虚拟实验报告

生物技术虚拟实验

AMY1B蛋白的虚拟克隆表达及纯化

学 院：生命科学学院 专业班级：生物技术131班 学 号：2013013851 姓 名：薛萌萌 指导教师：文建雷

1. AMY1B蛋白介绍

amylase，Amy,AMS淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α－1，4-葡聚糖，水解α－1，4-糖苷键的酶。根据酶水解产物异构类型的不同可分为α-淀粉酶（EC3．2．1．1．）与β-淀粉酶（EC3．2．1．2．）。α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。微生物的酶几乎都是分泌性的。

用作果汁加工中的淀粉分解和提高过滤速度以及蔬菜加工、糖浆制造、葡萄糖等加工制造。通常通过淀粉酶催化水解织物上的淀粉浆料，由于淀粉酶的高效性及专一性，酶退浆的退浆率高，退浆快，污染少，产品比酸法、碱法更柔软，且不损伤纤维。淀粉酶的种类很多，根据织物不同，设备组合不同，工艺流程也不同，目前所用的退浆方法有浸渍法、堆置法、卷染法、连续洗等，由于淀粉酶退浆机械作用小，水的用量少，可以在低温条件下达到退浆效果，具有鲜明的环保特色。

本实验通过对AMY1B基因进行虚拟表达载体的选择、分析和构建，最终完善AMY1B蛋白的提取分离纯化，获得AMY1B蛋白

2.实验流程

从NCBI获取AMY1B基因序列

从AddGene获得合适载体

用Vector NTI软件导入目的基因序列和表达载体序列

目的基因与载体酶切位点分析

目的基因引物设计

构建表达载体

转化 AMY1B蛋白诱导表达及纯化

3.实验过程

3.1从NCBI获取AMY1B基因序列

进入NCBI网站主页，进行目的基因搜索。限定数据库为“Nucleotide”，搜索框中输入AMY1B，如图1：

图1

综合考虑片段大小，物种来源等因素，选择第2条词条，点击进入Genbank页面。查看基因的详细信息，如图2：

图2

在Send的下拉菜单中做如下选择，如下图。点击Create File，待屏幕下方出现文件下载提示时，进行文件的保存。文件将以txt形式储存，获得目的基因的已知信息。 所下载基因为：基因: >gi|34557|emb|X54559.1| Homo sapiens mRNA for met proto-oncogene

图3

3.2载体的选择

本实验选用原核表达载体，原核表达载体调控原件包括启动子、SD序列、终止子。在http://www.addgene.org网站的搜索栏中输入pFastBac dual查找相关载体，得到很多结果。由于结果较多不利于查找，故按照以下条件进行筛选（图6）。

图4

得到10条结果，选择酶切位点比较多的载体作为本实验的载体。点击得到其具体信息如下图8所示：

图5

同时复制序列到文本文件中保存序列信息，留作备用。 3.3目的基因与载体酶切位点分析

3.3.1利用Vector NTI软件导入目的基因序列和表达载体序列

打开vector NTI，点击再点击

，在生成页面点击

，将名称相应的名字，

，在general栏中填写序列名称

图6

在DNA/RNA Molecule栏中选择序列类型，在Sequence and Maps中点击

复制序列信息，依次点击弹出的界面上的

点击确定。

，

，再

依次录入AMY1B序列信息和pGEX6P1-HA-MEK1载体序列信息。 最终结果如下：

图7

点击进入程序界面，点击open→在Database DNA\\RNA窗口下以选择相应的核酸；点击OK，在右上角即可见序列信息及酶切图谱，目的基因与载体的的酶切图谱如下（图12）：

图8 目的基因酶切图谱

图9 载体酶切图谱

3.3.2酶切位点分析

在导入的载体基因序列分析的页面打开Analyses选项，选择Restriction Analyses下的Restriction Sites，见图14、15。

图10

图11

先选中remove all，再添加我们所关心的多个酶切位点，主页面左框中出现酶切文件。

图12

为目的基因加酶切位点的原则是：该酶切位点出现在载体的多克隆位点上并且不出现在目的基因序列中，保证经酶切连接可以构建完整的表达载体，同时保证目的基因的完整性。除去目的基因中包含的酶切位点，以及载体自身包含的多个同一酶切位点，所以，这里我们所选的关心的酶切位点应该是HindⅢ和XmaⅠ。

添加酶切位点后，在左侧可以显示生成的如下（图17）酶切文件：

图13

目的基因中没有HindⅢ和XmaⅠ这两个酶切位点，在设计引物时，分别加在目的基因的5’和3’端。这样对PCR产物进行酶切时不会切到目的基因。在引物设计中已将这两个酶切位点加在了引物上。将PCR产物和载体进行双酶切，便可以连接。

3.4利用NIT软件设计PCR引物 3.4.1引物设计原则

引物与模板的序列要紧密互补;其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构;再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应。

具体要求：引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-25bp；引物序列在模板内相似性应当较低；引物序列的GC含量一般为40-60%；引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳；3’端G值较低（绝对值不超过9）；对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点等。

