组织培养复习大纲

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组织培养复习资料

绪论：

1、植物组织培养的概念：在无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或发育成完整植株的技术。又称植物离体培养。

2、简史（重要人物的学说及其重大贡献）

2-1探索阶段：⑴德国植物生理学家-Haberlandt是植物组培的先驱；

2-2奠基阶段：

2-3迅速发展和逐步实用化阶段：

3、组培的应用（主要是与农业的关系）：a 快速繁殖优良苗木；b培养无性植株；

第一章第二章

1、组织培养实验室的结构与功能、设备

1）组培实验室结构：包括化学实验室或准备室、接种室以及培养室三部分，并且按顺序排列。在化学实验室与接种室之间应留有缓冲空间。 c、育种上应用；d、工厂化育苗

2）功能及设备

（1）准备室：用于培养器皿的清洗、培养基的配制、分装和灭菌、试管苗的出瓶及整理等工作。

设备：冰箱、天平、高压灭菌锅、pH计、干燥箱、实验台、水槽、凉干架、药品柜、离心机、水浴锅、微波炉、电炉、磁力搅拌器、蠕动泵、移液器、各种玻璃器皿（烧杯、量筒、容量瓶、试剂瓶、三角瓶等）及培养基分装用品等。

（2）无菌操作室（接种室）：植物材料的灭菌、接种以及培养物的继代转接等。设备：超净工作台、紫外灯、小推车、搁架、磁盘、接种工具（各种镊子、解剖刀、手术剪、普通剪刀接种针、酒精灯、手持喷雾器、细菌过滤器等）等。

（3）培养室：主要用于植物材料的培养。

设备：培养架及灯管、摇床（振荡器）、空调、自动定时器、加湿及除湿器、光照培养箱、温湿度计灯等。

2、各类物质消毒灭菌的方法

1）培养基：高压蒸汽灭菌（高温高压湿热灭菌法：压力在9.8×104—10.8×104Pa，温度在121℃，灭菌20—30min）、干热灭菌、过滤灭菌等；

2）玻璃器皿、塑料器皿和器械：①玻璃器皿灭菌--蒸汽高压消毒灭菌，干热消毒灭菌；②塑料器皿灭菌--多采用高压蒸汽消毒灭菌；③金属器械灭菌：灼烧灭菌浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼烧，冷却后使用；

3）植物材料：一般采用药剂浸泡灭菌，具体操作如下：（1）外植体的预处理，对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，并将外植体用流水冲洗干净。（2）用70%的酒精浸润材料30s 左右。（3）用灭菌剂浸泡灭菌，灭菌时不时搅动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触，若灭菌过程中加入数滴表面活性剂，则灭菌效果更好。（4）植物材料用无菌水冲洗3--5 次，以除去灭菌剂；

4）无菌操作区：包括接种室的消毒、工作人员用工作服、口罩等的消毒、超净工作台的清洁与杀菌、操作工具的灭菌。

3、培养基的组成及配置注意事项，计算，常用植物激素的种类及作用

1）组成：矿质营养、有机成分、植物生长调节剂、碳源、琼脂以及其他附加物等

2）配制培养基应做好几点工作：⑴实验用具的准备：包括配制过程中所需电炉、酸

度计、高压灭菌锅等设备及其他玻璃器皿的清洗和准备；⑵试剂、药品的准备；

⑶根据培养基的配方、母液扩大倍数及需要配制的培养基体积计算所需各种母液及其他附加物的量。（4）具体操作如下：⑴取规定数量的糖源和凝固剂置于烧杯或搪瓷锅内，加蒸馏水加热使之溶解，并不断搅拌；⑵根据计算所需量依次加入大量元素、微量元素、铁盐、有机物、生长调节物质母液及其他特殊的附加物，搅拌均匀；⑶加水定容至规定体积，搅拌均匀；⑷调整培养基的pH值；⑸分装；⑹封口。

