紫云英根瘤菌的分离与鉴定

福建农业学报２７（５）：５２４～５３２，２０１２

Ｆ旬ＪａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅｓ

文章缩号：１００８－－０３８４（２０１２）０５—５２４一０９

臂凤贞，钟少杰，邱宏螬，辱．紫云英根瘸菌的分离与鉴定［Ｊ３．福建农业学报。２０１２，２７（５）；５２４－－５３２．

ＧＵＡＮＦ－Ｚ。ＺＨＯＮＧＳ－Ｊ．ＱＩＵＨ—Ｄ，ｅｔ８１．ＩｓｏｌａｔｉｎｇａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＲｈｉｚｏｂｉａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓｔ２０１２，２７（５）Ｉ

５２４—５３２．

ｓｔｒａｉｎＪ

ｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｉｌｋ

Ｖｅｔｃｈ［刀．ＦｕｊｉａｎＪｏｍ＇ｍａｌｏｆ

紫云英根瘤菌的分离与鉴定

管凤贞１’２，钟少杰３，邱宏端２，林戎斌１，张

（１．福建省农业科学院土壤肥料研究所，福建福州

福建福州

辉１，陈济琛１，林新坚１

３５０００３｝ｚ．福州大学生物科学与工程学院，

３５０１０８；３．福建农林大学生命科学院。福建福州３５０００２）

摘要：从采自福建各地紫云英的根瘤中分离出具有一般根瘤菌特征的菌株１８株，在对其进行初步细菌学特性鉴定的基础上，利用１６ＳｒＤＮＡ进行序列分析，确定其系统发育地位。鉴定结果为。ＹＸ、７．３、ＧＺ与ＺＫｌ为中慢生根瘤菌属Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ菌种，Ｂ３、ｘＺ、Ｍ６与百脉根中生根瘤菌Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｏｔｉ可能为同一菌属的不同变种；ＺＬＨ２为黄单孢菌属Ｘａｎｔｈｏｎｍｎａｓ菌种；Ｍ３、Ｍ１０、ＺＫ７、ｚＱＨ、Ｂ４、Ｂ７为土壤杆菌属Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌种，Ｂ６、Ｂ５、Ｂ１、ｚ１为根瘤菌属Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ菌种。为了进一步考察各鉴定菌株的结瘤情况，利用琼脂试管法和水堵法将部分菌株与紫云英闽紫品种（１号、５号、６号、７号）和８０４１０４１１品系进行配对结瘤，研究结果不仅进一步阐明了紫云英根瘤菌的系统发育多样性，并且通过对比琼脂试管法和水培法在结瘤结果上的异同，为探究紫云英与不同根瘤菌结瘤能力的差异提供了一种简便可行的研究方法。

关羹词：紫云英根癯菌；分离；１６ＳｒＤＮＡ；鉴定’琼脂试管法；水培法；结癯

中圈分类号：Ｓ１４４．３

文献标识码：Ａ

ＩｓｏｌａｔｉｎｇａｎｄＩｄｅｎＵｆｌｃａｔｉｏｎｏｆＲｈ担ｏｂｉａｌｓｔｒａｉｎｓｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｉｌｋＶｅｔｃｈ

ＧＵＡＮＦｅｎｇ－ｚｈｅｎｌ”，ＺＨＯＮＧ

Ｓｈａｏ－ｊｉｅｓ．ＯＩＵＨｏｎｇ－ｄｕａｎ２，ＬＩＮＲｏｎｇ－ｂｉｎｌ。ＺＨＡＮＧＨｕｉｌ。

ＣＨＥＮ

Ｊｉ－ｃｈｅｎ＇。ＬＩＮＸｉｎ－ｊｆａｎｌ

３５０００３。３５０１０８，

（１．ＳｏｉｌａｎｄＦｅｒｔｉｌｉｚｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ

ｏｆＦｕｊｆａｎＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆ酊ｆａｎ

ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＦｕｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆ幻ｆａｎ

Ｃ＾ｆＭ；２．ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ

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ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＦ町ｆａｎ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ

ｒｏｏｔ

３５０００２，Ｃｈｉｎａ）ｎｏｄｕｌｅｓｏｆＣｈｉｎｅｓｅ

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｔｏｔａｌｏｆ１８ｉｓｏｌａｔｅｓｗｉｔｈｇｅｎｅｒａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＲｈｉｚｏｂｉｕｍｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍ

ａｒｅａ５

ｏｆ

Ｆｕｊｉａｎ．１６ＳｒＤＮＡｓｅｑＨｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄ

ａｎａｌｙｓｅｓ．Ｔｈｅ

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ｔｈｅｓｅｂａｃｔｅｒｉａｗｉｔｈｔｈｅ

ａｎｄ

ＺＫｌ

ｗｅｒｅ

ｔｈｅ

ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ

ｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ

ＹＸ、Ｚ３、ＧＺ

Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ；１３３、ＸＺ，Ｍ６ｗｅｒｅＭｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｏｔｉ

Ｂ７、ＺＫ７ａｎｄ

ｖａｒｉｅｔｉｅｓ，ＺＬＨ２ｗａｓＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ，Ｍ３、Ｍ１０，１３４、

ＺＱＨｗｅｒｅＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，１３６，１３５、Ｂ１ａｎｄＺ１ｗｅｒｅＲｈｉｚｏｂｉｕｍ．Ｆｏｒｔｈｅｐｕｒｐｏｓｅｏｆｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅ

ａｇａｒ

ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｏｆｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂａｃｔｅｒｉａｌ，ｗａｔｅｒｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｏｆ

