应用PCR芯片筛查人重度肾积水组织的纤维化相关基因

目的 探讨纤维化相关基因, 特别是与转化生长因子β(Transforming growth factor-β, TGF-β)信号通路相关的基因在人重度积水肾与正常肾组织中的差异表达变化。 方法 收集临床重度肾积水新鲜标本12例,正常肾组织标本6例,分别提取总RNA并纯化。选择TGF-β/骨形成蛋白(Bone

应用PCR芯片筛查人重度肾积水组织的纤维化相关

基因1

姚颐1，张杰1,2，叶达夫1，谭大清1，彭建平1

武汉大学人民医院泌尿外科，武汉（430060）

武汉大学生命科学院病毒学国家重点实验室，武汉（430070）

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摘 要：目的 探讨纤维化相关基因, 特别是与转化生长因子β（Transforming growth factor-β, TGF-β）信号通路相关的基因在人重度积水肾与正常肾组织中的差异表达变化。 方法 收集临床重度肾积水新鲜标本12例，正常肾组织标本6例，分别提取总RNA并纯化。选择TGF-β/骨形成蛋白（Bone morphogenetic protein, BMP）信号通路PCR-芯片，采用比较阈值法（ Ct法）分析比较两组基因的差异表达。以表达差异（即上调或下调）大于2倍的基因为有意义的差异基因。 结果 共筛查出表达具有显著性差异的基因49个，包括TGF-β超家族成员基因及其受体、TGF-β信号通路靶分子和相关调控分子等等。其中上调25个，包括BMP3、I型胶原α1链（Col-Ⅰα1）、Nodal、GSC、胰岛素样生长因子1（Insulin-like growth factor 1, IGF1）等；下调24个，包括Lefty 1（Left-right determination factor 1）、BMP 7、BMP 2和骨形成蛋白内皮结合调节因子（BMP binding endothelial regulator, BMPER）等。 结论 证明了Nodal、GSC和IGF1等是促进肾纤维化改变的重要因子，并推测Lefty1与BMP家族的部分成员，包括BMP2~3、BMP7和BMPER等，在调控终末期肾积水纤维化改变中占有重要地位。 关键词：肾积水；肾纤维化；基因芯片；功能基因组学

肾纤维化病变是临床常见病之一，除了肾脏自身疾病外，梗阻性肾积水的加重，也伴随肾纤维化的发展。因此，延缓肾积水引起的肾纤维化进程或逆转（减轻）肾纤维化程度，是临床外科医师在解除梗阻性肾积水病因前后都应重视的一个问题。迄今为止，人们所发现的与肾纤维化有关的信号转导通路有数十条之多。其中主要有TGF-β/Smad信号通路[1]、P38MAPK信号通路[2]、Rho-ROCK信号通路[3]及其PI-3K信号通路[4]等。越来越多的文献证明，这些通路在肾纤维化的多个环节中分别发挥着各自重要的作用，肾纤维化的信号转导机制正逐渐变得越来越清晰。但是哪一条（或几条）通路是最为关键的，各通路之间的关系如何，尚未得出令人满意的结果。本文即通过用基因芯片筛查的手段，试图从基因表达的差异谱中找到突破。

1. 材料与方法

1.1研究对象与材料

1.1.1 研究对象

自2005年8月至2006年12月，在我科采集因重度积水导致肾脏无功能而手术切除的肾组织标本12例、取因肾癌行肾切除的癌旁正常肾组织标本（取材位点据癌组织边缘3~5cm）6例，均保存于-70℃冰箱。经病理学检查，所有积水肾组织均表现为弥漫性纤维化改变，所有癌旁组织均表现为结构完整、形态正常的肾组织结构。经核素肾动态显像检查，所有积水肾脏的肾小球滤过率（GFR）为(18.7±3.5)ml/min，分肾功能为(7.84±1.4)%。

1.1.2 主要耗材与设备

RT2ProfilerTM PCR芯片购于美国SuperArray公司，含113个TGF-β/BMP信号通路相1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金资助项目（20060486054）的资助。

目的 探讨纤维化相关基因, 特别是与转化生长因子β(Transforming growth factor-β, TGF-β)信号通路相关的基因在人重度积水肾与正常肾组织中的差异表达变化。 方法 收集临床重度肾积水新鲜标本12例,正常肾组织标本6例,分别提取总RNA并纯化。选择TGF-β/骨形成蛋白(Bone

