Snapshot技术平台(中文)

Snapshot技术平台

SnaPshot技术平台是Applied Biosystems,ABI公司推出了专为检测 SNP 设计的分析软 件和试剂盒可对多个 SNP 位点同时进行基因分型 ,也被称为 minisequencing 。该方法针对不同突变位点设计不同长度的引物SNaPshot 反应后 ,产物通过电泳分离、五色荧光检测、Gene mapper 分析 ,可在 一次电泳胶 内检测 多个 SNP位点。这个平台是建立在3730，3130等PCR测序仪上的技术。 3730XL型DNA序列检测仪

一. SnaPshot工作原理

应用 SNaPshot 进行定点的序列分析 ,其基本原理遵循了DNA 直接测序中的双脱氧终止法 ,所不同的是 PCR 反应中只有不同荧光标记的ddNTP。由于每个 SNP 位点的引物 3′端都紧靠SNP点 ,因此每一种引物在聚合酶作用下 ,根据模板的的序列 ,只延伸一个核苷酸。然后用先进的荧光检测系统 ,检测延伸的那个核苷酸的种类。

1．多重SNaPshot反应的工作原理： 在一个SNaPshot反应体系中， 针对每个待测SNP 位点 在其上游或下游设计一条单向的寡核苷酸引物（正向引物或反向引物） ，引物的Tm 值要求在50度以上 ，在 AmpliTaq聚合酶和 4种不同荧光标.记的ddNTP存在的情况下,各条引物与各自互补的DNA 模板结合, 聚合酶在引物的3’末端延伸单个碱基反应即告终止, 产物的长度为引物长度+1bp。延伸的碱基就是该样本在该位点上的基因型 ，其中纯合子表现为单峰，杂合子表现为双峰 。为了能够分辨不同SNP的不同基因型，可在引物的5’末端加上不同长度的Poly C 或Poly T，使各条引物以长度区分。经电泳将其分开。最短的引物一般设定为20bp, 相邻两个SNP的引物之间长度一般相差 4-6个核苷酸，以便区分。 多重

SNaPshot反应即利用引物间长度的差异和单碱基延伸4种荧光标记的ddNTP 而最终达到

区分不同SNP 位点的作用, 一次反应可以同时对4-5个SNP进行基因分型, 是一种通量较高的基因分型的方法。

图1 SnaPshot实验原理图解

2．多重SNaPshot反应的工作通量

工作的进度取决于多重PCR和EXTENSION的条件优化过程。还有测序仪的通量也是很重要的，3730每天可以做16次96道电泳，如果每次出4个位点，那每天的通量就是6000个GENOTYPING，是中等通量的检测。

二. SnaPshot工作流程

1． 引物的设计

SNAPSHOT可以检测多重的SNP，我们一般选择4－5个位点做一个组合。现对这些目的SNP进行引物的设计。每个SNP设计3条引物，其中2条是目的片段的扩增，长度在200－500bp左右，Tm值在60度左右。第3条的引物的是延伸ddNTP,设计在SNP位点的上游或者是反向的下游。 引物设计注意事项：

1． 2． 3．

同一反应管中，不同位点的引物长度必须不同，最好能相差4-6个碱基。 引物与模板互补部分（有效引物）的Tm值至少要50 ?C。

为了改变引物的长度，区分不同的位点，可以在引物的5’端加poly(dT)、poly(dA)、poly(dC)或者poly(dGACT)尾巴。这四种尾巴理论上不容易形成二级结构，并且都经过实验验证。小心：poly(dT)有可能与真核基因3’端的poly(dA)尾巴互补。

4．

引物在毛细管中的迁移受引物长度、碱基组成、标记的荧光染料等因素影响。引物越短，影响越显著，越有可能偏离仅仅根据片段长度预期的引物迁移距离。当引物长度小于36个碱基时，ABI强烈建议用户使用Primer Focus试剂盒做预实验，确定各种引物在多重电泳中的精确迁移距离。

5．

合成长度大于30个碱基的引物时，建议采用HPLC方法纯化。

6． 在引物设计的时候，如果+链DNA的序列不理想，难以设计出最佳引物，请使用-链DNA设计引物。

进行多重 SNaPshot 反应时 ,需多条引物和多个模板同时进行。为了保持反应的一致性 ,对引物的设计要求是尽量保持相近的Tm 值 ,否则会引起非特异性产物的扩增 ,造成碱基误读。另外 ,反应混合液中不同模板和其对应引物的量还应选择合适比例。与单重 SNaPshot 反应相比 ,多重反应不但节省了反应时间 ,还大大减少了试剂用量 ,降低了反应成本。 位点 SNP1 SNP2 SNP3 SNP4 位点 延伸引物 TM 60.4 62.1 60.4 方向 R L L L 产物长度 20 25 30 38 Nts added A/G C/T A/G C/G SNP c/t C/T A/G C/G PCR LEFT PRIMER GAGCCAGAGGAGGATGTTGA ACGTTGCAGTTGCCTTTCTT CCTTGATACCACGTGCATTG TCAAGCCCAGTCCTTTCTGT TM PCR RIGHT PRIMER TM 长度 248 210 185 296 60.35 GGCTAGAAGGAGCGAGGACT 60.12 59.92 GACTCTGCAGTGAGGCCCTA 60.55 59.99 TTCTTCAGCCTCTGCCATTT 59.96 59.84 CCCAATAGCCGTATCTGGAA 59.92 SNP1 CGATCATAGTCAGCTGGCCT SNP2 cccccccc-GGCACGGTACCTGGGCT SNP3 cccccccc-TCATCAATTGCTGAGGACAGAG 2． 片段扩增

引物稀释,将2OD的引物稀释到100mM. 加入的TE的量为660000/MW

如分子量为7003，则加入 660000/7003=94.2ul 做试验前将一组的引物加DDH2O稀释成10mM.