3）常见植物激素的种类及作用：1.生长素类：IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、NAA（萘乙酸）、2，4-D （主要促进细胞伸长生长和细胞分裂，诱导形成愈伤组织，促进生根）；2.细胞分裂类：KT（激动素）、6-BA（苄基嘌呤）等（促进细胞分裂和扩大，促进茎增粗，抑制茎伸长；诱导芽的分化、促进侧芽萌发；延缓衰老）；3.赤霉素类：GA3、GA4等（可以诱导离体成花；打破休眠等功能）；4.脱落酸：ABA（促进休眠、衰老和脱落）；5.乙烯：ETH（主要促进衰老和脱落）。

第三章第四章

基本概念：

1、细胞全能性：植物体的每个生活细胞都具有该植物体的全部遗传信息，在特定的离体培养条件下，具有发育成完整植株的潜在能力。

2、外植体：从活体植物上切取下来，用以进行离体培养的那部分组织或器官。

3、分化：指个体发育过程中，不同部位的细胞形态结构和生理功能发生改变，形成不同组织或器官。

4、脱分化：指离体条件下生长的细胞、组织或器官逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生能力，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织的过程。

5、再分化：由脱分化形成的愈伤组织重新分化出特定细胞、组织和器官的过程。

6、器官发生途径：植物的离体器官发生是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成根、芽、茎等器官的过程。器官发生的过程（途径）分为两种：1、经过愈伤组织的器官发生2、不经过愈伤组织的器官发生

7、体细胞胚胎发生途径：植物离体培养的细胞、组织、器官产生类似胚的结构，其形成也经历一个类似合子胚胎发生和发育过程，这种现象称为植物体细胞胚胎发生，形成的类似胚的结构称为体细胞胚或胚状体。途径：1.直接途径：指从外植体某些部位的胚性细胞直接诱导分化出体细胞胚胎2.间接途径：外植体先脱分化形成愈伤组织，再由愈伤组织的某些细胞重新“决定”为胚性细胞，进而分化出体细胞胚胎。

8、愈伤组织：离体条件下生长的细胞、组织或器官经过脱分化形成的一团薄壁细胞。

9、人工种子：是指植物离体培养产生的胚状体或不定芽被包裹在含有营养和保护功能的人工胚乳和人工种皮中，从而形成能发芽出苗的颗粒体。作为繁殖材料。

10、褐化现象：褐变——是指外植体在培养过程，自身组织从表面向培养基释放出褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。

11、玻璃化现象：是指组培苗出现叶、嫩梢呈水晶透明或半透明，植株矮小肿胀，失绿，叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表皮缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织；体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低的现象。

12、如何进行无菌操作接种外植体

⑴消毒，更换实验服、帽子与鞋子，进入接种室。⑵打开超净工作台和无菌操作室的紫外灯，照射40min左右，后关闭。⑶开启过滤室风机，使无菌风吹拂工作台面和四周的台壁。⑷用70%—75%的酒精擦拭工作台和双手⑸用沾有70%—75%酒精的纱布擦拭盛培养基的培养器皿，放进工作台。⑹把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95%的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。⑺在酒精灯火焰附近切割备用的接种材料。⑻打开瓶

口，用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到。⑼取下接种器械，在火焰上消毒。⑽把培养材料放入培养瓶，盖上瓶口。⑾接种结束后，清理和关闭超净工作台。