关基因，芯片号APHS-035A。TRIZOL试剂购于Invitrogen life technologies公司。RNeasy® MinElute 纯化试剂盒购于Qiagen公司，甲醛上样染液购于ambion公司，其他试剂均购于华美生物工程公司。反应平台为ABI Prism7700高通量荧光PCR系统（Applied Biosystems）。

2. 研究方法

2.1 总RNA的提取与纯化

取(50~100)mg组织样品，采用Trizol一步法提取其中的总RNA[5]，纯化过程参照RNeasy® MinElute 试剂盒说明书进行，所得总RNA和mRNA经紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳进行质量分析。

2.2 实时定量PCR

将总RNA混合液25µl加到芯片上对应的每个孔中，小心密封芯片并置于冰上。实时定量PCR程序设置完后，将加好样的芯片置于ABI Prism7700高通量荧光实时定量PCR系统进行反应，记录检测到之反应体系中荧光信号的强度值（Ct）。

2.3 结果分析

采用比较阈值法（ Ct法）[6]，两组中每个基因的表达记为 Ct。公式： Ct =平均Ct –管家基因平均Ct。每个基因表达的组间差异记为 Ct。公式： Ct = Ct (组H) - Ct (组N)。其中组N是正常对照组，组H是重度积水组，通过计算2- Ct比较两组基因的表达差异。当某2- Ct值≤0.5（下调）或≥2（上调）时，认为该基因在两组间表达的差异有显著性意义。

3. 结果

根据本组芯片筛查的结果，在12例积水肾组织中表达一致性较好的基因有89个。按照我们的标准，与正常肾组织比较表达具有显著性差异的基因有49个。其中显著性上调25个，主要有BMP3、Col-Ⅰα1、Nodal、GSC、IGF1等；显著性下调24个，主要有Lefty 1、BMP 7、BMP 2和BMPER等。部分数据详见表1和表2（其中2- Ct值越高提示该基因在积水肾组织中上调程度越大，反之则提示下调程度越明显）。

4. 讨论

随着人类基因组DNA测序的完成，功能基因组学（Functuional genomics）成为了基因研究的主流。它利用结构基因组（structural genome）所提供的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或在系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从对单一基因/蛋白的研究转向对多个基因/蛋白同时进行系统的研究[7]。众所周知，严重的肾积水是导致肾纤维化的常见原因，而肾积水-纤维化的改变是一个多基因、多细胞因子、多信号通道共同参与的复杂病理过程。要了解其中发生的信号转导机制，有机地运用功能基因组学技术是解决问题的重要途径之一。

基因芯片的发展为达到这一目的提供了有力的技术支持，该法能在同一条件下一次性筛检众多基因的差异表达，具有高通量、高并行性、高效率、上样量相对少等优点，目前在肿瘤、遗传性和感染性疾病的研究中已有较为广泛的应用[5, 8-9]。PCR基因芯片除了具备前述

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优点外，还具有基因的实时定量（Real time）分析功能，这样既提高了结果的可靠性，又省去了重复Real time PCR鉴定的繁冗步骤。而且它还系统地将编码产物和功能相关的基因进行了分类，因而使结果更具有针对性。我们之所以选用此类芯片中的TGF-β/BMP信号通路芯片，主要基于以下两点：①该两条通路在器官纤维化的过程中占有至关重要的地位；②从较为主要的通道入手，初步探索终末期肾积水组织中纤维化相关基因的表达，为进一步开展更多通路的筛检提供基础。

本研究结果发现：第一，Nodal[10]、GSC[11]、IGF[12]等与TGF-β信号通路相关的基因，在重度积水肾组织中显著上调，证明了它们对肾纤维化的促进作用。其中前三者的上调更为明显，而TGF-β（包括TGFB1、TGFB2、TGFB3）作为“最强的纤维化诱导因子”[13]，其上调幅度则相对较小（TGFB2的2- Ct值为1.54）。由此可推测，当肾积水-肾纤维化改变进展到终末期（广泛纤维化）时，TGF-β不再是诱导/参与病变的主要因子，而是由Nodal、IGF等因子代之以继续发挥其致纤维化的作用。同理，由于Lefty1基因在重度积水肾组织中呈现为极显著的低表达（降低13.55倍），结合相关文献[14, 15]，我们也预测Lefty1对纤维化病变具有抑制作用，但以上结论均需进一步实验证明。

