枯燥芽孢杆菌培养条件的优化及蛋白酶的测定

枯燥芽孢杆菌培养条件的优化及蛋白酶的测定 1 材料

1.1菌种：

菌株: 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis，由生化实验室提供。

1.2培养基

斜面培养基:牛肉膏3 g，蛋白胨1g, NaCl 5g，琼脂1.5g-2.5g,pH7.2-7.4 配置100ml。 种子培养基： 蛋白胨 1 % ,酵母浸出物 0. 5 % ,氯化钠 1 % ,自然 pH。 液体发酵培养基：葡萄糖15g/L，酵母浸出物5g/L,MgSO4 5g/L,pH 7. 0 。

1.3 主要仪器 ：

电热恒温鼓风干燥箱 ,高压蒸汽灭菌锅, 高性能无菌实验, LDZ4 -0.8A 离心机, 分光光度计, 生化培养箱HPS-250, 细菌漏斗(No4～5), 玻璃层析柱(20 mL)，梯度混合器，蛋白检测仪，记录仪，部分收集器，接收试管、天平，酸度计等。

1.4主要试剂 ：

蛋白胨 牛肉膏 NaCl H2PO4 NaOH KCl Na2CO3 Na2HPO4 NaH2PO4 Li2SO4 NH4HCO4 HCl (NH4)2SO4 、 ZnCl2 CuSO4 DEAE-Sepharose Fast Flow(2.4cm x 30cm) 洗脱液A(0．05 mol／L Tris·HCl缓冲液，pH：7．5)；洗脱液B(0．05 mol／L Tris·HCl缓冲液，pH=7.5，含有1.0mol/LNaCl)。

2 斜面培养基的制备

（1）配方：牛肉膏 3.2g 蛋白胨 1g NaCl 5g, 琼脂1.5g-2.5g, 调整 pH 至 7.2-7.4 配制100 毫升

（2）棉塞的制作及分装 ： 分装于8支试管（多余备用）

（3）灭菌 ： 加压蒸汽灭菌法：应用高压蒸汽灭菌器，加压至1.05kg/cm2 即温度达 121.3℃，15～20 分钟，可杀灭细菌芽胞和各类微生物 。 （4）摆斜面 3 菌种的活化

将保存的菌种转接到斜面培养基 , 37 ℃培养24 h ,备用 。 3.1种子培养基的配制

种子培养基： 蛋白胨 1 % ,酵母浸出物 0. 5 % ,氯化钠 1 % ,自然 pH 3.2枯草芽孢杆菌的接种及培养

取一环活化的菌种 ,接入装量为 50 mL 种子培养基的 250 mL 三角瓶中 ,37 ℃,180 r/ min 培养18 h 。

4 液体发酵培养基的制备

（1）配方：葡萄糖15g/L，酵母浸出物5g/L,MgSO4 5g/L,pH 7.0 ，200ml。

（2）分装 ：分装于4个作好标记的250ml摇瓶中，每瓶50ml，灭菌后备用。

（3）灭菌：加压蒸汽灭菌法：应用高压蒸汽灭菌器，加压至 1.05kg/cm2 即温度达 121.3℃，15～20 分钟，可杀灭细菌芽胞和各类微生物 。 （4）菌检24 小时，确定灭菌效果。 4.1液体发酵培养基的接种及培养

在超净工作台上，从斜面接种两环已活化的枯草芽孢杆菌于发酵培养基中， 37℃ 210 r/min 摇床培养48 小时。

5、蛋白酶活力的测定 （Folin-酚法）

测定方法参见国标蛋白酶活力测定方法。

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5.1材料

5.1.1福林试剂

(钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂、液溴);碳酸钠;三氯乙酸(TCA ) ,氢氧化钠、盐酸(以上均为分析纯);干酪素、酪氨酸等为生化试剂。 5.1.2福林试剂的配置

于2000mL磨口回流装置内，加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)20g，钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)5g,蒸馏水140mL，85%磷酸10mL，浓盐酸20mL，文火回流10h。取去冷凝器，加入硫酸锂(Li2SO4)10g，蒸馏水10mL，混匀，加入几滴液体溴，再煮沸15min，

以驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色，需要再加几滴溴液，再煮沸除去之。冷却后，定容至250mL，用细菌漏斗(No4～5)过滤，置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。 5.1.3 0.4mol碳酸钠溶液

