g/kg（浓度为0.300mg/L）[4]，接下来的操作与B组同。

2、系统连接和参数设置

（1）实验装置连接：与颈总动脉插管相连的压力换能器置于家兔心脏同一水平面，其输出线接RM6240（或BL-420）系统输入通道1。

（2）参数设置：打开仪器电源，启动计算机，进入RM6240（或BL-420）操作相应界面，预热20分钟。

RM6240系统：采样频率800Hz，扫描速度500ms/div,时间常数选直流，高频滤波30Hz。模式为压力，灵敏度2.5cmH2O/div。

BL-420F系统：采样频率50Hz，时间常数选直流，高频滤波20Hz。扫描速度1.0s/div。通道1选压力，增益50mV。

3、观察项目

（1）测定血液内毒素含量

分别从各无热原试管取血1ml，在显色基质鲎试剂试剂盒按其使用说明书提供的方法（见附录），测定各血浆内毒素水平并比较A、B、C三组内毒素水平的不同。

（2）描记颈动脉血压曲线

轻轻提起肠系膜上动脉的穿线，用动脉夹夹闭肠系膜上动脉，同时观察并描记血压曲线。然后分别在松开动脉夹后0min、5min、15min、30min、

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60min、90min、120min观察并描记血压曲线。

将上面的结果记录于记录于表1（见附录）

【预期结果】

1、三组家兔内毒素测定的平均值分别为：

A组：0.008μg/ml; B组：6μg/ml C组：0.05μg/ml

可见，实验组（C组）注射维生素C后，家兔血液中的内毒素含量较对照组（B组）明显减少，较空白组（A组）增加不明显。

2、三组家兔的血压变化曲线

可见，对照组（B组）的血压较正常组（A组）明显下降，实验组（C组）的血压较正常组（A组）无明显变化。

由上述结果可知，通过预先给家兔注射维生素C，可以在肠系膜上动脉缺血-再灌注休克动物模型中起到减少内毒素释放入血的作用，大大减轻休克损伤，从而起到预防作用。

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【实验研究意义】

实验创新与临床应用

近年来，随着休克治疗的进步以及溶栓治疗、心脏外科体外循环、心肺脑复苏、断肢再植、器官移植等方法的建立和应用，使组织器官的血液循环重建，功能得到恢复。由于受损组织结构的修复，患者的病情得以好转或康复；但是有时缺血后再灌注，不仅未能使组织、器官功能恢复，反而加重组织、器官的功能障碍和结构损伤。现已证实，心、脑、肝、肾、肺、胃肠道、肢体及皮肤等多种组织器官存在缺血再灌注损伤的现象。本实验通过探究维生素C对家兔肠系膜上动脉缺血再灌注损伤的保护作用，将维生素C的抗氧化（清除氧自由基）和降低肠道细菌易位发生率和易位量的作用类推于存在缺血再灌注损伤现象的上述组织器官中，保护组织器官，老药新用。而且维生素C价格便宜，能够大范围推广使用。

【注意事项】

1、剪开腹膜时，如动物仍有疼痛反应，可再用少量的1%普鲁卡因溶液进行腹膜麻醉；

2、移动内脏动作轻柔，以免过度牵拉损伤肠管，造成血压下降；

3、分离肠系膜上动脉时，动作要轻，不要使用锐器，夹闭时不能用力过猛造成血管大出血；

4、正确使用动脉夹，确保夹紧肠系膜上动脉；

5、动脉夹夹闭过紧，松夹后动脉仍未被复流的血液冲开，需用食指深入夹闭处搓揉几下。

【附录】

显色基质鲎试剂盒使用说明

1、材料和设备

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1.1 试剂

鲎试剂、细菌内毒素工作品、显色基质、偶氮化试剂1 、偶氮化试剂2 、偶氮化试

剂3、HC l ( 反应终止剂) 、细菌内毒素检查用水。

1.2 器材

无热原试管、无热原吸头。

旋涡混合仪、移液器、多道移液器、封口膜、试管架。

恒温水浴箱（37±1℃）、分光光度计。

注意：接触试剂及供试品的所有器皿必须是无热原的(出产公司提供无热原耗材)。

玻璃器皿可经250℃干烤至少60 分钟去除热原。

2、供试品的贮存与预处理

备注：若供试品为血液类，请参照厂家配套血液相关处理试剂使用说明书。

2.1 供试品的pH 值应在6 - 8 之间，若超出此范围，需用无热原缓冲液、0.1N 氢氧化钠

或0.1N 盐酸调节。

2.2 若供试品中可能存在鲎实验的干扰物质，处理参见【供试品的干扰试验】。

2.3 若供试品中可能含有β－葡聚糖（β－葡聚糖会产生G 因子旁路反应，干扰内毒素检测），需选用特异性鲎试剂（出产公司提供）。

2.4 若供试品为一些抗菌素如头孢类抗菌素和磺胺制剂会对偶氮染色剂产生偶联反应而干扰偶氮化显色，需要选用不含偶氮化试剂的试剂盒（出产公司提供）。

2.5 若供试品的本底吸光度值大于0.5,必须对供试品进行稀释后再检测。

2.6 若供试品颜色较深(例如溶血)，或在酸性条件下颜色加深(例如一些组织培养介质), 必须设置供试品空白管以扣除供试品自身的颜色本底。

供试品空白管不加入鲎试剂，以等体积鲎试剂的溶剂(该处为细菌内毒素检查用水)

