于淼 药学 中国林蛙抗菌肽改造肽的抗癌活性筛选

Liaoning Normal University 本科生

题 目：学 院：专 业：班级序号：学 号：学生姓名：指导教师：

（2012届）

毕业论文(设计)

中国林蛙抗菌肽改造肽的抗癌活性筛选化学化工学院 药学 6班22号 20081153020024 于淼 王澈

2012年5月

目 录

摘要 ................................................................................................................................ 2 Abstract ........................................................................................................................... 2 Key Words:....................................................................................................................... 2 前言 ................................................................................................................................ 2 1抗菌肽概述................................................................................................................... 2 1.1抗菌肽的改造 ............................................................................................................ 2 1.2抗菌肽的影响因素..................................................................................................... 2 2材料与方法................................................................................................................... 3 2.1材料、试剂、仪器..................................................................................................... 3 2.1.1实验材料................................................................................................................. 3 2.1.2实验试剂................................................................................................................. 3 2.1.3实验仪器................................................................................................................. 3 2.2 方法 .......................................................................................................................... 3 2.2.1 Temporin-1CEa类似物的改造设计 .......................................................................... 3 2.2.2 采用CD光谱测定几种改造肽的α螺旋含量测定 .................................................. 3 2.2.3 通过高效液相色谱测定保留时间来表征改造肽的疏水性。 ................................. 3 2.3.2几种改造肽的α螺旋含量....................................................................................... 7 2.3.3 保留时间来表征改造肽的疏水性 ........................................................................... 7 2.3.4比较Temporin-1CEa及其改造肽对MCF-7细胞增殖的抑制率。............................. 9 2.3.5比较Temporin-1CEa及其改造肽对人红细胞的溶血率。 ...................................... 10 2.4讨论......................................................................................................................... 11 参考文献： ................................................................................................................... 13 致谢 .............................................................................................................................. 14

摘要：

为了研究中国林蛙的Temporin-1CEa改造肽的抗癌活性筛选，主要对Temporin-1CEa进行氨基酸残集替换增强其正电荷性，采用CD光谱测定几种改造肽的α螺旋含量测定，通过高效液相色谱测定保留时间来表征改造肽的疏水性，利用MTT方法检测并比较Temporin-1CEa及其类似物对MCF-7细胞增殖的抑制率检测，采用溶血实验检测并比较Temporin-1CEa及其类似物对人红细胞的溶血率检测。由以上方法可得到抗癌活性好，对人红细胞无毒的抗菌肽，具有一定的研究价值和实际意义。

关键词：

抗菌肽；Temporin-1CEa；抑制作用

Abstract:

Filter for Chinese forest frog Temporin-1CEa transformation of peptide anti-cancer activity, Temporin-1CEa replace amino acid residues set to enhance its positive charge, Determination of CD spectra measurement of several modified peptides of the α-helix content, To characterize the transformation of hydrophobic peptides by high performance liquid chromatography retention time, MTT assay and compare Temporin-1CEa and its analogs on MCF-7 cell proliferation inhibition rate detection, Hemolytic assay and compare the detection of Temporin-1CEa and its analogues on human red blood cell hemolysis rate. Anticancer activity can be obtained by the above method , non-toxic antimicrobial peptide human erythrocytes , Have certain research value and practical significance.

Key Words:

Anticancer Peptides; Temporin-1CEa; the inhibition effect

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前言

1抗菌肽概述

抗菌肽自1972年发现以来，一直受到人们的广泛重视。它在自然界中极其广泛地存在，从微生物、昆虫、动物、植物中，人们已经发现了超过1500种抗菌肽[1]。抗菌肽的作用也是非常的广泛，不仅可以抑制、杀灭细菌，而且具有抗病毒、抑制肿瘤细胞生长、免疫调节等作用[2]。另外，由于抗菌肽特殊的作用机制，其杀灭细菌时，不易诱导细菌产生抗药性[3]。这些使得抗菌肽极有可能在未来成为一种代替抗生素的理想新药[4]。然而，大多数天然存在的抗菌肽抗微生物的活性较差，很难达到药用的要求。要提高其生物学活性，对其分子结构进行改造是一个可行的方法[5]。