第二，BMP家族及其受体的基因表达在结果中增减各异。如表1、2所示，该家族中表达显著上调的基因有BMP3~4、GDF7，显著下调的有BMP2、BMP5~7、GDF5~6；其受体中表达显著上调的有BMPRⅠB、BMPRⅡ、ACVRL1，显著下调的有BMPRⅠA、ACVRL1。根据现有资料，BMP家族中报道最多的是BMP7对肾纤维化（因→果）的抑制作用。Morrissey[16]等应用BMP7治疗单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠模型，发现治疗组梗阻解除后，肾小球滤过率（GFR）和肾功能较对照组恢复明显加快，小管间质纤维化和小管细胞萎缩、

巨噬细胞浸润减少了55凋亡程度明显降低。Hruska[17]等同样发现BMP7处理的UUO肾中，

％-75％，免疫组化染色显示Ⅳ型胶原和α-SMA的表达明显减弱。本结果中，重度积水后的肾纤维化改变伴随着BMP7基因的下调（降低2.90倍），从相反的方向（果→因）也证明了BMP7对纤维化改变具有负调节作用。另外也有文献报道，BMP2在体内不仅能抑制小管细胞增殖[18]，还可抑制系膜细胞增殖[19]，而BMP4与囊性纤维化的病理改变有关[20]。那么如何解释它们在肾纤维化过程中的作用？从功能基因组学的角度我们推测，这是因为它们在整个纤维化过程中各司其责，既有促纤维化作用的成员（上调基因）又有抗纤维化作用的成员（下调基因），形成了一个彼此联系又相互影响的功能基因组，和其他基因组（如：TGF-β/Smads[1]、Nodal[10]、Lefty[14]等）一起共同参与调节肾脏胶原蛋白的产生和降解，维持着肾脏细胞外基质（主要是胶原蛋白）的“稳态（Homeostasis）”[15]，一旦由于肾积水等外界因素的干预刺激了促纤维化基因的表达，这种稳态即被打破，接下来就会发生肾纤维化等一系列的病变。

总之，功能基因组学着眼于全局，从整体上“横向”、“逆向”地研究和分析组织中各基因的作用和功能。虽然肾积水在不同的发展阶段，其病理生理变化以及基因、蛋白等的表达会有不同，与终末期肾纤维化也存在一定的差异，但后者基本反映了整个病变的规律性。通过本实验我们不仅证明了Nodal、GSC和IGF1等是促进肾纤维化改变的重要因子，并初步考虑Lefty1蛋白和BMP家族的部分成员，包括BMP2~3、BMP7和BMPER等，可能也是参与调控终末期肾积水纤维化改变的关键因子。当然，以上结论还需进一步研究和证明，方可为今后多靶点、联合防治肾纤维化策略的制定提供更加科学、完整的依据。

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目的 探讨纤维化相关基因, 特别是与转化生长因子β(Transforming growth factor-β, TGF-β)信号通路相关的基因在人重度积水肾与正常肾组织中的差异表达变化。 方法 收集临床重度肾积水新鲜标本12例,正常肾组织标本6例,分别提取总RNA并纯化。选择TGF-β/骨形成蛋白(Bone

PCR-Microarray Analysis of Fibrotic Gene Expression in

Extensive Fibrotic Renal Tissue Resulting from

Hydronefrosis.

Yao Yi, Zhang Jie, Ye Dafu

Department of Urology, Renmin Hospital of Wuhan University. Wuhan（430060）

Abstract

Objective To investigate the fibrosis-associated genes, especially for that transforming growth factor-β (TGF-β) associated, expression in the tissue of extensive fibrotic kidney resulting from severe hydronephrosis. Methods Compared 12 extensive fibrotic kidneys resulting from severe hydronephrosis with 6 normal renal tissues using PCR array. All samples were collected from our hospital from Aug 2005 to Dec 2006. The data was treated with Ct Method. When 2 Ct ≤0.5 or ≥2, the difference was considered significant. Results A total of 49 differential genes expressed in the fibrotic renal tissues were screened out, of which, 25 were up-regulated and 24 were down-regulated. The differential genes included members and receptors of TGF-β super family and Bone morphogenetic protein (BMP) family, target molecular of TGF-β or BMP signal pathway and several regulator. Conclusion Through investigating with PCR array, we certificated the positive effect of Nodal, GSC and IGF1 to renal fibrosis. And we supposed that TGF-β play a secondary role in renal fibrosis, while BMP family and Lefty1 work in a functuional genome in the regulating of renal fibrosis. Keywords：Hydronephrosis; Renal fibrosis; Gene chip; Functional genomic

