外源基因在不结球白菜转基因植株后代中的表达

外源基因在不结球白菜转基因植株后代中的表达

江苏农业学报（6%0"+#&6<()*+,<8/%<），（!）："%%"，!)##0#(

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外源基因在不结球白菜转基因植株后代中的表达

佘建明!，蔡小宁!，朱卫民!，张初贤!，朱

科学院蔬菜研究所，江苏南京"!%%!&）

祯"，袁希汉#，苏小俊#，李彬#

（!$江苏省农业科学院农业生物遗传生理研究所，江苏南京"!%%!&；北京!%%!%!；"$中国科学院遗传研究所，#$江苏省农业

摘要：应用农杆菌介导法将含有豇豆胰蛋白酶抑制剂基因和新霉素磷酸转移酶基因的重组质粒导入不结球白菜地方品种———“中脚黑叶”和“矮脚黑叶”中，获得抗虫转基因植株。卡那霉素抗性和抗虫性在转基因植株自交后代/!代植株中发生分离；在/"代中出现#种不同类型的株系：抗性纯合、杂合型和敏感性纯合株系。卡那霉素抗性和抗虫性在转基因植株自交后代中的表现基本符合孟德尔显性单基因的分离规律。从/"、/#、/&代中选择出抗虫性纯合株系，并获得一批对!0"龄鳞翅目小菜蛾、斜纹夜蛾幼虫的校正死亡率达(%1左右的单株。

关键词：不结球白菜；转基因植株；豇豆胰蛋白酶抑制剂基因；新霉素磷酸转移酶基因；抗虫性；卡那霉素抗性

中图分类号：2(#&$#%#$(

文献标识码：3

文章编号：!%%%’&&&%（"%%"）%!’%%##’%&

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不结球白菜（=,0##%/0/07?’#$,%#QQSY/4%"’"#%#

（俗称小白菜、青菜）属于十字花科芸薹属白W8X79?）

收稿日期："%%!’%(’!"

基金项目：国家“)(#”协作课题；江苏自然科学基金项目（*+"%%!!,-）作者简介：佘建明（!.&-’），男，江苏苏州人，大学，研究员，从事农业

生物技术研究。

菜类蔬菜，是中国南方周年栽种的大宗蔬菜，近年来北方地区种植面积逐渐扩大，超过"%^!%&F:"。虫害是不结球白菜生产的主要制约因子之一，以鳞翅目害虫———小菜蛾、菜白蝶（菜青虫）、菜螟和斜纹夜蛾等为主，造成不结球白菜年损失量达"%10

在害虫大发生年代甚至绝收。由于自然界缺#%1，

万方数据

外源基因在不结球白菜转基因植株后代中的表达

#)

江苏农业学报"**"年第!J卷第!期

乏抗虫种质资源，用常规育种方法开展不结球白菜抗虫育种工作难以奏效。

植物转基因技术的成功标志着分子生物学育种手段已步入实用化阶段，为创建不结球白菜抗虫新种质材料和培育抗虫新品种开辟了新的育种途径。由于不结球白菜离体培养植株再生频率偏低，农杆菌介导法基因转化体系不完善，影响了转基因研究工作的进展。随着离体培养和转基因技术的不断改

［!，"］进和完善，近年来应用农杆菌介导法已将豇豆

苷酸链为引物，进行G.7扩增，!A(:/H45I凝胶电泳

检测G.7结果。不结球白菜植株总E3(的G.7产物在!A(:/H45I凝胶电泳后，以#"G标记的!&’$基因片断制作探针，进行杂交。E3(转膜、探针标记、杂交22.洗脱以及胶片放射自显影等操作均按《分

［J］子克隆》方法进行。

"

#"!

结果

转基因植株自交后代卡那霉素抗性分析经过卡那霉素筛选、抗虫性鉴定和分子检测确

胰蛋白酶抑制剂基因、慈姑胰蛋白酶抑制剂基因、苏云金芽孢杆菌!"#$%基因导入不结球白菜，获得了

［#$%］

抗虫转基因工程植株，并通过有性生殖选择出

［"］抗虫性和卡那霉素抗性可遗传的单株。本研究将

证，抗虫转基因的当代（K*）工程植株中，有中脚黑叶矮脚黑叶=株，自交收获种子。K!代幼苗喷!"株；

洒!-%:;&的卡那霉素溶液，!*<左右部分植株的心叶转白色，并最终!%<后这些植株发育成白化苗，

死亡。具有卡那霉素抗性的正常绿色植株自交后收获种子。K"代幼苗喷洒!-%:;&的卡那霉素溶液，呈现出#种不同类型的株系：全部幼苗发育成绿色植株———卡那霉素抗性纯合型株系（图!）；全部幼苗发育成白化植株，最终死亡———卡那霉素敏感性纯合型株系；部分幼苗长成绿色植株，部分植株白化夭折———杂合型株系（图"）

。

在前期工作的基础上，进一步探讨外源基因———豇豆胰蛋白酶抑制剂（!&’$）基因和新霉素磷酸转移酶（()’*!）基因在不结球白菜转基因植株自交后代植株中的传递与表达。

!