13、体细胞胚与合子胚比较

1) 体细胞胚是离体培养的产物，是由愈伤组织或胚型细胞团的表面细胞起源的，起源于非合子细胞，所处的发育条件与合子胚很不相同；

2) 在自然界，不定胚早期分裂顺序与合子胚也不完全相同；

3) 发育过程与合子胚相似，也经历球形期、心形期、鱼雷期和子叶期阶段，球形期后的体细胞还呈现一种固定的极性；

4) 大多数体细胞胚起源于单细胞，体细胞胚发生的实质是细胞分化，生理隔离是体细胞胚发生的先决条件、生理隔离是相对的。

5) 与合子胚不同的是，在培养中形成的体细胞胚常常具有两个以上的子叶。

14、胚状体形成植株与不定芽形成植株的区别

不定芽型.特点：a、繁殖率高b、能保持遗传稳定性c、缩短繁殖周期胚状体发生型.特点：a、数量多、速度快、繁殖系数高；b、遗传性稳定

15、褐化现象，玻璃化现象产生原因，如何采取措施预防其发生？

一、褐化：1）褐变的原因：褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物多少和多酚氧化酶活性有直接关系。但酚类很不稳定，溢出过程中与多酚氧化酶接触，在多酚氧化酶的催化下迅速氧化成褐色的醌类物质和水，醌类又会在酪氨酸酶等的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活，从而导致组织代谢紊乱，生长停滞不前，最终衰老死亡。

2）影响褐变的因素：1、植物材料：①基因型②材料年龄③取材部位④取材时期⑤外植体大小及受伤害程度；2、培养条件：主要是光照与温度。温度过高或光照过强，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速外植体的褐变；3、培养基：①培养基状态：液体培养基可以有效克服外植体褐变，液体培养基再加上滤纸桥，效果就更好②无机盐③植物生长调节物质④抗氧化剂⑤吸附剂⑥pH值；4、材料转瓶周期。

3）褐变的预防措施有哪些？⑴选择适宜的外植体 ⑵采用适宜的培养基和光温条件 ⑶在培养基中加活性炭、抗氧化剂和其他抑制剂 ⑷缩短转瓶周期

二、玻璃化：1）玻璃化的原因：细胞生长过程中的环境变化。试管苗为了适应变化了的环境而呈玻璃状。

2）产生玻璃化苗的因素主要有激素浓度、琼脂用量、温度、离子水平、光照时间、通风条件等。(一) 激素浓度：细胞分裂素浓度提高（或细胞分裂素与生长素比例高），易导致玻璃化苗的产生；(二)琼脂浓度：培养基中琼脂浓度低时玻璃化苗比例增加，水浸状严重，苗向上长，琼脂的浓度一定要适当；(三)温度：温度越低玻璃化苗的比例越高；(四)光照时间；(五) 通风条件：气体交换的好坏取决于生长量、瓶内空间、培养时间和瓶盖种类；(六)离子水平。

3）预防玻璃化的措施：（1）适当控制培养基中无机营养成分；⑵适当提高培养基中蔗糖和琼脂的浓度；⑶适当降低细胞分裂素和赤霉素的浓度；⑷增加自然光照，控制光照时间；⑸控制好温度；⑹改善培养器皿的气体交换状况；⑺在培养基中添加其它物质。

第五章细胞培养

1、细胞的分离方法：①机械法：利用叶肉组织或愈伤组织排列疏松、细胞间接触较少的特点，将叶片轻轻研碎，经过滤和离心，收集和净化细胞。优点：a、细胞未受酶伤害b、有利于细胞的生理和生化研究c、无须质壁分离。

②酶解法：利用果胶酶、纤维素酶来处理植物叶片或其他外植体，使细胞分离。③化学法：利用一些化学药剂游离细胞。如秋水仙碱等。特点：①分离细胞数量大 ②易引起细胞改变。

2、悬浮培养中分批培养细胞增长曲线分期情况：延迟期、对数生长期、直线生长期、减缓期、静止期（详见课本P81）

3、单细胞培养的方法有哪些？（其概念见课本P89-92）

1）平板培养法

2）看护培养法

3）微室培养法

第六章植物脱毒技术

1、去除植物病毒的主要方法：1）热处理 2）茎尖培养 3）其他离体培养方法（愈伤组织培养脱毒、微型嫁接脱毒、花药培养脱毒、珠心胚培养脱毒等）

2、茎尖分生组织培养脱病毒的原理：一是病毒运转速度慢。二是茎尖分生组织没有维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞分裂和生长的速度，所以生长点的病毒数量极少，几乎测不出来。