大蒜细胞SOD的提取与分离

实验四十五 大蒜细胞SOD的提取与分离

一. 实验目的

学习超氧化物歧化酶的提取与分离方法

二. 实验原理

超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它

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可催化超氧负离子（O2）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：2O2＋H2＝＝O2＋H2O2。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8的磷酸缓冲液提取。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。

三. 实验方法及步骤

1．组织或细胞破碎

称取5g左右大蒜蒜瓣或大蒜细胞，置于研磨器中研磨，使组织或细胞破碎。 2．SOD的提取

将上述破碎的组织或细胞，加入2－3倍体积的0.05mol/L,pH7.8的磷酸缓冲液，继续研磨搅拌20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后用离心机在5000rpm，离心15min，弃沉淀，得提取液。 3．除杂蛋白

提取液加入0.25倍体积的氯仿－乙醇混合溶剂搅拌15min，5000rpm离心15min，去杂蛋白沉淀，得粗酶液。 4．SOD的沉淀分离

将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min,5000rpm离心15min，得SOD沉淀。 将SOD沉淀溶于0.05mol/L,pH7.8的磷酸缓冲液中，于55－60℃热15min,离心弃沉淀，得到SOD酶液。

将上述粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力。 5．SOD活力测定

取3根小试管，按下表分别加进各种试剂和样品液。

(ml)

试 剂 碳酸缓冲液 EDTA溶液 蒸馏水 样品液 肾上腺素液 － 空 白 管 5.0 0.5 0.5 － 对 照 管 5.0 0.5 0.5 － 混 合 均 匀 0.5 0.5 样 品 管 5.0 0.5 － 0.5 在加入肾上腺素前，充分摇匀并在30℃水浴中预热5min至恒温。加入肾上腺素（空白管不加），继续保温反应5min，然后立即测定各管在480nm处的光密度。对照管与样品管的光密度值分别为A和B。

在上述条件下，SOD抑制肾上腺素自氧化的50%所需的酶量定义为一个酶活力单位。即：

酶活力（单位）＝2·（A－B）·N/A 式中 N――样品稀释倍数；

2――抑制肾上腺素自氧化50%的换算系数（100%/50%）。

若以每毫升样品液的单位数表示，则按下式计算： 酶活力单位/ml＝2·（A－B）·N/A ·V/V1＝26·（A－B）·N/A 式中V――反应液体积（6.5ml）； V1――样品液体积（0.5ml）。

最后，根据提取液、粗酶液和酶液的酶活力和体积，计算纯化回收率。

四. 附注

材料和试剂 （1）新鲜蒜瓣

（2）磷酸缓冲液：0.05mol/L,pH7.8的磷酸缓冲溶液。

（3）氯仿－乙醇混合溶剂： 氯仿：无水乙醇＝3：5（V/V）。 （4）丙酮：用前冷却至4－10℃。 （5）碳酸钠溶液：0.2mol/L。 (6) EDTA溶液：0.1mol/L。 (7) 肾上腺素液：1mg/mL。

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