称取无水NaCO3 10.6g,定容250ml。

5.1.4 0.4mol三氯乙酸（TCA）溶液

三氯乙酸（TCA）16.4g，定容250ml。 5.1.5 PH7.2磷酸盐缓冲溶液

称取磷酸二氢钠（NaH2PO4）7.8g，定容250ml，即成0.2mol溶液（A液）。 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4）18.0g，定容250ml，即成0.2mol溶液（B液）。

取A液28ml和B液72ml，再用蒸馏水稀释一倍，即成0.1mol/LPH7.2磷酸盐缓冲溶液100mL。 5.1.6 2%酪蛋白溶液

准确称取干酪素2g，准确至0.002g，加入0.1N氢氧化钠10ml。在水浴中加热使溶解，（必须用小火加热使煮沸），然后用PH7.2磷酸盐缓冲溶液定容至100ml即成。配置后应立即使用或者放入冰箱保存，否则极易繁殖细菌，引起变质。 5.1.7 100ug/mL酪氨酸溶液

精确称取在105OC烘箱中烘至恒重的的酪氨酸0.1000g，逐步加入6mL 1mol/L的盐酸使溶解，用0.2mol/L的盐酸定容至100mL，在吸取此溶液10mL，以0.2mol/L定容至100mL,即配成100ug/L的酪氨酸溶液。配置后应立即使用或者放入冰箱保存，否则极易繁殖细菌，引起变质。 5.2蛋白酶活力的测定

5.2.1酶活力定义:在40 。C , pH 7.2条件下，1 mL发酵水提液在1 min内水解酪蛋白产生lμg酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位(U)，单位为U/mL。转换成U/g单位时需除以样品干物质的含量。

5.2.2酪氨酸标准曲线：

5.2.3按下表配置不同浓度的酪氨酸溶液（表1）

5.2.4测定步骤

取6支试管编号按表1分别吸取不同浓度酪氨酸1mL,各0.4mol/L碳酸钠5mL，再各加入已稀释的福

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林试剂1mL。摇匀置于水浴锅中。40C保温发色20min，用722型分光光度计进行测定（波长660nm）。

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一般三次，取平均值。将1~6号管所测得的吸光值（A）减去1号管（蒸馏水空白试验）所测得的吸光值为净值A值。如表2 表2 试剂 管号 1 按表1制备的不同浓度1 酪氨酸，mL 0.4mol/L Na2CO3,mL 5 福林试剂，mL 吸光值(A) 净A值 1 2 1 5 1 3 1 5 1 4 1 5 1 5 1 5 1 6 1 5 1 以1号试管为空白在660nm下测定其吸光值，以A为纵坐标，以酪氨酸含量为横坐标，制作标准曲线

10.80.60.40.20020406080100浓度mol/L

6.发酵培养条件的优化

配制液体发酵培养基1500mL分装入250mL的锥形瓶中，每个25mL。 （1）培养时间（生长曲线）

按接种量为 2%(v/v)（0.5mL）取液体种子于含有发酵培养基（25mL）的三角瓶中，以30℃、150 r/min下摇瓶培养24h。培养期间于2h、4h、6 h、8h、10h、12 h、14 h、16h、18h、20h、22 h、24h时分别取样，于4000 r/min离心15min。并用 pH 计测定发酵液 pH 值。绘制生长曲线，确定获得最大酶活力时的培养时间。

（2）、接种量对菌株产蛋白酶的影响

接种量的多少对微生物生长发酵周期和目标酶的产量都有较大影响。接种量偏小，生长周期缓慢，发酵周期延长，不利于产酶。接种量偏大，减少了培养基成分的有效利用率，使得发酵环境恶化，改变产酶时间及酶活水平。因此，恰当的接种量，不但可以缩短发酵周期，而且还能获得较高的产酶水平。

实验分别以 1%、3%、5%、7%、9%的液体种子的接种量（V/V）接种发酵培养基。于30℃，150 r/min 进行发酵产酶培养（培养时间为生长曲线测定时得到的时间）。发酵液于4000 r/min离心15min获得上清液，分别测定其酶活，确定最佳接种量。 （3）、初始 pH菌株产蛋白酶的影响

初始 pH 作为微生物生存的外部环境之一，对其发酵也有一定的影响。使用NaOH（0.1mol/L）或 HCl（0.1mol/L）溶液，调整培养基的起始 pH为5、5.5、6、6.5、7、7.5、8

