亲和层析原理和步骤

亲和层析 Affinity Chromatography

一、原理

亲和层析是利用生物大分子所具有的专 一亲和力而设计的纯化技术 寻找配基 配基固定化 制成亲和层析柱

基本过程

固相化

+

吸附+ + 洗 脱

解吸+

载体

样品 固相化

再生

常见具有专一性亲和力的生物分子对：酶： 抗体： 细胞： 核酸： 激素或药物： 外源凝集素： 基质类似物，抑制剂，辅酶 抗原，病毒，细胞 细胞表面特异蛋白，外源凝集素 互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶 受体，载体蛋白 多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞

(一) 载体的选择1、载体要求： (1)不溶性 (2)渗透性：疏松网状结构，有良好的液 体流动性 (3)化学和机械性能稳定 (4)具备大量能被活化的基因 (5)抗微生物和酶的侵蚀

2、常用载体(1)纤维素 特点：价廉、来源充足 纤维性、非均一性限制大分子的掺入 非专一性吸附严重 用于抗体和酶的纯化 (2)葡聚糖凝胶

特点： 化学及物理性质稳定多孔性比琼脂糖低

(3)琼脂糖凝胶

浓度 商品 2% Sepharose 2B 4% Sepharose 4B 6% Sepharose 6B

凝胶浓度越低结构越疏松 机械强度越低

(4)聚丙烯酰胺凝胶

特点：物理化学性质稳定抗微生物侵蚀能力比琼脂糖强 可供化学反应的酰胺基较多 (5)多孔玻璃 特点：不受微生物的侵蚀 耐酸、碱、有机溶剂 表面非专一性吸附

(二)配基的选择

1、对于欲纯化的物质应有专一亲和力 2、必须具备能被修饰的功能基团

以酶和底物为例：KL

KL:解离常数 E: 酶 L: 底物 EL:复合物

E+L EL KL =[E][L]/[EL]=[E0-EL][L0-EL]/[EL] E0、L0:起始浓度 当L0》E0时 KL =[E0-EL][L0]/[EL] [EL]=[E0-EL][L0]/ KL Kd=结合酶/游离酶=[EL]/[E0-EL]=[L0]/ KL

(三)固相化——将配体以共价键连接于固相基

质上制成固相化吸附剂

载体的排斥效应 载体的空间障碍

二、亲和层析分离 1、装柱和平衡 2、上样、亲和吸附 3、洗脱无效洗脱 吸附效率不高 有效吸附

洗脱方法(1)非特异性洗脱：改变

洗脱液pH值离子强度

梯度洗脱(2)特殊洗脱：当蛋白吸附紧密或上述方法洗脱 会引起失活，可用专一的化学方法裂解配基与载 体的连接键，再用透析或凝胶层析法去除配基。 断键方法：硫酯键、偶氮键、二硫键 (3)专一性洗脱

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