代替。其余操作同供试品管。

3、实验操作

3.1 细菌内毒素标准溶液配制

标准曲线所采用的内毒素浓度可以为0.01, 0.025, 0.05, 0.1 EU/ml 或0.1, 0.25, 0.5,1.0 EU/ml。稀释方法如下（以0.1, 0.25, 0.5, 1.0 EU/ml 为例）：取细菌内毒素工作品1 支，按细菌内毒素工作品使用说明书稀释为10EU/ml 的内毒素溶液，再稀释为

1.0EU/ml 的内毒素溶液，以1.0EU/ml 的内毒素溶液为母液按下表稀释成0.1,0.25, 0.5, 1.0 EU/ml 的浓度梯度。配制好的内毒素标准溶液应在4 小时内用完。

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表1 内毒素标准溶液配制

内毒素浓度(EU/ml) 1 0.5 0.25 0.1

加细菌内毒素检查用水(ml) 0 0.5 0.75 0.9

加1EU/ml内毒素溶液(ml) 1 0.5 0.25 0.1

3.2 阴性对照为细菌内毒素检查用水。

3.3 鲎试剂、显色基质、偶氮化试剂等的溶解

显色基质特异性鲎试剂盒使用说明书(终点显色法，含偶氮化试剂)

鲎试剂：按标示量加细菌内毒素检查用水于鲎试剂中，轻轻振摇使鲎试剂完全溶解,

注意不要用旋涡混匀仪激烈振摇。溶解的鲎试剂应在10 分钟内用完。

显色基质：按标示量加细菌内毒素检查用水于显色基质中，轻轻振摇使显色基质

完全溶解。显色基质溶液可在无污染的条件下于4 oC 贮存8 小时以内。

偶氮化试剂1：按标示量加反应终止剂盐酸于偶氮化试剂1 中，

偶氮化试剂2：按标示量加细菌内毒素检查用水于偶氮化试剂2 中，

偶氮化试剂3：按标示量加细菌内毒素检查用水于偶氮化试剂3 中，

偶氮化试剂溶液可于4oC 贮存1 周。

3.4 实验操作

取无热原试管，加入100μl 细菌内毒素检查用水、内毒素标准溶液，或供试品。

再加入100μl 鲎试剂溶液，混匀，37oC 温育T1 分钟。

温育结束，加入100μl 显色基质溶液，混匀，37oC 温育T2 分钟。

温育结束，加入500μl 偶氮化试剂1 溶液，混匀，

加入500μl 偶氮化试剂2 溶液，混匀

加入500μl 偶氮化试剂3 溶液，混匀，静置5 分钟，于545nm 波长处读取吸光度值。(见表２)

表2 实验操作

阴性对照内毒素标准供试品

加细菌内毒素检查用水(μl) 100

加内毒素标准溶液(μl) 100

加供试品(μl) 100

加鲎试剂(μl) 100 100 100

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混匀，37oC 温育 T1 分钟 加显色基质溶液(μl) 100 100 100 混匀，37oC 温育 T2 分钟

加偶氮化试剂1溶液(μl) 500 500 500 混匀，加偶氮化试剂2溶液(μl) 500 500 500 混匀，加偶氮化试剂3溶液(μl) 500 500 500 混匀, 静置5分钟 ，于λ545nm 读取吸光度值 (上述T 1 及T 2 见该批鲎试剂的出厂检验报告)

表1 家兔肠系膜上动脉夹闭前、后观察指标

内毒素 血压

A 组（假手术组）

B 组（缺血-再灌注组）

C 组（维生素C 组）

A 组（假手术组）

B 组（缺血-再灌注组）

C 组（维生素

C 组）

夹闭前 — — — 松开即刻 松开后5min —

—

—

松开后

15min —

— —

松开后

30min

松开后

60min

预先静脉注射维生素C对家兔肠系膜上动脉缺血-再灌注损伤的保护作用松开后

———

90min

松开后

120min ———

【参考文献】

[1]倪秀雄.家兔肠系膜上动脉闭塞性休克.医学机能学实验（第2版）.科学出版

社.2013,11.P138-P141

[2]李树清.缺血-再灌注损伤.病理生理学（第8版）.人民卫生出版社.2013,10.P152-P163

[3]李贵振，杨勇，刘朝旭，吴华.预先静脉注射维生素C对兔脊髓缺血再灌注损伤的保护作用.【DOI】10.3870/ sjsscj.2009.04.003.P238

[4]阿吉姑·阿布都热西提，买尔旦·马合木提，马合木提·乌斯满，艾尔肯·依不拉音维生素C清除自由基能力3种检测方法的比较.新疆医科大学学报.2008.05.31(5)

书是我们时代的生命——别林斯基书籍是巨大的力量——列宁

书是人类进步的阶梯———高尔基

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书籍是人类知识的总统——莎士比亚

书籍是人类思想的宝库——乌申斯基书籍——举世之宝——梭罗好的书籍是最贵重的珍宝——别林斯基书是唯一不死的东西——丘特书籍使人们成为宇宙的主人——巴甫连柯

书中横卧着整个过去的灵魂——卡莱尔人的影响短暂而微弱，书的影响则广泛而深远——普希金人离开了书，如同离开空气一样不能生活——科洛廖夫

书不仅是生活，而且是现在、过去和未来文化生活的源泉——库法耶夫

书籍把我们引入最美好的社会，使我们认识各个时代的伟大智者———史美尔斯

书籍便是这种改造灵魂的工具。人类所需要的，是富有启发性的养料。而阅读，则正是这种养料———雨果

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