作者简介：姚颐，男，1980年生于湖北武汉，医学博士研究生在读，现就读于武汉大学人民医院泌尿外科，主要从事肾积水、肾间质纤维化病变的分子机制研究及临床治疗；

目的 探讨纤维化相关基因, 特别是与转化生长因子β(Transforming growth factor-β, TGF-β)信号通路相关的基因在人重度积水肾与正常肾组织中的差异表达变化。 方法 收集临床重度肾积水新鲜标本12例,正常肾组织标本6例,分别提取总RNA并纯化。选择TGF-β/骨形成蛋白(Bone

表1 部分在重度积水肾组织中表达显著性上调的基因

基因名称（缩写）

Bone morphogenetic protein 3（BMP3）

Growth differentiation factor 2（GDF2）

Nodal homolog（Nodal）

Goosecoid, GSC

Growth differentiation factor 7（GDF7）

Collagen, typeⅠ, alpha 1（ColⅠA1）

Insulin-like growth factor 1（IGF1）

Transforming growth factor beta 3（TGFB3）

Inhibitor of DNA binding 1（ID1）

Latent transforming growth factor beta binding protein 1（LTBP1）

Serpin peptidase inhibitor clade E（SERPINE1）

Inhibin beta B（INHBB）

Transforming growth factor beta 1（TGFB1）

Bone morphogenetic protein receptor typeⅡ（BMPR2）

Ct H组10.4115.9515.9514.3115.95N组 2- Ct 13.89 11.16 19.19 9.45 19.19 9.45 17.21 7.46 18.80 7.21 5.11 7.43 4.99 5.94 7.96 4.06 9.48 11.14 3.16 2.13 3.52 2.62 5.25 6.61 2.57 5.96 7.14 2.27 11.4412.61 2.25 4.25 5.41 2.23 7.43 8.45 2.03 注：根据专业文献[6]，表中的2- Ct值即表示该基因的上调倍数，如BMP3的上调倍数为11.16倍。

表2 部分在重度积水肾组织中表达显著性下调的基因

基因名称（缩写）

Bone morphogenetic protein 2（BMP2）

Left-right determination factor 1（LEFTY1）

BMP binding endothelial regulator（BMPER）

Cyclin-dependent kinase inhibitor 1A（CDKN1A）

Transforming growth factor, beta receptor Ⅲ（TGFBR3）

Bone morphogenetic protein 5（BMP5）

TGFB-induced factor（TGIF）

Bone morphogenetic protein 6（BMP6）

Transforming growth factor, beta receptor Ⅱ（TGFBR2）

Signal transducer and activator of transcription 1（STAT）

Bone morphogenetic protein receptor, type ⅠA（BMPR1A）

Growth differentiation factor 5（GDF5）

Bone morphogenetic protein 7（BMP7）

Transforming growth factor beta receptor 1（TGFBR1）

SMAD, mothers against DPP homolog 1（SMAD1）

SMAD, mothers against DPP homolog 2（SMAD2） Ct H组 N组 2- Ct 11.86 7.46 0.05 9.02 5.26 0.07 15.95 12.45 0.09 10.72 8.08 0.16 9.98 7.39 0.17 14.84 12.31 0.17 7.22 4.93 0.2 14.44 12.27 0.22 15.95 13.78 0.22 7.62 5.84 0.29 11.35 9.56 0.29 15.95 14.33 0.33 10.96 9.42 0.34 11.51 10.2 0.4 8.24 6.96 0.41 6.51 5.32 0.44 注：根据专业文献[6]，表中某基因的下调倍数应当为相应2- Ct值的倒数，如Lefty1的下调倍数为13.55倍。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/96e1.html