实验一 小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定

实验一 小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定 实验方案：

匀浆 制备过氧化氢酶 盐析 透析 层析 纯度及分子测定（SDS-PAGE） 过氧化氢酶测定 蛋白含量测定（lowry法） 米氏常数测定（Lineweaver-Burk）双倒数作图法 （一）组织匀浆法制备过氧化氢酶粗提液

一、实验目的：掌握组织匀浆法和低温离心机的使用 二、实验原理：

1、在肝内过氧化氢被过氧化氢酶水解为水和氧 2、组织匀浆法: 机械切碎，破碎细胞

匀浆缓冲液:pH4.0醋酸缓冲液（水溶性物质），23.5%乙醇（脂溶性物质） 3、氯仿; Pr沉淀剂，CAT由于对氯仿的沉淀性大而不沉淀 4、离心：离心机 离心力 分离固液 三、实验步骤：

1、颈椎脱臼法处死6只小鼠，去肝脏，用滤纸洗干净血液后，每组称重6g

2、加入肝重8.5倍体积的预冷匀浆缓冲液（0.05mol/L pH4.0醋酸缓冲液，23.5%乙醇）,

组织捣碎机匀浆3-5min

3、慢慢滴加肝重0.5倍体积的氯仿（边加边搅拌），再次匀浆1min 4、匀浆夜离心，4℃6000rpm，30min后，弃沉淀，获上清液 5【、留样】取匀浆上清液60ul，加入20ul4×电泳上样Buffer，沸水浴3-5min，备SDS-PAGE

检测，-20℃冰箱保存。另取60ul匀浆后的上清液-20℃冰箱保存，用于酶活的测定和蛋白定量。

（二）盐析与透析法初步纯化过氧化氢酶

一、实验目的：掌握盐析与透析法的方法与原理 二、实验原理：

1、在Pr溶液中加入中性盐使Pr沉淀析出过程

2、盐酸沉淀原理 ： 中性盐破除水化膜、中和表面电荷，Pr溶解度降低而沉淀析出

3、透析:利用具有一定孔径的高分子物质不能透过的半透膜，分离生物大分子和小分子

的一种分离纯化技术

三、实验步骤：

1、 向肝匀浆上清液中缓慢滴加0.06倍体积的0.5M Na2SO4溶液，继续冰冰浴搅拌状态

下浴搅拌1h；

2、 将盐析溶液离心（4℃，6000rpm，10min）后弃上清液，保留沉淀；

3、 用肝重4倍体积的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.8）溶解沉淀（用手动玻璃匀浆器助

溶）10min，离心10（4℃4000rpm，10min）后，弃去沉淀，保留沉淀；

4、 留样：取盐析后上清液样品60ul，用20ul4*电泳Buffer制样，备用于SDS-PGE检

测，-20℃冰箱保存。

5、 将透析袋（截流量10-20KD，直径2公分）置于沸水中煮5min，清洗晾凉后备用。 6、 将上清液放入透析袋，（截流量10-20KD，直径2公分）内，置于透析液（20%乙

醇，0.1mol/L，pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/LNaCl溶液）中透析一周，中途更换一次透析液；

7、 一周后，取出透析袋内混浊溶液，离心（4℃6000rpm，10min）后，弃上清，收集

沉淀；

8、 用2ml~3ml的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH4.8）溶解沉淀15min（用手动玻璃匀浆器

助溶），离心（4℃4000rpm，10min）后，弃去沉淀，收获上清液。（测OD280，若蛋白浓度小于1mg/ml）

9、 留样：取透析后上清样品60ul，用20ul4*电泳Buffer制样，备用于SDS-PGE检测，

-20℃冰箱保存。

10. 将透析袋置于沸水中煮沸15min，清洗晾凉后备用

11 .将收获的样品液放入处理后的透析袋中，置于50%的甘油中包埋浓缩两个小时将样品浓缩至400-500ul收样，放置4℃

（三）凝胶层析法进一步纯化过氧化氢酶

一、实验目的： 二、实验原理： 三、实验步骤：

1、凝胶的处理：每组取2.5g sepadexG-200葡聚糖凝胶干粉，浸泡与蒸馏水充分膨胀倾

斜法除去表面的悬浮小颗粒，替换等体积磷酸缓冲液（0.1mol／L,pH7.8），继续浸泡一天

2、装柱：取层析柱一支，将层析柱出口接上乳胶管，在柱底部填上一层海绵垫。将层 析柱将垂直夹与铁架上，将层析柱下端额止水架夹紧，向柱中加入约5-7cm高的缓冲液，用细玻璃棒将凝胶颗粒搅成悬液，顺玻璃棒缓缓倒入层析柱。当凝集颗粒沉积约2cm高时，开启止水夹子使缓冲液缓缓流出，同时继续倒入凝胶悬液，掌握倒入速度，使其与缓冲液流出速度大体相同，直至凝胶床高达35cm时为止。关闭止水夹子，要求凝胶床要均匀，中间要连续，不得有气泡，表面要平整。 3、平衡：打开层析柱口，控制流速为0.3-0.5mL／min（约5-10滴／min），用磷酸缓冲液（0.1mol／L,pH7.8）流洗平衡20min。凝胶管柱上端平衡液应始终不少于10cm 的