1.1抗菌肽的改造

抗菌肽N端富含亲水性氨基酸残基，如赖氨酸、精氨酸；C端富含疏水性氨基酸残基，如丙氨酸、甘氨酸，且通常酰胺化。这种两亲性是抗菌肽具有抗菌活性的关键原因之一。不同功能的抗菌肽含有的疏水氨基酸残基比例却大致相同，约为41%-49% 绝大多数抗菌肽第二位氨基酸残基是色氨酸，中间富含脯氨酸，多数氨基酸有由半胱氨酸构成的二硫键[6]。在某些特定位点，不同的抗菌肽也会表现出高度的一致性，这是某些抗菌肽具备抗菌活性所必不可少的。Wang等通过对抗菌肽数据库APD里收录的525种抗菌肽的分析研究，发现97%的抗菌肽包含50或更少数目的氨基酸残基，平均长度为18个[7]。其中最长的抗菌肽(AP00404)包含84个残基，而最短的抗菌肽(AP00027)仅有6个残基。抗菌肽的二级结构极其多样，仅从这个方面对其分类是非常困难的，但我们仍可大致将其分为四类：含有线性α-螺旋结构的抗菌肽，含有若干二硫键维持的β-折叠抗菌肽，含伸展片层结构的抗菌肽和环形抗菌肽对已知抗菌肽的统计结果表明，具有α-螺旋结构的占抗菌肽总数的14.63%，具有β-折叠结构的占0.76%，同时具有α-螺旋和β折叠结构的占2.28%，富含稀有氨基酸的抗菌肽占10.07%，而具有二硫桥的抗菌肽占32.31%，其余39.92%为未知结构的抗菌肽[8]。

1.2抗菌肽的影响因素

抗菌肽的生物活性是由其分子结构所决定的[9]。目前为止，大量抗菌肽的结构-活性分析研究揭示出了它们之间的一些关系[10]。研究表明，抗菌肽的正电荷数、两性分子结构、保守序列、α-螺旋、二硫键、铰链结构等是影响其活性的重要因素。大多数抗菌肽带正 电荷，细菌的外膜带负电荷 ，抗菌肽通过静 电吸引作用结合到细菌表面。所以，阳离子特性是绝大多数抗菌肽具有抗菌活性所必需的，正 电荷有助于低浓度抗菌肽在膜表面富集达到有效杀菌浓度 ，正电荷的多少则直接影响其抗菌活性的强弱。但抗菌肽正 电荷数和抗菌活性间也无绝对正相关性 。有实验表 明[11]，当正 电荷增加到一定数 目之后，继续增加正电荷数，抗菌活性就不再增加。这可能是因为正电荷过多使抗菌肽牢固结合在磷脂头部，从而降低了其穿膜效率；同时正电荷数超过一定临界值导致抗菌肽分子间静电斥力强于其与膜的静电引力 ，阻碍膜上抗菌肽分子的聚集和 穿膜孔道的形成，最终表现为膜裂解能力即抗菌活性下降。因此增加带正电荷氨基酸的数量,有助于提高杀菌活性。疏水肽对抗菌肽的影响是指抗菌肽含有约50 %的疏水氨基酸残基,其活性是亲水基团和疏水基团相互作用的结果[12]。疏水作用对其活性的

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影响是通过改变肽链中Leu、Ile、Val 数量实现的。由于疏水基团的存在,肽链在溶液中可以通过疏水作用形成多聚体,增加了对真核细胞膜的亲和力;同时也增加了抗菌肽形成两性α- 螺旋的能力,而α- 螺旋的增加也提高了抗菌肽的稳定性 。但是增加分子的疏水性,抗菌肽的抗菌活力和对哺乳类动物细胞的溶血活性同时增加,这是由于疏水基团在抗菌肽插入细胞膜的过程中起关键作用。Ayman H 等发现,肽链疏水面的正电荷可能对抗菌肽的溶血活性有重要影响,他们将一种抗菌肽RTA3 疏水面的Arg 替换为不带电荷的Leu ,结果大幅增加了抗菌肽的溶血活性[13]。

2材料与方法

2.1材料、试剂、仪器

2.1.1实验材料：中国林蛙(Rana chensinensis)皮肤抗菌肽Temporin-1CEa及其类

似物（LK1，LK2(5)，LK2(6)，LK3）（上海吉尔生化有限公司），MCF-7细胞,人类血红细胞,三氟乙醇（TFE），十二烷基磺酸钠（SDS）

2.1.2实验试剂：生理盐水，蒸馏水，胎牛血清（Gibco公司），胰蛋白酶（Gibco公司），DMSO（沈阳联邦试剂公司），MTT（Sigma公司），DMSO，0.1%TFA 超纯水溶液、0.1%TFA 乙腈溶液；（深圳市佳德宇化工有限公司）。