ｔｕｂｅｃｕｌｔｕｒｅｗｅｒｅａｐｐｌｉｅｄｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅ

ｐａｒｔｎｏｔ

ｉｄｅｎｔｉｉｉｅｄｒｈｉｚｏｂｉａｌｓｔｒｉａｉ∞ａｎｄｍｉｌｋｖｅｔｃｈＭｉｍｉｌ、Ｍｉｎｚｉ５、Ｍｉｎｚｉ６、Ｍｉｍｉ７ａｎｄ８０４１０４１１．Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙ

ａ

ｏｎｌｙｆｕｒｔｈｅｒｅｌｕｃｉｄａｔｅｔｈｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅｍｉｌｋｖｅｔｃｈｒｈｉｚａｂｉｕｍ，ｂｕｔａｌｓｏｐｒｏｖｉｄｅｓ

ｔＯ

ｓｉｍｐｌｅａｎｄｆｅａｓｉｂｌｅｍｅｔｈｏｄ

ｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎｔｈｅａｂｉｌｉｔｙｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒｈｉｚｏｂｉｕｍｎｏｄｕｌａｔｉｏｎｂｙ

ｃｏｎｔｒａｓｔｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｏｆ

ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎｗｉｔｈ

ｔｈｅａｇａｒｔｕｂｅｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｗａｔｅｒｃｕｌｔｕｒｅ．ＫｅｙＷＯＩ＇Ｉｋ；ＣｈｉｎｅｓｅｍｉｌｋｖｅｔｃｈｒｈＬｚｏｂｉｕｍＩ

ｓｅｐａｒａｔｅ；１６ＳｒＤＮＡ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ａｇａｒｔｕｂｅｃｕｌｔｕｒｅｔ

ｗａｔｅｒｃｕｌｔｕｒｅ！

ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ

紫云英Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ

ｓｉｎｉｃｕｓ

Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ别称生草本植物。因其柔嫩多汁，蛋白质含量高，一直以来都作为优良的牧草和重要的绿肥，在我国长江

翘摇、红花草、草子等，豆科黄芪属一年生或越年

收稿日期ｔ２０１ｚ一０３—２２初稿｝２０１２—０５—０１修改横

作者简介：管风贞（１９８６一），女，在读硕士．研究方向ｔ应用徽生物

通讯作者，

林新坚（１９５５－－），男，研究员，研究方向：徽生物与土壤培肥（Ｅ－ｍａｉｌｔｘｉｎｊｉａｎｌｉｎ＠１６３．ｎｅｔ）

基金项目：福建省科技计列项目——省属公益类科研院所基本科研专疆（２０１０Ｒ１０２４５）

第５期管凤贞等：紫云英根瘤茵的分离与鉴定

５２５

中下游地区广泛种植。加之其淀粉、氨基酸等含量丰富，近年来利用紫云英花粉开发出来的紫云英蜂蜜，更是以其优良的口感和良好的保健功能受到了许多消费者的青睐。

根瘤菌作为一种革兰氏阴性短杆菌，菌体感染豆科植物根后会与豆科植物共生形成根瘤。豆科植物与根瘤菌共生具有固氮能力强、固氮量大、抗逆性强的优点，是生物固氮中最高效的体系，固氮量约占生物固氮总量的６５％［１］。因此，高效根瘤菌的选育已成为豆科作物增产增效的关键。目前常用的选育方法包括自然选育心】、杂交选育口］、诱变选育‘４“］、原生质体融合选育【７３及基因工程选育［Ｂ］等，由于自然界是１个庞大的菌种资源库，因此自然选育在各种选育方法中仍处于重要的地位。虽然自然界根瘤菌资源广泛，但根瘤菌与豆科植物之间的共生结瘤是１个复杂的过程，表现出一定的专一性，只有对目标豆科作物接以合适的根瘤菌，才能促使其形成有效的根瘤以提高植株的固氮效率和产量。目前，对于根瘤菌与豆科植物匹配性能的研究主要采用水培法和琼脂试管培养法Ｌ９ｊ，２种方法各有优缺点。因此，本试验从紫云英根瘤中分离出１８株固氮菌，对各菌株菌落形态、生理生化特性、

１６Ｓ

ｒＤＮＡ等方面进行分析和鉴定，初步确定１８株菌的系统发育地位，并采用琼脂试管法和水培法将部分菌株与闽紫１号、闽紫５号、闽紫６号、闽紫７号和８４１０４４１进行配对结瘤，进而对配对结果进行对比，分析２种方法在紫云英品种与根瘤菌配对能力上的差异。