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之间。以（2）中确定的最佳接种量接种培养基，于30℃，150 r/min 进行发酵产酶培养（培养时间为生长曲线测定时得到的时间）。测定不同初始 pH 条件下摇瓶操作培养，收集发酵液，于4000 r/min离心15min获得上清液，分别测定蛋白酶活力。确定最佳pH。 （4）、发酵温度对菌株产脂肪酶的影响

不同的发酵温度对微生物生长及代谢产物的分泌有很多的影响。实验按（3）中确定的最佳pH配制发酵培养基，以（2）中确定的最佳接种量接种培养基，分别于25℃、30℃、35℃、40℃条件下，150 r/min 进行发酵产酶培养（培养时间为生长曲线测定时得到的时间）。收集发酵液，于4000 r/min离心15min获得上清液，分别测定蛋白酶活力。确定最佳培养温度。 7． 样品的测定 7.1粗酶液的提取:

液态发酵：量取一定量(1mL)的发酵液在离心机中以4000r/min离心10min。 7.2 测定

取上述上清液(粗酶液)用pH 7.2的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液稀释50倍(估计酶活力而定)。准确吸取样品稀释液1.00 mL分别于洁净干燥的试管编号1、2中，加入1.00 mL新鲜配制的2%酪蛋白溶液1.00 mL，准确反应10 min后快速加入0.4 mol/L三氯乙酸（TCA）2.00 mL，以终止反应，继续置于水浴中保温20 min，使残余蛋白质沉淀，过滤，然后另取洁净干燥的试管，于每管内加入滤液1.00 mL，再加0.4 mol/L碳酸钠溶液5.00 mL和已稀释的福林试剂1.00 mL，摇匀，40 0

C保温发色20 min后，在660 nm处进行测定其吸光值。 其中空白试验也取两支试管编号A、B测法同上，只是在加酪蛋白之前先加0.40 mol/L TCA2.00 mL，使酶失活，再加入酪蛋白计。（如表3） 表3

计算公式如下：

式中:△A660——样品测定与空白实验光密度之差； K——A660为1时在标准曲线上对应的酪氨酸的浓度; 4——4 毫升反应液取出 1 mL 测定 (即 4 倍); N——酶液稀释的倍数; 10——反应 10min;

8．、酶的分离纯化

实验组 试剂 预热酶液,mL 试管1 1 试管2 1 1 对照组 试剂 作用时间10min(精确) 0.4moL/L三氯乙2 酸（TCA），mL 2 1 1 试管A 1 2 试管B 1 2 预热2%酪蛋白，1 mL 蛋白酶的分离纯化

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8.1液体发酵生产蛋白酶

利用小型发酵罐在实验得到的最适发酵培养基和培养条件下，利用上述枯草芽孢杆菌生产蛋白酶。 8.2盐析 8.2.1试剂的配制

pH7.5 磷酸盐上样缓冲液 (0.02mol/L)

称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O)6.02g 和磷酸二氢钠 (NaH2PO4·2H2O)0.5g 以蒸馏水溶解定容至1000mL。 8.2.2盐析处理

取42小时发酵液在4℃下8000r/min离心10min，收集上清液，分成15份，每份50ml，加硫酸铵分别至20%, 30%, 40%, 50%, 60% , 70% , 80% , 90%饱和度（边搅拌边徐徐加入适量硫酸铵，该步骤应在5-10min中完成，继续搅拌10min），静置4h左右，并保证在低温条件下对粗酶液进行沉淀，便可得到不同饱和度下的蛋白质沉淀分别测定上清液及其沉淀蛋白（沉淀先用与上清液等体积0.02mol/L pH7.5磷酸缓冲液溶解再测酶活）的酶活，确定硫酸铵沉淀最适饱和度。绘制硫酸铵盐析曲线。 8.3脱盐

利用最适硫酸铵浓度盐析得到蛋白酶沉淀注入到透析袋中，将袋的开口端用线扎紧，然后悬挂在盛有蒸馏水的烧杯中，每隔20分钟更换蒸馏水一次，经过数小时，则可观察到透析袋内出现轻微浊，此即为蛋白质沉淀。继续透析至取1mL滤出液滴人BaCl2溶液中无沉淀析出为终点。 8.4浓缩

将要脱盐的蛋白溶液放入透析袋（透析袋截留分子量大于500Da），结扎，将透析袋埋人20%聚乙二醇中，放入4OC冰箱保存，每隔一4h重新加入聚乙二醇，对样品进行浓缩。

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