2.1.3实验仪器：倒置显微镜，酶标仪，CO2培养箱，荧光酶标仪（Thermo）；Jasco-810

型圆二色光谱仪；UV-7504PC型紫外可见分光光度仪（上海欣茂仪器有限公司）；FA2004型分析天平（上海天平仪器厂）；恒温水浴锅, 超净工作台，高速台式冷冻离心机，

2.2 方法

2.2.1 Temporin-1CEa类似物的改造设计

由于Temporin-1CEa的阳离子性较弱，并且对红细胞的毒性作用较强。所以通过赖氨酸（K）替换Temporin-1CEa中的中性氨基酸残基，以及带负电氨基酸残基以增加阳离子性，并且相对改变疏水值。

2.2.2 采用CD光谱测定几种改造肽的α螺旋含量测定

参照Conlon J M等人的方法，将抗菌肽temporin-1CEa及其类似物样品分别溶于水、30mM SDS的水溶液、50%（v/v）三氟乙醇（TFE）的水溶液，使样品终浓度达到0.3 mg/mL。圆二色光谱测定采用Jasco-810型圆二色光谱仪，石英样品池光程为1 mm，灵敏度为100mdeg，分辨率为0.5 nm , 狭缝为3 nm , 时间常数为0.25 sec。扫描波长范围为190~240 nm，扫描速率为500nm/min，在25℃下进行测定。

2.2.3 通过高效液相色谱测定保留时间来表征改造肽的疏水性。

将DEAE-cellulose柱后收集到的各峰分别以0.25μm孔径的滤膜过滤备用。

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三蒸水为脱洗液，以0.25μm孔径的滤膜过滤。色谱柱为TSK-G5000PW，柱温25℃，0.5ml/min恒流洗脱40min，最大保护压力1.0Mpa，进样量20μl，样品浓度10mg/ml。蒸发光散射检测器，气化温度45℃，压力3.5Mpa[11]。

2.2.4 利用MTT方法检测并比较Temporin-1CEa及其类似物对MCF-7细胞增

殖的抑制率检测。

1.选取人乳腺癌细胞MCF-7，Temporin-1CEa及其改造肽为实验材料； 2.将MCF-7细胞消化，稀释，接入96孔板，每孔100μL细胞液，细胞密度为5×104，37℃细胞培养箱中，24h贴壁培养；

3.加入

0.1%TFA

溶解的肽溶液，使其终浓度分别为

2.5μM,5μM,10μM,20μM,40μM,60μM；

4.过1h后，加入MTT试剂，每孔10μL，遮光处理4h； 5.弃去每孔液体，加入150μL DMSO溶液； 6.使用酶标仪，在492nm处测出吸光度值。

2.2.5 采用溶血实验检测并比较Temporin-1CEa及其类似物对人红细胞的溶

血率检测。

1. 抽取约3ml血液，静置过后分层，用吸管吸取上层血浆以及白细胞。加入等渗的生理盐水，约10倍量，摇匀，1500r/min离心约10分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用生理盐水按上述方法洗涤3-4次，直至上清液不显示红色为止，取所用的红细胞的体积，加入生理盐水，配制成2%的红细胞悬液。 2. 用生理盐水将抗菌肽配制成20mM 的母液备用。

实验中：用生理盐水逐级稀释抗菌肽，使抗菌肽的终浓度为400μM，200μM,,100μM,50μM,25μM； 按下表所示体积加入各试管

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试管号 终浓度（μM） LK1-1 LK1-2 LK1-3 LK1-4 LK1-5 阳性对阴性对照 照 25 50 100 200 400 5 995 1 10 990 1 20 980 1 40 960 1 20mM肽溶液2.5 （μl ） 生理盐水（μl） 997.5 2%红细胞悬液1 （mL） 蒸馏水1000 1ml 1 1 改造肽LK2（5），LK2（6），LK3以及Temporin-1CEa依次编号；

3.取洁净试管若干，依次按编号加入试验材料； 4.37℃水浴孵育1h

5.结果观察：将水浴孵育的各管溶液取上清，在分光光度计上，540 nm附近处，以蒸馏水为空白读取各管的OD值。

结果判断：用下式计算各试验管的溶血率％。

溶血率（％）＝（试验管吸光度－阴性对照管吸光度）/(阳性对照管吸光度－阴性对照管吸光度) ×100％[20]