１材料与方法

Ｉ．１材料

１．１．１

１８株紫云英根瘤菌株从采自福建永泰、

闽清和浦城等地紫云英的根瘤中分离获得，分离后分别命名为ｚ１、Ｚ３、ＺＫＩ、ＺＫ７、ＺＬＨ２、２ＱＨ、ＧＺ、

ＸＺ、Ｍ３、Ｍ６、Ｍｉ０、Ｂ１、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、ＹＸ。

１．１．２

紫云荚闽紫ｌ号、闽紫５号、闽紫６号、

闽紫７号和８０４１０４１１由福建省农业科学院土壤肥料研究所选育。

１．１．３培养基

（１）ＹＭＡ固体培养基：甘露醇１０．０ｇ、酵母

粉０．４ｇ、ＭｇＳ０４ ７Ｈ２００．２ｇ、ＫｚＨＰ０４０．５

ｇ、

ＮａＣｌ０．２ｇ、ＣａＣ０３３．０

ｇ、琼脂１５ｇ、微量元素

液１ｍＬ、Ｈ２０

ｌ０００

ｍＬ，ｐＨ７．２。其中，微量元

素液：Ｈ３８０３２．８６ｇ、ＭｎＳｑｌ．８１ｇ、ＺｎＳ０４０．２２

ｇ，ＣｕＳＯ，０．８０ｇ、Ｈ２Ｍ００２０．０２

ｇ、加蒸馏水至

１０００ｍＬ。

（２）ＹＭＡ液体培养基：蔗糖１０．０ｇ、酵母粉

１．０

ｇ、ＭｇＳ０４ ７Ｈ２Ｏ０．２ｇ、Ｋ２ＨＰ０４０．５

ｇ、

ＮａＣｌ０．１

ｇ、ＣａＣｌ２０．０５

ｇ、Ｒｈ微量元素液４．０

ｍＬ、Ｈ，Ｏ１０００ｍＬ，ｐＨ６．８～７．０。

（３）琼脂试管法培养基：Ｋ。ＨＰＯ。０．１３６

ｇ、ＭｎＳＯ。１．８１０ｇ、ＫＣｌ０．０７５ｇ，ＺｎＳ０４０．２２０

ｇ、

ＭｇＳＯ＿‘ ７Ｈ２００．０６０ｇ、Ｈ３ＢＯ。２．８６０ｇ、ＣａＳ０４

０．４６０

ｇ、ＣｕＳ０４ ５Ｈ２００．８００ｇ、Ｈ２Ｍ００２０．０２０

ｇ、Ｃａ（Ｎ０３）２０．０３０

ｇ、柠檬酸铁０．０７５ｇ、琼脂

８～１０

ｇ。

（４）水培法培养基：ＫＨ２ＰＯ，２．２ｇ、ＭｎＳ０４ Ｈ２０

１００．０ｍｇ、ＫＣＩ１５．５ｇ、ＺｎＳ０４ ７Ｈ２０２５．０ｍｇ、

ＭｇＳ０４ ７Ｈ２０２５．０ｇ、Ｈ３Ｂ（１２５．０ｒａｇ、ＣａＣＩｚ ２Ｈ２０

２１．５ｇ、ＣｕＳＯ， ５Ｈ。Ｏ２５．０ｍｇ、Ｎａ：ＭｏＯ， ２Ｈ２０５．０ｍｇ、ＮａＮ０３３．０

ｇ、柠檬酸铁３．０

ｇ。

１．１．４主要仪器设备ＰＣＲ仪、水浴锅、电泳仪、凝胶成像系统、三角瓶、１．８

ｃｍＸｌ８ｃｍ滤纸

条、试管架、镊子、烧杯、带滤纸的灭菌培养皿、不带滤纸的灭菌培养皿、聚乙烯薄膜、光照培养箱、超净工作台等。

１．２方法

１．２．１紫云英根瘤茵的分骞从福建永泰、闽

清、浦城等地获得的紫云英中选取生长状态良好的植株，取其根部肥大、饱满、粉红色的根瘤，用水冲洗去泥，然后用无菌水反复冲洗，滤纸吸干，再用７５％乙醇浸泡２ｒａｉｎ，０．１％氯化汞浸泡２～５ｒａｉｎ。无菌水冲洗５～６次，于无菌条件下，用镊子将根瘤压碎。将挤出液接种到斜面试管内，２８℃培养，长出菌落之后，进行平板稀释分离，将单菌落接到斜面上。重复进行稀释分离，获得单菌落接种到斜面上保存口］。

１．２．２根瘤茵的细茵学鉴定

（１）形态学鉴定：参照根瘤菌常规鉴定方法［１０－１２］进行革兰氏染色及对菌落特征进行描述。

（２）生理生化试验：ＹＭＡ刚果红反应、牛肉膏一蛋白胨反应、ＢＴＢ反应、石蕊牛奶反应、３一酮基乳糖反应、柠檬酸盐反应。

１．２．３茵株１６ＳｒＤＮＡ的测定

根瘤菌ＤＮＡ提

取参照文献［１３］方法进行。ＰＣＲ扩增扩增体系

２５肛Ｌ：ｌＯ×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ２．５ｐＬ、ｄＮＴＰ２．５肛Ｌ、

模板ＤＮＡ

１．０弘Ｌ、Ｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－１０．５弘Ｌ、

Ｓｅｒｉｎｅ

ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－２

０．５“Ｌ、ｒＴａｑ酶０．２５ｔ．ｔＬ、

ｄｄＨ２０１７．７５“Ｌ。

反应条件：９５℃预变性５ｒａｉｎ，９４℃变性ｌ

５２６

福建农业学报

第２７卷

ｒａｉｎ，５６℃退火１ｒａｉｎ，７２℃延伸２ｒａｉｎ，共进行２９个循环，７２℃延伸１０ｍｉｎ，４＂Ｃ保存。ＰｅＲ扩增结束后，产物在电压为５Ｖ ｃｍｌ的１．０％琼脂糖凝胶中电泳（缓冲液为１×ＴＢＥ）３０ｍｉｎ，电泳结束后，ＥＢ染色１０～１５ｒａｉｎ，观察结果。

（３）ＰＣＲ产物回收按照博大泰克胶回收试剂盒步骤进行。

１．２．４序列测定及序列数据分析将ＰＣＲ产物送至华大基因公司测序，通过Ｉｎｔｅｒｎｅｔ网（ｈｔｔｐ：／／

ＷＷＷ．ｎｅｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ

ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ），将所测序列

与ＧｅｎＢａｎｋ数据库中已报道的序列进行相似性比较，并与Ｇｅｎｂａｎｋ中的相似性序列在Ｃｌｕｓｔａｌ（１．８）程序包中进行多重序列匹配排列（ＭｕｌｔｉｐｌｅＡｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）分析，最后形成１个多序列匹配排列阵，其中形成的缺口用横杠。一”填补，再用Ｍｅｇａ（４．ｏ）程序包中的Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ法构建系统进化树，确定各根瘤菌在微生物系统发育学上的地位。

