硝酸还原酶的测定

一、实验目的和要求

掌握体内法测定植物组织中的硝酸还原酶原理和方法，明确诱导酶含义。 二、实验内容和原理

硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，与作物吸收和利用氮肥有关。它催化植物体内的硝酸盐

还原为亚硝酸盐：

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产生的NO2可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定NO2含量的增加，即表示该酶活性的大小。

装 NO2含量的测定用磺胺比色法。在酸性溶液中产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰

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胺）反应产生重氮，再与α–萘胺（或萘基乙烯二胺）偶联形成紫红色的偶氮化合物。生成的红色偶氮化合物在540nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定，利用标准曲线确定溶液中NO2-含量。 三、主要仪器设备

1、实验仪器 分光光度计，真空泵，温箱，天平，2个烧杯，移液管若干，试管3支，剪刀。 2、实验试剂 0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液，对-氨基苯磺酸溶液，α-萘胺溶液，亚硝酸钠标准液

3、实验材料 在15-25℃ 蒸馏水培养一周的大麦苗两组，一组加KNO3，一组加NH4Cl，在白天置光照下处理。

四、操作方法和实验步骤

1、剪取新鲜的叶片两组，一组是处理苗0.51g，另一组是对照苗0.50g，叶片各剪为0.5~1cm的碎片，压实。

2、两组中各加入15ml的酶促反应液。

3、真空抽取10min，充分交换细胞内外液。 4、加盖在30℃的保温箱中保温20min。

5、去除材料，用移液管取4ml反应液，加入2ml磺胺，加入2ml苯基，放置15min。 6、比色：在540nm的波长下分光光度测定亚硝酸的OD值。

7、空白管：4mlH2O +磺胺溶液2ml+萘基乙烯二胺溶液2ml ?室温放置15min同样在540nm的波长下分光光度测定亚硝酸的OD值。

五、实验数据记录和处理

称重： 处理苗0.51g；对照苗0.50g

OD值：处理苗0.513A；对照苗0.050A

NO2- 含量标准曲线： Y=257.29X-4.8262（X=OD值；Y=NO2含量（nmol）） 有标准曲线得出NO2-的含量：处理苗：C NO2-=127.16nmol 对照苗：C NO2-=8.038nmlo 硝酸还原酶活力(nmol NO2-·g-1·h-1)= 根据OD值从标准曲线上查得的NO2（nmol）× 3 × 15/4/m 硝酸还原酶活力：处理苗=2805 nmol NO2·g·h 对照苗=180.855 nmol NO2·g·h六、实验结果与分析

1、实验结果分析：实验表明用硝酸钾处理的苗比用氯化铵处理的苗硝酸还原酶活力更强，而且根据测出

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的亚硝酸的含量，处理苗是对照苗的10倍左右，远比旁边几组的高，因为可能是因为在取材的时候，取了粘有培养液的根部，但并没有用蒸馏水洗去吸附在上面的硝酸根、亚硝酸根，或者根部的硝酸还原酶活性更多（猜测）。

2、诱导时如用NaNO3 替代KNO3结果会如何，为什么？

光合呼吸作用减弱，酶的活力降低，从而影响硝酸根转化为亚硝酸根，实验中可能两组紫红色的颜色差别很小，使测得的还原酶活力偏低。

原因：K+离子可以调节渗透势，气孔开闭，促进氧化磷酸化，另外钾活化呼吸作用和光合作用的酶的活性，是40多种酶的辅助因子，是形成细胞膨胀和维持细胞内电中性的主要阳离子。而Na离子虽然可以部分地代替钾的作用，但不能完全替代。 3、如不进行光照，结果会怎么样，为什么？

结果可能是两组的实验结果相差不大，而且所测定的还原酶的活力都很低。

原因：之前的呼吸作用已经消耗大量的糖类，而在没有光合作用的条件下，苗储存的糖类很少，所以呼吸作用会大大减弱，使酶活力比预期结果低，两组亚硝酸盐含量相差不多。

4、亚硝酸是过多施用氮肥后蔬菜中积累的致癌物质，请根据本实验写出简易测定蔬菜亚硝酸含量的方法。 取新鲜蔬菜的组织，用酶促反应液浸提，取适量的反应液加磺胺加α–萘胺，静置后用分光光度计测定，然后在标准曲线上计算出相应的亚硝酸的含量。

七、讨论、心得

2、选用同一植株的不同部位，所得的结果会不同，因此在取材的时候要根据实验的要求，认真选取，以免照成实验的失败，但是在课后你可以根据自己的加假设进行实验，观察是不是由于这个原因导致了你实验上的误差。另外，酶促反应在暗条件下进行，以防止叶绿素形成还原型铁氧化蛋白，促进亚硝酸还原酶把亚硝酸还原成氨气。

4、硝酸还原酶，是硝酸盐同化中第一个酶，也是限速酶，催化植物体内的硝酸盐还原成亚硝酸盐，在植物的氮素代谢过程中发挥重要作用，与作物有效吸收和利用氮素肥料有关，对农作物产量和品质有重要影响，硝酸盐还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。而现在大部分地区农业还很落后，不能科学施肥，虽然现在关于作物的理论都比较成熟，但却未能及时应用于现实，这是一个比较遗憾的问题。在这方面，中国科学在理论上与发达国家可能没有相差几年，但是在实际应用上却落后于他们10年或更久。

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