2.3 结果与讨论

2.3.1 Temporin-1CEa类似物的设计

表2-1：Temporin-1CEa及类似物的序列

Temporin-1CEa螺旋轮模型

电氨基酸序列 荷数 Temporin-1CEa +3 FVDLKKIANIINSIFGK-NH2 LK1 +4 FVDLKKIANIINSIFKK-NH2 +5 FKDLKKIANIINSIFKK-NH2 LK2（5） +6 FVKLKKIANIINSIFKK-NH2 LK2（6） LK3 +7 FKKLKKIANIINSIFKK-NH2 分子量平均疏MW（Da） 水性 1905.3118 1990.48 2019.52 2003.57 2032.61 11.3 11.4647 10.8412 11.5353 10.9118 两亲性

0.744 0.750 0.755 0.750 0.750 页 第5

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LK1螺旋轮模型 LK2(5) 螺旋轮模型

LK2(6) 螺旋轮模型 LK3螺旋轮模型

图2-1：Temporin-1CEa及类似物螺旋轮模型

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2.3.2几种改造肽的α螺旋含量

LK1的CD色谱图 LK2(5)的CD色谱图

120120H2O100H2O 10080 80 TFE 50%TFE 50% 6060 404030mM SDS30mM SDS 2020

00190200210220230240250 190200210220230240250-20-20

-40-40

-60-60

-80 -80

wavelength(nm)wavelength(nm)LK2(6) 的CD色谱图 LK3的CD色谱图 140120 H2O120H2O 100100TFE 50% TFE 50?80 30mM SDS6060 30mM SDS4040 20 200190200210220230240250 0-20190200210220230240250

-20-40

-60-40

-80-60 wavelength(nm)CD(mdeg)wavelength(nm)图2-2：类似物α螺旋含量

改造肽LK1，LK2(5)，LK2(6)，LK3的CD色谱图显示：

1、在模拟细胞膜表面结构的50%TFE水溶液中的CD谱显示—— 190nm附近存在一个正峰，同时208nm和222nm附近存在两个负峰，这是代表α-螺旋结构特点的光谱图；

2、在模拟细菌细胞膜表面结构的30mM SDS水溶液中的CD谱显示-190nm附近存在一个正峰，同时208nm和222nm附近存在两个负峰，这是代表α-螺旋结构特点的光谱图；

3、而在纯水溶液中的CD谱显示-在波长很短的地方出现单峰，在198nm附近有一负峰，这表明肽以不规则卷曲的结构存在；

2.3.3 保留时间来表征改造肽的疏水性

洗脱条件：A液：0.1%TFA 超纯水溶液 B液：0.1%TFA 乙腈溶液

40分钟内B液从20%上升到50%

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CD(mdeg)CD(mdeg)CD(mdeg)

mAU100200100150mAUmAU

-5050000055-100190 nmvydac2012-1-4-4.dat1000

温度25℃

LK1 25.5150 LK2（5） 20.7635 Temoporin-1CEa 25.5178 0Retention TimeRetention TimeRetention Time1: 214 nm, 8 nmvydac2012-3-9-26.dat1: 214 nm, 8 nmvydac2012-3-9-0.dat551423.0555.028.0731090.011411333.1827.1840.2234.246027.298569.2112.3375.3677.3793.1934762954.4747.04.35215595.25.8356.5927.29631103.979.013872.9145.1137619.590101515101015中国林蛙抗菌肽改造肽的抗癌活性筛选

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2020MinutesMinutes20Minutes25.51526.73127.45629.81331.7333025912.41004.41935377.4139.41415.263597.15.161101276.6175769810.715179330.27.1717.9848184588.48.1113953.39.190.0230629373.02407.0261.12521.523190.2212143.72.2223932.2314.3223.80824.27725.0772525303033.48395053043.66.35355134.17.373540353539.339404000050-50100100200100150-100mAUmAUmAU

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LK2（6） 21.3747 1: 214 nm, 8 nmvydac2012-3-9-28.dat150150Retention Time100100mAU505000-50-5005101520Minutes25303540mAU LK3 17.9547 2001: 214 nm, 8 nmvydac2012-3-9-30.dat200 Retention Time100100mAU0005101520Minutes25303540mAU 图2-3：保留时间来表征改造肽的疏水性

Temporin-1CEa及其改造肽的保留时间从大到小顺序依次为： Temporin-1CEa，LK1，LK2（6），LK2（5），LK3

2.3.4比较Temporin-1CEa及其改造肽对MCF-7细胞增殖的抑制率。

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120Temporin-1CEaLK1LK2(6)LK310080cell viability(%)60402002.5510204060peptide concentration(μM)