１．２．５

２种匹配方法下根瘤茵结瘤能力时比

（１）拌种根瘤菌液的制备：将供试菌株于ＹＭＡ斜面培养基中活化后，挑１～２环接至无菌的ＹＭＡ液体试管培养基中，置于恒温摇床上，

３０℃、１８０

ｒ ｍｉｎ＿１培养４８

ｈ。

（２）琼脂试管培养法：将供试根瘤菌株与供试紫云英品种按以下步骤做结瘤试验，每个处理设５个重复，每个紫云英品种各设５棵不接菌的植株作为对照。

①种子表面灭菌。将种子放在无菌平板中，用７５％酒精浸Ｓｍｉｎ，倒去酒精。加入０．１％氯化汞溶液浸５ｍｉｎ，后用无菌水洗４～６次，洗时需振摇，每次５ｍｉｎ。（硬皮小种子可先用浓硫酸处理１０～２０ｒａｉｎ）。过程中注意去掉漂浮在水面的轻种。

②种子催芽。视种皮吸水能力而定。如果种皮不易吸水，需将种子在无菌水中浸ｚ～３ｈ，然后将消毒的种子点种于琼脂表面，或浸湿灭菌滤纸上，在２０℃催芽。还可以把种子插入在灭菌的装有滤纸的试管中，在２０℃催芽。经２４～４８ｈ，出芽长度在０．５～１．０ｃｍ时即可使用。

③接种和播种。经催芽的种子先用来播种作对照处理（即种子表面不带有根瘤菌）。余下的种子进行根瘤菌接种用。接种方式同水培法。

④试验设计。结瘤试验采用简单对比法，各组按５次重复进行设计，即１８株根瘤菌株分别与５个紫云英品种组合，每株根瘤菌与每个紫云英品种进行５次重复配对试验，因此，每个紫云英品种

与１８株根瘤菌组成９０个配对，同时每个紫云英品种设置５个重复的不接菌对照，使得同一紫云英品种有９５个试验。接种完毕封口后置于光照培养箱内培养，设定培养条件为：２３℃、６６％光照１２ｈ；

１８℃、无光照１２

ｈ。

⑤结果检查。豆科植物从生长到开始出现根瘤的时期为植株长出１～４片真叶时。为了观察根瘤的有效性，在播种后１５～３０ｄ开始进行观察，并于１２０ｄ时结束试验。检查时，从试管中小心取出植株，不要损伤根系，并将根系洗净，观察记录检查结果。

１．２．６水培试管培养法试验设计处理同琼脂试

管培养法。

①制作滤纸桥：将滤纸裁成条状，其宽度分别为１．３ｅｍ，制成Ｍ型，中间凹处根据幼苗的大小制成Ｖ型小孔，Ｍ型滤纸的高度为试管的长度

减去４ｃｍ。

②制备无菌水培营养液ｚ按水培营养液的配

方配置水培液分装入１．８

ｅｍ×１８

ｃｍ试管中，每管

约２２ｍＬ，然后每管放入滤纸条，用聚丙烯纤维塑

料薄膜封口，１２１℃下灭菌３０ｍｉｎ，待用。

③种子的制备：种子先用９５％乙醇浸泡５ｍｉｎ后再用０．１％的ＨｇＣＩ。表面灭菌５ｍｉｎ，然后用无菌水清洗１０次。将消毒后的种子播于铺有无菌湿润滤纸的平皿内，封好后置于２５～２８℃温箱中保温催芽４８ｈ，一般小粒种子催芽长为０．５～

１．０ｅｍ。

④接种：将催芽成功的种子放入事先制备好的根瘤菌悬液中浸泡３０

ｍｉｎ。

⑤播种：将幼苗用无菌的镊子小心夹出放入水培液试管的滤纸桥中固定好，将菌悬液定量吸入试管中。封口后于光照培养箱内培养，培养条件为：２３℃、６６％光照１２ｈ；１８℃、无光照１２

ｈ。

同时培养期间注意及时补充营养液，观察结瘤和生

长情况。

⑥结果检查。豆科植物从生长到开始出现根瘤的时期为植株长出１～４片真叶时。为了观察根瘤的有效性，可在播种后１５～３０ｄ开始进行观察，并于１２０ｄ时结束试验。检查时，必须ｄｘ，ｂ地将植株从试管中取出，不要损伤根系，将根系洗净，观察记录检查结果。

２结果与分析

２．１紫云英根瘤菌的分离

从福建永泰、闺清、浦城等地采集紫云英植

第５期管凤贞等：紫云英根瘤茵的分离与鉴定

衰１分离株菌菌落形态

Ｔａｂｌｅ１

５２７

株，从其根瘤中分离、纯化根瘤菌，获得菌株１８株，代号分别为Ｚ。、Ｚ。、ｚＫｌ、ＺＫｔ、ＺＬＨ２、

ＺＱＨ、ＧＺ、ＸＺ、Ｍ３、Ｍ６、Ｍ，。、Ｂｌ、Ｂ３、Ｂ４、Ｂｓ、Ｂ６、岛、ＹＸ。

Ｃｏｌｏｎｙｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅｅｉｇｈｔｅｅｎｓｔａｉｎｓｉｓｏｌａｔｅｄ