高度不得出现干胶和断层，应保持凝胶面平衡 4、浓缩样品（前次实验已经操作）

5、加样：打开层析柱口，使缓冲液缓缓流出，当液面与凝胶床表面齐平时，关上出口。

用吸管吸取待分离的浓缩后的样品溶液400-500ul，在接近凝胶床表面处沿层析柱内壁缓缓加入。打开层析柱口，使样品溶液进入柱床（开始收集）。待样品液恰好完全进入凝胶上端内面时，立即用滴管沿层析柱内壁加入少量磷酸缓冲液小心冲洗管壁上的蛋白质，然后再加入磷酸缓冲液至距凝胶柱表面约4cm高。 6、洗脱：洗脱过程中不断加入磷酸缓冲液（0.1mol／L,pH7.8），保持0.3-0.5mL／min（约5-10滴／min）的流速，洗脱速度不可过快，以防样品带扩散。 7、收集及检测：样品进胶开始，用试管收集流出液，。收集管依次在407nm和280nm波长下，以磷酸缓冲液（0.1mol／L,pH7.8）调零，测定各管吸光度值。以管号为横坐标吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线

8、收获纯化产物：合并收集OD407nm和OD280nm重叠峰值管，再次测定OD407nm和OD280nm波长下的吸光度值即为最终得到的纯化产物

9、留样：取2mL纯化产物存样备用于蛋白浓度及Km至测定，放置4℃冰箱保存. 10、留样：取浓缩后的层析纯化样品60ul，用20uL4×电泳上样Buffer制样，备用于

SDS-PAGE检测，-20℃冰箱保存放置。

四、实验结果

层析后蛋白吸光变化曲线0.450.40.350.30.250.20.150.10.05012345678910111213141516171819202122232425262728293031管号吸光值

（四）SDS-PAGE法测定纯化的过氧化氢酶分子量

一、实验目的： 二、实验原理：

1、电泳：带点粒子在电场中的泳动 条件：带电粒子 、电场 、介质

影响因素：1）电场强度 2）带电粒子情况 3)带电粒子形状4）带电粒子分子量

2、SDS-PAGE：上样缓冲液的成分1）溴酚蓝：指示剂 2）油：比重剂

3）β-巯基乙醇：破坏蛋白二硫键4）SDS：破坏蛋白氢键和疏水键

3、测分子量：lgMW=A-BRf Rf=过氧化氢酶的迁移率/溴酚蓝的迁移率 三、实验步骤：

1、凝胶的制备（由实验室老师完成，包括装板、配胶、凝胶液的灌注和聚合） 2、蛋白质样品的处理：将样品放在沸水中煮沸5min

3、加样：在垂直板型电泳装置的两个槽内加电极缓冲液，必须使缓冲液高于电极，然后用微量注射器分别在各个样品槽中加样，匀浆液加15ul，盐析液和透析液加30ul

4、电泳：上槽接负极，下槽接正极，打开直流电源，刚开始电流控制在15-20mA电

泳15min后再升到50mA,保持电流强度不变，待指示剂溴酚蓝迁移至下沿约1-1.5cm处，停止电泳，需h

5、剥胶和固定：电泳结束后取下凝胶管，用带有细长针头的注射器吸满蒸馏水，插入

凝胶柱与玻璃管内壁之间，轻轻旋转玻璃管，一面注入蒸馏水，一面推针呈旋转式前进，是凝胶柱与管壁脱离

6、染色：将凝胶浸入染色液（0.1%考马斯亮兰R-250，40%甲醇和10%的冰醋酸）中，

染色0.5h，弃去染色液

7、脱色：加入脱色液（10%甲醇和10%的冰醋酸），脱色1-3h，期间更换2-3次脱色液，

然后将胶浸泡脱色液中过夜，至背景透明清楚后为止 8、测量和数据处理 四、实验结果：如图所示

（五）过氧化氢酶米氏常数的测定 一、实验目的：学会滴定的方法和Km值的测定 二、实验原理：

1、V=Vmax［s］/Km+［s］ 1/V=Kmax/Vmax［s］+1/Vmax

2、2H2O2 2H 2O +O2(反应学原理)

剩余的用KMnO4滴定：2 KMnO4+5 H2O2+3 H2SO4 2MnSO4 + K2SO4+5O2+8H 2O 在酸性环境下（硫酸）紫红色变为滴定终点的微红色，记录滴定用的ml数，取平均值计算H2O2的准确摩尔浓度。求出反应前后的浓度差及反应的速度（V），以1/［s］为横坐标，1/V为纵坐标作图可求出酶的H2O2Km值 三、实验步骤：

1、稀释样品 匀浆：4ul匀浆 +4mlPBS 层析：2ul层析+1mlPBS 2、取6个50ml干燥的锥形瓶，编号后按下表操作

所加试剂（ml） H2O2溶液 蒸馏水 匀浆稀释样品 1 2.5 0 0.5 2 2 0.05 0.5 3 1.5 1 0.5 4 1 1.5 0.5 5 0.5 2 0.5 6(层析稀释品) 1.5 2.5 0.5 要求：试剂加入准确而迅速，立即摇匀。加入试剂10min后到时立即加入25% H2SO42.0ml，边加边摇匀，终止酶促反应

3、滴定：用标准的0.002mol/L KMnO4滴定，记录个瓶消耗的KMnO4ml数 4、计算：如表格所示 项目 ①加入H2O2数 ②KMnO4的用量 ③加入H2O2的mmol数①×0.4 ④剩余H2O2的mmol数×②0.002×0.5 ⑤反应速度③—④ ⑥反应底物浓度［s］③÷3 ⑦1/V=1÷⑤ ⑧1/［s］=1÷⑥ 1 2.5 15.30 0.1 0.0765 0.0235 0.033 42.55 30 2 2 11.60 0.08 0.058 0.022 0.0267 45.45 37.45 3 1.5 9.60 0.06 0.048 0.012 0.02 83.33 50 4 1 6.20 0.04 0.031 0.009 0.0133 111.11 75.19 5 0.5 3,10 0.02 0.0155 0.0045 0.0067 222.22 149.25 6 1.5 9.26 0.06 0.04625 0.01375 0.02 72.72 50

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