上面提到了引物设计的原则，但是当引物有特殊要求时，也许程序设计的是严格符合上述要求的最优结果，但并不符合实际需要，这时我们需要在这些条件间做权衡。

目的基因序列已在NCBI上查找到，克隆PCR产物的方法之一，是在PCR产物两端设计一定的限制酶切位点，经酶切后克隆至用相同酶切的载体中。但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。经查阅资料找出这两种酶切位点的保护碱基如下图18所示：

3.4.2本次实验引物设计

在本实验中采用Vector NIT设计引物，并结合手动。在软件中打开目的基因p53。选取PCR反应区段(全选)，点击Primer Design,选择Find PCR Primers Inside Selection，在新出现的页面中填写Region of Analysis参数。查看并根据实际需要进行修改。这里我们选择User-Defined Primers栏中的Sense，先来设计上游引物。

输入目的基因序列5’端的13个碱基agcagtctctgatc，然后在前面加上酶切位点GAATTC，在酶切位点前加上保护碱基CCC,这样上游引物初步设计为CCCGAATTCAGCAGTCTCTGAT。

点击右侧的Analyse，出现如下引物相关的参数的界面（图20）：

图14

点击Dimers & Hairpin loops查看引物二聚体和发夹结构（图21）：

图15

在设计引物时，本应尽量避免引物内部形成发夹结构和引物之间形成二聚体，在本次实验中，权衡各种因素之后，无法避免引物二聚体和发夹结构,但相对能量较高，结构不是很稳定，所以可以用作克隆引物。

同理，设计下游引物为: GGATCCATCCGCAAAGCGGATCCCCC

点击Dimers & Hairpin loops查看引物二聚体和发夹结构

图16

图17

从上面二图（图22、图23）可以看出下游引物设计较为合理。 综上所述，引物设计为：

上游引物为：CCCGAATTCAGCAGTCTCTGAT 下游引物为：GGATCCATCCGCAAAGCGGATCCCCC 3.5目的基因与表达载体连接

先将目的基因调整方向，因为目的基因只能从我们插入的方向表达，所以我们需要将其反向插入，那么我们就要用软件Vector NTI将其反过来。

打开目的基因，点击Edit,再点击Molecule Operations，选中Make Reverse Complement，即可得到反向序列，如图18：

图18 图19

图20

图21

导入载体，删除EcoR I和BamH I之间的片段，留下两个完整的酶切位点。将目的基因与载体连接。

此图可粗略的说明目的基因被插入载体。但需要进一步的验证，于是将目的基因、载体、重组载体进行一个凝胶电泳分析，最终用电泳图谱可观察到目的基因是否插入。

从Gel Analysis中选中Setup a New Gel，出现新的对话框（图26）：

图22

参数保持默认值，点击Run。上方出现新的工具框，点击Add Marker Lane

，

图23

选择所需要的Marker。由于重组载体长度为9202bp，查询合适的Marker，如图24、25。本实验选择500bp DNA Ladder作为实验的marker。

图24

图25

添加所要跑胶的样，先点击Create sample，添出现以下对话框（图26）：

加所要跑的样品，点击之后会

图26

从列表中选择需要的样品，并且添加酶切位点，依次点击

，将要点的样

添加到胶中，开始凝胶电泳分析。点样顺序依次为：1.Marker；2.载体；3.目的基因；4.重组载体。结果如图28：

图27

图28

进行电泳检测，通过比对(图29)就可以看出目的基因是否已经插入到载体中。

图29

结果分析： Marker我选择了如图27中所示，大小为10000多bP，但一直没搞明白为什么Marker只有一个条带；泳道二为载体酶切结果，由于EcoR I在载体中出现两次，所以会产生4个条带，我们需要的条带应该为5k-10k之间的两条；泳道三为目的基因的酶切结果，由于目的基因内部本身也存在一个EcoR I酶切位点，理论上应该为两条带，但结果多了一条；泳道四为重组载体的鉴定，理论大小为9000bp左右，淹没在杂带中了。

3.6 AMY1B蛋白的诱导表达及纯化 3.6.AMY1B蛋白的诱导表达

将构建好的载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（CaCl2方法制备感受态细胞）。挑取单克隆菌落接种于LB培养基中，37摄氏度摇荡过夜。转接扩大培养到理想状态，加入终浓度为1mmol／L的IPTG，37摄氏度诱导一定时间，AMY1B蛋白表达。 3.6.2蛋白纯化

蛋白质的纯化步骤： 1） 细胞破碎； 2） 盐析； 3） 疏水层析； 4） 离子交换层析； 5） 凝胶过滤层析； 6） SDS-PAGE电泳检测。

4.实验总结

本次实验利用Vector NTI软件虚拟设计了AMY1B基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达和纯化过程，涵盖了蛋白质表达、分离、纯化到鉴定的一系列方法技术。AMY1B蛋白经硫酸铵沉淀、疏水层析、离子交换层析和凝胶过滤层析等纯化技术得到纯化，最后用聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对纯化后的蛋白进行鉴定。通过和每一步纯化的电泳条带比对，我们可以看出是否有效的将杂蛋白除去。AMY1B基因的研究，能为现实生产生活奠定一定的基础。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/93qr.html