菌株形态

２．２紫云英根瘤菌的细菌学鉴定２．２．１紫云英根瘤茼的形态学鉴定

从不同生境

采集的紫云英根瘤中分离得到的根瘤菌菌株，经革兰氏染色分析皆为阴性短杆菌（图１）。经ＹＭＡ培养基于２８＂Ｃ下培养３ｄ后，出现肉眼可见单菌落，菌落直径为２～８ｍｍ（图２）。一般为水泡状、水润圆整透明、生长旺盛时有流动胶质，具有一般根瘤茵特征。各菌株的菌落形态具体描述如表１，大致可以分为３大类：（１）菌落水泡状呈白色的

Ｚ１、Ｂ１、Ｂ５、Ｂ７、Ｂ６、ＺＫ７、ＧＺ、Ｂ３、ＺＫｌ、

啪

础ｍ

㈣

殂

№

承泡状．较干，半透明，圈中，白色，漉动胶质水泡状．水润圆整，半透明，圈中，绿黄色ｔ流动胶质水泡状．较千．半透明，圈中，浅黄色，流动胶质非水泡状，扁平，较干，圈小。白色，无流动胶质非水泡状，扁平，较干，圈小，浅黄色，无流动胶质水泡状，水润圆整，半透明，圈大，白色。流动胶质水泡状，水润圆整，半透明，圈大，白色．流动胶质水泡状．水润圆整，半透明，圈中．白色．流动胶质水泡状，水润圆整，半透明，圈中。白色，流动胶质水泡状，水润圆整，半透明．圈小。白色，流动胶质水泡状，水润圆整，半透明，圈中．白色，流动胶质水泡状，水润圆整。半透明．圈中，白色，流动胶质水泡状，水润圆整．半透明，圈中．白色，流动胶质水泡状，水润圆整，半透明，圈中，白色，流动胶质水泡状，较干。半透明，圈中，浅黄色，流动胶质水泡状．水润圆整，半透明，圈中，白色，流动胶质水泡状．水润圆整，半透明，圈大，白色．流动胶质水泡状．水润圆整，半透明，圈小，白色，流动胶质

肿

睨

矾

窈

Ｍ６、Ｚ３、ＸＺ、ＹＸ；（２）菌落水泡状呈浅黄色或黄绿色ＺＬＨ２、ＺＱＨ、Ｂ４；（３）菌落为非水泡状

的Ｍ３、Ｍ１０。

勉

豫

ｍ雎ｍ｝舀；８酊

！．２．２生理生化试验理生化特性结果见表２。

１８株紫云英根瘤菌各生

（１）ＹＭＡ刚果红培养基培养：１８株菌分别接种于ＹＭＡ刚果红培养基中，置于２８℃培养箱培养３～７ｄ后，除Ｚ１、ＺＫ７、ｔ３４外，其余菌株在

图１

Ｆｉｇ．１

ＸＺ革兰氏染色（４０×

ＧｒａｍｓｔｒａｉｎＸＺ４０＞（

ＹＭＡ刚果红培养基中都不吸色，相反，ＺＫ７对刚果红有一定的吸收能力，而Ｚ１及Ｂ４不仅对刚果红有吸色作用，还能分解培养基中的刚果红｝

（２）牛肉膏一蛋白胨反应：３０℃培养４８ｈ后，牛肉膏一蛋白胨培养液未见浑浊，菌体未生长，表明１８株菌对牛肉膏一蛋白胨利用率很低，不能在牛淘膏蛋白胨培养基上生长。

（３）ＢＴＢ反应：２８℃培养箱培养３～７ｄ后，除凄种有Ｍ６、Ｍ３、ＸＺ、ＹＸ、Ｂ１、Ｂ３的ＢＴＢ培养基不变色外，其余１２株菌都可使ＢＴＢ培养基变黄，表明该１２株菌在ＢＴＢ培养基上产酸，属快生型菌株。

（４）石蕊牛奶反应：Ｍ３、ＸＺ、ＹＸ、Ｂ１、Ｂ６庄石蕊牛奶培养基中生长能使培养基变蓝，且ＸＺ丢ⅡＢ。能形成明显的乳清环，表明这些菌产碱，属

图２

Ｆｉｇ．２

ＸＺ苗落形态

慢生型菌株；其余菌株在石蕊牛奶培养基中变红，且Ｚ１、ＺＫ７、１３４、Ｂ７能形成明显的乳清环，表明这些菌产酸，属快生型菌株。

ＣｏｌｏｎｙｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆＸＺ

５２８

福建农业学报

（５）３－酮基乳糖反应：加入本尼迪克特试剂后，

第２７卷

国内外也有报道有些根瘤菌也可以利用柠檬酸盐，随着根瘤菌资源的不断丰富，其代谢类型也更为多样，传统试验中通过柠檬酸盐利用情况判定菌株是否为根瘤菌的方法已经无法实现，反而可能使得一些实属根瘤菌的菌株被遗漏，正如本试验的Ｂ１、Ｂ５、Ｂ６等菌株。因此，该方法在后期试验中很可能被逐渐淘汰。

１８株菌的菌落周围均未出现黄褐色沉淀，属阴性反应，表明所分离菌株均不属于土壤杆菌属菌株。

（６）柠檬酸盐利用情况：１８株供试菌株中。除Ｍ６、ＧＺ、ＸＺ、ＹＸ与Ｂ３不能利用柠檬酸盐外。其余菌株均可利用柠檬酸盐，过去认为土壤杆菌属能利用柠檬酸盐，而根瘤菌不能利用，但近几年来