!"!

材料与方法

供试品种

供试品种不结球白菜“中脚黑叶”和“矮脚黑叶”

由江苏省农业科学院蔬菜研究所提供。!"#

农杆菌菌株和质粒

农杆菌菌株为&’())*)。质粒+’,!"!-"携带

与豇豆胰蛋白酶抑制剂基./01#%2启动子和345#6，

因构建成植物表达质粒+7.&"8，并带有筛选标记基

［9，8］

。因———新霉素磷酸转移酶基因

!"$卡那霉素抗性筛选

当转基因植株自交后代的种子长出!$"片真

叶时，对幼苗喷洒浓度为!-%:;&的卡那霉素溶液，

!%<后观察统计绿苗和白苗数。!"%

抗虫性鉴定

取转基因植株自交后代植株的叶片，放入直径为=>?的培养皿中，分别投入!*条!$"龄的小菜蛾、斜纹夜蛾幼虫，于")@培养箱内培养#<后统计死亡的幼虫数，计算幼虫校正死亡率。

幼虫校正处理组死亡率C对照组死亡率

BD!**A

!**AC死亡率（A）

图!./01!

卡那霉素抗性纯合型株系

23435603789/:;</=>?@:@46A/:B;8/8=@:A;

卡那霉素抗性纯合型株系的植株自交后收获种子。其K#代幼苗喷洒!-%:;&卡那霉素溶液后，全

部植株为正常绿色植株。与此同时，来源于杂合型株系的K#代幼苗经!-%:;&卡那霉素处理后，绿苗与白苗继续发生分离。表明，卡那霉素抗性在转基因不结球白菜自交后代中的表达基本符合孟德尔显性单基因的分离规律。

!"&

’()*+,-杂交分析

选择具有卡那霉素抗性和抗虫性的转基因植株

提取总E3(。以从不结球白菜叶片中提取的总

万方数据人工合成的"#F+和"%F+寡聚核E3(为合成模板，

外源基因在不结球白菜转基因植株后代中的表达

佘建明等：外源基因在不结球白菜转基因植株后代中的表达

#D

图!"#$%!

卡那霉素抗性杂合型株系

&’(’)*+,$*-./#0’1#(234045,6#0)’.#.(406’

左：对照植株；右：其余%盆转基因当代植株。（!"）&’()：*+；,-./)：)0123.’2-45612)3-27)/’0(78057)3图8"#$%8

转基因当代（9:代）植株的抗虫性（9:）;0.’6()’.#.(406’*<()40.$’0#6=/40(.

!7!转基因植株自交后代抗虫性分析

在温室内连续分批释放菜白蝶，转基因当代（!"

代）工程植株表现出具有一定程度的抗虫性能（图#）。!$代中具有卡那霉素抗性的幼苗移栽定植

后，在田间自然条件下选择受虫害损伤较轻的单株

自交留种。

在中脚黑叶!9代中，取$"个具有卡那霉素抗

性的株系植株的叶片，室内人工饲喂$:9龄斜纹夜蛾幼虫，除极个别植株外均表现出一定程度的抗虫性能（表$）。以株系为单元分析发现，在具有卡那

表>

中脚黑叶转基因植株9!代具有卡那霉素抗性的株系对斜纹夜蛾的抗性

@’.#.(406’(*!"#$%&’()’*+"("4?)#6#-.#0(2’/#0’.1#(234045,6#0A)’.#.(406’*<9!=)*$’0,*<B2*0$C#4*2’#,’()40.$’0#6=/40(.株系代号

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测试株数!’3)’;5612)

幼虫校正死亡率

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株数A8<B’07(5612)

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霉素抗性的株系之间其抗虫性程度有明显差异；在同一株系内植株个体之间的抗虫性程度的差异也较大。大多数株系的幼虫校正死亡率为@GC>:

幼虫校正死亡率为%">:$"">的则被判为$"">，高抗虫株系。

在矮脚黑叶转基因植株中，!9:!%代幼苗均未喷洒卡那霉素溶液，室内人工饲喂$:9龄小菜蛾幼虫鉴定抗虫性，结果虽然得到了纯合型抗虫株系，其万方数据

但仍中高抗株系的幼虫校正死亡率为D9>:@%>，

有部分株系为杂合型，且有一定数量的植株不具抗虫性能。由此可见，卡那霉素筛选有利于及时淘汰敏感性植株，加速选育出抗虫性遗传稳定的材料。

综上分析，抗虫性在转基因不结球白菜自交后代中的表达同样基本符合孟德尔显性单基因的分离规律。

取!"、!$、!9、!#代具有卡那霉素抗性和抗虫性

外源基因在不结球白菜转基因植株后代中的表达

D2

江苏农业学报%00%年第-3卷第-期

［-0］

虫转基因植株。在不结球白菜抗虫转基因植株

植株的叶片为样品，以!"#$%&质粒为阳性对照，非转基因植株为阴性对照，抗性植’#"()*+杂交显示，

株和质粒都含有同一特异杂交条带（图,），这一结果验证了!"#$基因通过有性生殖过程能传递给后

代。

自交后代抗性分析中，我们亦得到相同的结果。由此可见，采用卡那霉素田间筛选方法，即节省了分子检测所需的昂贵费用，又减轻了生物学抗虫性鉴定和田间选育的工作量，有助于加速选择抗虫性遗传稳定的株系。