图2-4：比较Temporin-1CEa及其改造肽对MCF-7细胞增殖的抑制率

通过软件计算，得出四种改造肽的IC50值为：

肽 IC50（μM） LK1 21.16 LK2（5） 44.84 LK2（6） 14.49 LK3 29.70 表2-1:四种类似物的IC50值

四种改造肽中电荷为+6的LK2（6）的IC50值最小,并且LK1以及LK2(6)的IC50 值均小于模板肽Temporin-1CEa的IC50值。能说明电荷对于阳离子抗菌肽抑制MCF-7的生长有一定的影响。

2.3.5比较Temporin-1CEa及其改造肽对人红细胞的溶血率。

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140Temporin-1CEaLK1LK2(5)LK2(6)LK3120100溶血率（%）8060402002550100肽浓度（μM）200400

图2-5：比较Temporin-1CEa及其改造肽对人红细胞的溶血率

以上结果表明，四种改造肽的溶血活性均小于模板肽Temporin-1CEa。

浓度（μM）

25 50 100 200 400

Temporin-1CEa及其改造肽溶血率 Temporin-1CEa LK1 LK2(5) 7.304906 4.637337 0.35672 60.06858 5.511849 2.03775 123.2985 7.24115 4.43825 126.3556 8.620618 5.7531 132.8807 23.87753 18.0856

表2-3四种改造肽的溶血活性 LK2(6) 2.49703 3.65331 5.86857 8.02437 21.0703

LK3 0.11891 1.49837 3.29746 5.15341 9.40297

以上结果表明，四种改造肽的溶血活性均小于模板肽Temporin-1CEa，并且四种改造肽在抑癌浓度范围（IC50值）内，除改造肽LK1的溶血率大于5%，其他三种改造肽的溶血率在此范围内均小于5%[19]。

2.4讨论

抗菌肽的发展目标是优化的疏水性，最大限度地减少真核细胞的细胞毒性，并最大限度地发挥抗菌活性，这反过来又优化治疗效果[14]。在抗菌和溶血活性方面疏水性作用和净正电荷有重要性。此外，我们已经证明，疏水性有一个临界值，可取得最佳的抗菌活性[15]。也就是说，减少对非极性面肽的疏水性，能降低抗菌的活动；同时增加肽的净正电荷，提高抗菌活性直到达到最佳，进一步提高疏水

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性超出最佳范围，就会减少抗菌活性[16]。

本文研究以Temporin-1CEa为模板，对其阳离子性进行改造，成功的设计了4种Temporin-1CEa的类似物：LK1，LK2(5)，LK2(6)，LK3。其中LK2(6)最好，IC50值最低溶血活性很小，净正电荷是多数天然抗菌肽的重要特征,是影响其与膜上基团识别结合的关键[17]。多数致病菌和病变细胞的细胞膜呈电负性,在抗菌肽穿膜过程中,一般认为抗菌肽首先通过静电相互作用结合在膜上,随后疏水结构域插入到膜中,或破坏膜,或形成离子通道,致细胞死亡[18]。

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ass ociati on and biol ogical activity ofmultip le subunit small p roteins . J Biol Chem, 1995,270 (3) : 1048-1056

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中国林蛙抗菌肽改造肽的抗癌活性筛选

致谢

本研究及毕业论文是在王澈老师的亲切关怀和悉心指导下完成的。王老师严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我，鼓舞我在今后的学习中刻苦钻研，开阔思路。在论文完成之际，感谢王老师这几个月来的关心和帮助。同时感谢学姐周扬在学业上给我以精心指导，无论是专业知识，还是实验技术，都给了我非常大的帮助，在此谨向她们致以诚挚的谢意。我还要感谢毕业论文组同学们的鼎立相助，在此对他们表示深深的谢意！ 最后，再次对关心、帮助我的老师和同学们表示衷心地感谢！

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中国林蛙抗菌肽改造肽的抗癌活性筛选

致谢

本研究及毕业论文是在王澈老师的亲切关怀和悉心指导下完成的。王老师严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我，鼓舞我在今后的学习中刻苦钻研，开阔思路。在论文完成之际，感谢王老师这几个月来的关心和帮助。同时感谢学姐周扬在学业上给我以精心指导，无论是专业知识，还是实验技术，都给了我非常大的帮助，在此谨向她们致以诚挚的谢意。我还要感谢毕业论文组同学们的鼎立相助，在此对他们表示深深的谢意！ 最后，再次对关心、帮助我的老师和同学们表示衷心地感谢！

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