囊２不同菌株若干项生理生化特征

Ｔａｂｌｅ２

Ｓｏｍｅｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎｓ

菌株ＹＭＡ刖果红

一一一一一

牛冉膏一蛋白胨

一一一一一一

ＢＴＢ

石蕊牛奶３一酮基乳糖

一一

拧檬酸盐

一

一

＋＋一

＋＋＋一

一一一一一一一

＋＋＋＋＋＋

一

ｐ＋

一一一

一一一一一一一一一一一一

＋＋＋＋＋＋一一一一

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一一

舢猁姗现聊睨姗嚣配一一一一

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一一

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一

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斗斗＋斗

髓以髓｛阱一

＋＋卜＋Ｐ

注；ＹＭＡ刚果红反应中．＋为吸色，一为不吸色．＋‘为分解颜色Ｉ牛肉膏－蛋白胨反应中，＋表示有菌体生长．一表示无菌体生长ｌＢＴＢ反应中，＋为培养基变黄，一为堵养基不变．＋一为锾变黄；石蕊牛奶反应中，＋表示变红，一表示变蓝．加－表示能形成明显的乳清环；３－酮基乳糖反应中，＋为加入本尼迪克特试剂有黄褐色沉淀。一为加入本尼迪克特试剂无黄揭色沉淀；柠檬酸盐反应中，＋为可以利用柠檬酸盐 一为不能利用拧挂酸盐。

Ｚ．３２．３．１

１６ＳｒＤＮＡ鉴定

Ｍ３、ＭｌＯ、ＺＫ７、１３４、Ｂ７、ＺＱＨ与土壤杆菌属

提取各分离菌株的总

Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌种的相似性达９５％，可能为该属菌种；Ｂ６、Ｂ５、Ｂ１、Ｚ１与根瘤茵属Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ相似性最高，达到９５％，亲缘关系最近，可能都是该属菌株。一般来说紫云英根瘤菌都归属于中慢生根瘤菌属Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ，但是后期又相继报道了土壤杆菌属Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、根瘤菌属Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、中华根瘤菌属Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ的菌株也可与紫云英结瘤固氮，本试验所筛选菌株除ＺＬＨ２外分别属于所报道的前３个属，后期的水培法试验也间接验证了归属于土壤杆菌属Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ的Ｂ４、Ｂ７和归属于根瘤菌属Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ的Ｂ１、Ｂ５、Ｂ６都能与紫云英结瘤。而ＺＬＨ２与黄单孢菌属的好几个

ＰＣＲ结果与分析

ＤＮＡ，使用通用引物进行ＰＣＲ扩增（图３），扩增条带大小在１进行测序。

２．３．２序列测定及系统发育地位将测定的序列利用ＮＣＢＩ上的ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｈｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）和已知物种序列进行比对．发现ＸＺ、ＹＸ、Ｂ３、Ｍ６、Ｚ３、ＧＺ、ＺＫｌ与中慢生根瘤菌属Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ菌种的相似性最高，达到９６％，亲缘关系最近，可能隶属于该属菌株｝ＺＬＨ２与黄单孢菌属Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ菌种的相似性最高，达到９６％，亲缘关系最近，可能为该属菌株；

４００

ｂｐ左右，再将ＰＣＲ产物纯化，

第５期

管凤贞等：紫云英根瘤茵的分离与鉴定

５２９

Ｍ

２

３

４５６７８９１０

２５００ｂｐ２０００ｂｐ１０００ｂｐ

图３部分菌株ｌ６ＳｒＤＮＡ的ＰＣＲ结果

Ｆｉｇ．３

Ｔｈｅ１６ＳｒＤＮＡＰＣＲｒｅｓｕｌｔｏｆｐａｒｔｌｙｓｔｒａｉｎｓ

洼：１一ＸＺＩ

２一ＹＸ｝３一髓，４一Ｍ６；５一Ｚ３，６一ＧＺ｝７一ｚｌ（１Ｉ８－－Ｍ３；９－－Ｍ１０ｌ１０—Ｚ１｝Ｍ－－ｍａｒｄｅｒ。

菌种相似性都达到９６％，但至今尚未有该属菌株２．４２种配对方法下回接试验结果

的共生结瘤报道，水培试验也无结瘤表现，究其原２．４．１

琼脂比较不同根瘤茵株对不同紫云英品种

因，可能是受环境条件限制，也可能是其专一性比的匹配的影响

由图５、６可以看出，未接根瘤菌

较高，能使之共生结瘤的紫云英品种较少，因此还菌株（ＣＫ）的紫云英细弱矮小，叶色偏黄，未见有待进一步验证。

根瘤；而接种根瘤菌的，紫云英根系有根瘤菌，且将各序列输入ＭＥＧＡ４．０软件，通过植株颜色深绿、长势高大。配对结果见表３。１１株Ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ法构建系统进化树（图４），结根瘤菌对５个紫云英品种的结瘤能力存在较大差果可以把所研究的菌种分为３大类：ＸＺ、ＹＸ、异。其中，ＧＺ和ＸＺ与５个紫云英品种都可结瘤，Ｂ３、Ｍ６、Ｚ３、ＧＺ、ＺＫｌ聚成１类，有较近的亲缘

具有广谱性；Ｍ３、Ｍ６、ＭＩＯ的匹配能力位居第关系；ＺＫ７、Ｂ４、Ｂ７、Ｍ３、Ｍ１０、ＺＬＨ２、ＺＱＨ

２，除ＭｌＯ不能使闽紫１号、闽紫５号结瘤外，聚成１类，在发育系统上有较近的亲缘；Ｂ６、Ｂ５、Ｍ３、Ｍ６能使除闽紫１号外的其他４个紫云英品种Ｂ１、Ｚｌ聚成１类，与其他菌种有较远的亲缘关系。