本试验中极个别具有卡那霉素抗性的植株并未表现出抗虫性能，推测是由于苗床上的幼苗相互覆盖而未喷洒到卡那霉素溶液所致。我们曾对处于抽

对照（非转化植株）；)*+；3：-.,：/0代转基因植株；1.2：&：!空白；-0.-2：!"#$%&；4：/-代转基因植株。

；&：-.,：/056789:;8<=!>7859；1.2：#?（8@856789:;8<=!>7859）!)*+；3：!"#$%&；4：A>78B；-0.-2：/-56789:;8<=!>7859C图!)*+,!

转基因植株的"#$%&’(杂交"#$%&’(-.-/01*12345-.1+6.*78/-.41

薹期的转基因不结球白菜自交后代的植株再次喷洒较高浓度的卡那霉素溶液，观察到少量植株的心叶和菜薹转白色，取这些植株的绿色叶片进行抗虫性鉴定，结果表明这些植株既不具有卡那霉素抗性也不具有抗虫性能。参考文献：

［-］蔡小宁，佘建明，朱

--,C

［%］王凌健，倪迪安，王光远，等E青菜组织培养和转化系统的初步

建立［F］（-）：C实验生物学报，-444，D%4D.41C

［D］佘建明，蔡小宁，朱［,］张智奇，周

祯，等E普通不结球白菜抗虫转基因植株

的获得［F］（%）：C江苏农业学报，%000，-2&4.3%C

音，钟维瑾，等E慈姑蛋白酶抑制剂基因转化小白

菜获抗虫转基因植株［F］（,）：C上海农业学报，-444，-1,.4E

［1］秦新民，高成伟E小白菜苏云金芽孢杆菌!&.$%基因的遗传转

化［F］（自然科学版），（D）：C广西师范大学学报-444，-&&&.3%C

［2］刘春明，朱［&］刘春明，朱

-20C

［3］G7HA6@@BF，I6<59=JKI，L78<75<9/CL@>;=M>76=>@8<8:，7>7A@675@6N

（%8O;O）［L］E*;PQ@6B：H78M7>#@>OG!6<8:R76A@6$7A@675@6N’6;99，-434C-02-C

［4］毛慧珠，唐

惕，曹湘玲，等E抗虫转基因甘蓝及其后代的研究

［F］（#辑），（,）：C中国科学-442，%2DD4.D,&C

［-0］佘建明，蔡小宁，朱卫民，等E结球甘蓝抗虫转基因植株及其后

代的抗性表现［F］（%）：C江苏农业学报，%00-，-&&D.&2E

祯，周兆澜，等E豇豆胰蛋白酶抑制剂抗虫基因烟祯，周兆澜，等E豇豆胰蛋白酶抑制剂=)*+在大

草的获得［F］（-3）：C科学通报，-44%，D&-24,.-24&C

肠杆菌中的克隆与表达［F］（%）：C生物工程学报，-44D，4-12.

祯，等E建立青菜（%&’(()*’*+),-,()(））农杆

D讨论

毛慧珠、佘建明等用卡那霉素筛选、室内人工饲

喂幼虫和分子检测方法，分别证明了苏云金杆菌杀虫蛋白基因、豇豆胰蛋白酶抑制剂基因可通过减数分裂过程传递给甘蓝转基因植株的子代，/-、/%、/D

代植株的卡那霉素抗性和抗虫性表现符合孟德尔单

［4，-0］

基因分离规律。本研究对不结球白菜转基因植

菌介导法基因转化体系［F］（%）：C江苏农业学报，-44&，-D--0.

株的自交后代/-、/%、/D、/,代的群体植株进行卡那霉素筛选、室内人工饲喂斜纹夜蛾和分子检测，试验结果同样表明豇豆胰蛋白酶抑制剂基因能通过有性生殖过程传递给后代，卡那霉素抗性和抗虫性在转基因植株自交后代中的表达基本符合孟德尔显性单基因的遗传规律。

带有标记基因———新霉素磷酸转移酶基因的抗虫基因作物，经卡那霉素筛选后，不仅在基因转化过程中能及时淘汰非转化植株，而且在转基因植株自交后代的整体植株水平上也能及时淘汰分离的敏感性植株。在结球甘蓝抗虫转基因植株自交后代抗性分析中，发现凡具有卡那霉素抗性的植株均具有一定程度的抗虫性。分子检测进一步确证它们均为抗

万方数据

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