结瘤；ＺＫｌ、ＺＫ７诱导紫云英结瘤能力较低，仅能使闽紫５号结瘤；Ｚ１、Ｚ３、ＺＬＨ２、ＺＱＨ匹配结瘤率为０。总之，根瘤菌结瘤顺序为：ＧＺ、ＸＺ＞Ｍ３、Ｍ６

＞Ｍ１０＞ＺＫ７、ＺＫｌ＞Ｚ１、Ｚ３、ＺＬＨ２、ＺＱＨ。

裹３磨法验证菌株与肇云英品种闻的配对

Ｔａｂｌｅ３

Ｅｘａｍｉｎｅｔｈｅｎｏｄｕｌａｔｉｏｎｂｙａｇａｒｍｅｔｈｏｄ．

菌株闽紫６号８０４１０４１１闽紫７号闽紫ｌ号闽紫５号

图４

Ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ法构建的系统进化树

Ｆｉｇ．４

Ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ－ｊｉｏｎｉｎｇｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ

ｔｒｅｅ

ｏｆｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ

ｓｔｎｌｎｓａｎｄ

ｒｅｌａｔｅｄｒｅｆｒｅｎｃｅ

ｓｔｇａｉｌｂｂａｓｅｄｏｎ

１６Ｓ

ｒＤＮＡ

ｐａｒｔ锄ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ

注：。／”前为结瘤株数、后为试验重复数。

５３０

福建农业学报

第２７卷

裹４水培法验证菌株与紫云英品种间的配对

Ｔａｂｌｅ４

Ｅｘａｍｉｎｅｔｈｅｎｏｄｕｌａｔｉｏｎｂｙ

ｗａｔｅｒｃｕｌｔｕｒｅｍｅｔｈｏｄ

菌株ｎ船

闽紫６号８０４１０４１１闽紫７号闽紫１号闽紫５号

矾聊

一酬

乏；恝ｍｍ

㈣

图５

Ｆｉｇ．５

吣啪邮哦邮邮邮狮邮邮邮

邮邮邮螂邮邮

ＧＺ接种闽紫ｌ号

Ｍｉｎｌｂｙａｇａｒｍｅｔｈｏｄ

ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆＧＺａｎｄ

注：试管１，２为无结瘤植株；试管３～５为结瘤植株。

３

讨论

３．１从福建永泰、闽清和蒲城等地采集的紫云英根瘤中分离获得的１８株根瘤菌，均为革兰氏阴性短杆菌，经过形态、生理生化等初步细菌学鉴定，除Ｍ３、Ｍ１０外，均为水泡状菌体，具备一般根瘤菌的特征。在后期进行的１６ＳｒＤＮＡ鉴定中，确定了ＹＸ、Ｚ３、ＧＺ、ＺＫｌ为中慢生根瘤菌属Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ，Ｂ３、Ｍ６、ＸＺ与百脉根中生根瘤菌Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｏｔｉ可能为同一菌种的不同变种；ＺＬＨ２为黄单孢菌属Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ菌株；Ｍ３、Ｍ１０、ＺＫ７、Ｂ４、Ｂ７、ＺＱＨ为土壤杆菌属Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株；Ｂ６、Ｂ５、Ｂ１、Ｚ１为根瘤菌属Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ菌株。鉴定结果表明，所筛选菌株除ＺＬＨ２外分别属于所报道的前３个属，后期的水堵法试验也间接验证了归属于土壤杆菌属Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ的Ｂ４、Ｂ７和归属于根瘤菌属

图６

Ｆｉｇ．６

左侧结瘤试管放大

ｔｏ

Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ的Ｂｌ、Ｂ５、Ｂ６都能与紫云英结瘤，这

ｅｎｌａｒｇｅｏｆ

ＩｈｅｐｉｃｔｕｒｅｉｓｔｈｅＯｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｍａｐｌｅｆｔｔｎｂｅ

与Ｊｏｒｄａｎｄ［１４］对根瘤菌进行的分类结果一致。ＺＬＨ２虽与黄单孢菌属的好几个菌种相似性达到９６％，但至今尚未有该属菌株的共生结瘤报道，水培试验也无结瘤表现，究其原因，可能是受环境条件限制，也可能是其专一性比较高，能使之共生结瘤的紫云英品种较少，因此还有待进一步验证。

从上述紫云英根瘤分离得到的菌株多样性说明，紫云英除了能与互惠种族结瘤固氮外，还有其他细菌的参与，国内外的科学家对此进行了大量的研究，他们从植株根瘤中分离到多种具有固氮功能的微生物，进行分类鉴定，并对它们的生理功能，

２．４．２

水培法比较不同根瘤茵对不同紫云英品种

从表４可以看出，在水培法下，各

匹配的影响

菌株与紫云英品种的匹配性能出现了比琼脂试管培养法更大的差异。ＧＺ和ＸＺ能使供试的紫云英品种结瘤（８０４１０４１１除外），其余的根瘤菌菌株与紫云英品种问都未表现出结瘤现象，结瘤率均为０。虽然ＧＺ和ＸＺ具有广谱性，但二者还是有所差异的，如ＧＺ不能使８０４１０４１１匹配结瘤。

第５期管风贞等：紫云英根瘤茵的分离与鉴定

５３ｌ

特别是与促进豆科植物结瘤固氮方面的功能进行了细致的研究，比起传统研究关于豆科作物结瘤的观点，他们的研究表明，除了根瘤菌属微生物，诸如从根瘤内分离的能够侵入豆科植株根部形成根瘤进行固氮的土壤杆菌［１“、位于根际土壤或者根部表面进行自身固氮的类芽孢杆菌和芽孢杆菌“铂等对豆科植物的增产增效起到重要的作用。本试验从紫云英根瘤中分离出多种固氮菌，除各类根瘤菌属菌株外，也分离出Ｍ３、ＭＩＯ、ＺＫ７等土壤杆菌属菌株及黄单孢菌属菌种ＺＬＨ２，说明土壤杆菌属等固氮菌广泛存在于各类豆科植物根瘤内，极大地丰富了根瘤菌的多样性，同时，此类固氮菌对豆科植物的结瘤固氮具有重要的作用，这为人类研究丰富根瘤菌的固氮机制提供了新的方向。

３．２考虑到根瘤菌与寄主之间只有很好的搭配才能使豆科植物获得最佳的固氮效果ｎ”，若匹配性能不好，即使是再高效的根瘤菌也不能充分发挥应有的共生固氮性能Ｅ”－１…，也就是说接种根瘤菌的结瘤能力是接种成功的关键ｎ“。因此。本试验采用琼脂试管培养法和水培法考查１１株紫云英根瘤菌对５个紫云英品种（系）匹配的影响。比较２种方法的结瘤效果可知，ＧＺ和ＸＺ２种方法均表现出较为广谱的结瘤能力，说明根癯菌与紫云英的共生存在多样性；其余９株根瘤菌在２种培养方法下表现出较大的差异，在水培法中，全部表现出阴性，即不结瘤，而在琼脂试管培养法中却可以表现出一定的结瘤能力，Ｍ。、Ｍ。甚至能使除闽紫１号外的其他４个紫云英品种都产生不同程度的结瘤现象。由此可见，根瘤菌的有效性受到很多环境因素的影响［２“。目前的研究认为根瘤的形成与根瘤菌和宿主植物交换调节信号分子过程相关ｕ２－”］，豆科植物的根或种子分泌类黄酮物质，诱导根瘤菌的结瘤基因产生结瘤因子［２“，当根瘤菌允泌的结瘤达到一定浓度时，能够有效刺激豆科植物结瘤，琼脂试管法由于琼脂能够将根瘤菌的分泌物保持在一定的浓度，故使植株根部形成根瘤，这种根瘤的组织结构和典型的根瘤相同，但是是空心的，为阴性根瘤［２钉ｆ而水培法由于根瘤菌的分泌物被水培液大幅度的稀释，致使假阳性根瘤无法形成。其次，琼脂的组成成分比较复杂，含有寡糖等物质，这与某些根瘤菌如苜蓿根瘤菌和豌豆根瘤菌中观察到的结瘤因子结构相似［２”２７］，因此也可能刺激植株结瘤，产生假阳性反应，但这种根瘤一般没有固氮活性。李湘等［２８］的研究也为这种猜测提供了科学根据，假阳性根瘤由于积累了大量的淀粉，使瘤体呈淡绿

色，其内可能也含有短杆状菌体，但菌体不膨大形成类菌体，这种根瘤因不含豆血红蛋白，因此无固氮性能。在研究各类结瘤微生物结瘤固氮能力差异中，水培法和琼脂试管培养法由于栽培周期短，便于操作和观察，特别是水堵法结果不受土壤等外界因素的干扰，因此是研究各种具有结瘤固氮能力的微生物与豆科植物的结瘤配对的较佳方法，具有较强的使用价值。

综上所述，紫云英根瘤菌具有多样性，本文不仅从紫云英根瘤中分离出１８株具有固氮性能的菌株，并对其进行初步鉴定，构建了系统发育树，为更好地分析各菌株间的亲缘关系打下了基础。试验还比较了部分菌株在琼脂试管法和水培法下结瘤能力的差异，表明水培法比琼脂试管培养法在紫云英根瘤菌与紫云英品种的匹配性能研究上要求更为严格，不易出现假阳性配对情况。加之，水培法操作较为简便，试验结果易于观察和记录，具有快捷、简便、直观、可靠等优点。是一种研究根瘤菌与豆科植物问匹配关系的好方法，有望在该研究领域进行进一步的推广和完善。参考文献：

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ＳＨＩＹＯＮＧ．

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ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＳｉｎｏｒｈｉｚｏｉｂｕｉｍｍｅｌｉｌｏｉＳｔａｆｉｎｓ

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ｓｔｒａｉｎｓｔｈａｔｎｏｄｕｌａｔｅｓｅｙｂｅａｒｌｌ［Ｊ］．ＣｕＲＴ－Ｍｉｃｒｏｂｉ０１．２００８，

５７ｌ

２１Ｚ一２１７。

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０１１

Ｉｎｔｅｒｇｅｎｅｒａ

Ｆｕｓ｜吣ｎｏｆ

Ｐｉｎｔｏｐｌａｓｔｓｆｒｏｍ

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（责任鳊辑：柯文辉）

紫云英根瘤菌的分离与鉴定

作者：

管凤贞， 钟少杰， 邱宏端， 林戎斌， 张辉， 陈济琛， 林新坚， GUAN Feng-zhen，ZHONG Shao-jie， QIU Hong-duan， LIN Rong-bin， ZHANG Hui， CHEN Ji-chen， LINXin-jian

管凤贞,GUAN Feng-zhen(福建省农业科学院土壤肥料研究所,福建福州350003;福州大学生物科学与工程学院,福建福州350108)， 钟少杰,ZHONG Shao-jie(福建农林大学生命科学院,福建福州,350002)， 邱宏端,QIU Hong-duan(福州大学生物科学与工程学院,福建福州,350108)， 林戎斌,张辉,陈济琛,林新坚,LIN Rong-bin,ZHANG Hui,CHEN Ji-chen,LINXin-jian(福建省农业科学院土壤肥料研究所,福建福州,350003)福建农业学报

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作者单位：

刊名：英文刊名：年，卷(期)：

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