SNP4 ccccccccccccc-AACTCTGGGAGATTCTCCTATTGAC 60.36 反应体系：

用 量 10×Buffer (15Mm Mg2＋) 1 ?L Primer (10Mm) 0.4 ?L dNTP(10Mm) 0.3 ?L HotStar (5u/ul) 0.1 ?L DNA 1 ?L Mg2＋ (25Mm) 0.52 ?L

ddH2O 6.68 ?L Total Volume 10 ?L

多重PCR反应采用Touch－down的 PCR反应程序: 95 ℃15 min;

94 ℃40 s, 63 ℃1 min 每个循环下降0.5 ℃ ,72 ℃1.5 min,1 5个循环; 94 ℃40 s,56 ℃40 s,72 ℃1.5 min, 25个循环; 72 ℃8 min; 结束后4 ℃保存。

PCR产物经琼脂糖电泳检测有片段的表明实验成功。 多重PCR产物凝胶电泳

3． PCR产物的纯化

多色SNP实验的模板DNA可以是质粒，也可以是PCR产物(0.01到0.4 pmol)。质粒可以直接用于反应，但PCR产物必须先作好纯化，SAP酶将残余 dNTPs去磷酸化, ExoI降解游离单链引物。

（1）纯化酶：

SAP和Exo I （2）作用原理：

SAP 去除多余的dNTP和引物

Exo I 去除单链引物和其他单链DNA产物 （3）反应体系：

PCR产物6?L＋2?L酶混合液（含2U SAP和2U ExoI），振荡混匀 （4）反应条件：

37 ?C 孵育保温1 hr，然后75 ?C 保温15 min以灭活SAP和Exo I酶。 纯化好的模板可以在4 ?C保存24 hr或-20 ?C长期保存。

4．SNaPshot PCR

混合模板： 如果以PCR产物作为SNaPshot PCR的模板，在纯化好后，每种各取2 ?L，混合。

混合SNaPshot的PCR引物：每种引物在反应体系中的终浓度分别为0.2 ?M。

混合SNaPshot的PCR引物：每种引物在反应体系中的终浓度分别为0.2 ?M。(每个SNP引物加1-2ul到500ulDDH2O中)

SNaPshot PCR：

用量 (?L / Sample)标准品 (?L) Reaction Mix 0.5 5 Pooled PCR Products 2 2 Pooled Primers 1.2 1 dH2O 1.3 2 总体积 5 ?L 10 ?L

PCR循环条件为：

96 ?C 10 sec ? (96 ?C 10 sec ? 50 ?C(53?C)5 sec ? 60 ?C 30 sec) ? 25循环 ? 60 ?C 30 sec ? 4 ?C

5．SNaPshot PCR产物的纯化

在5 ?L上述SNaPshot PCR产物中加入0.5USAP或者1 U CIP，震荡混匀，37 ?C 保温

1 hr，75 ?C 保温15 min以灭活酶，4 ?C可保存24 hr或-20 ?C长期保存。 6．310、3100、3730电泳样品制备

试 剂 Hi-Di Formamide GS-120 LIZ SNaPshot产物 总体积

用量 (?L) 9.25 0.1 1 10.35 ?L

95 ?C变性 5 min ? 迅速冰冷4 min。

每个电泳样本都加入了LIZ－120内标，使延伸片段的长度大小可以精确定位。

110

120

15 20 25

35

50 62 80

图2，liz-120分子内标电泳峰形 7．GeneMapper4.0软件分析

图3.不同样本多重SNAPSHOT电泳结果

图4. 1个SNP位点的不同样本的基因型结果，G/A,AA,GG 软件分析后输出数据结果 Sample Name LH005 LH006 LH007 LH009 LH010 LH012 LH014 LH017 LH019 LH020 LH022 LH024 LH025 LH027 LH028 Marker RS1010 RS1010 RS1010 RS1010 RS1010 RS1010 RS1010 RS1010 RS1010 RS1010 RS1010 RS1010 RS1010 RS1010 RS1010 Allele 1 G G A G G G G G G G G G G A A Allele 2 A A A A A A A 三 SnaPshot技术平台的优点

1． 引物和探针合成周期短，国内一周之内可以合成完毕。 2． 可以做多重的SNP检测，降低了成本。

3． 样本数量要求不要，100到1000的样本量都很适合。 4． 位点成功率和准确率>95％。

图4. 1个SNP位点的不同样本的基因型结果，G/A,AA,GG 软件分析后输出数据结果 Sample Name LH005 LH006 LH007 LH009 LH010 LH012 LH014 LH017 LH019 LH020 LH022 LH024 LH025 LH027 LH028 Marker RS1010 RS1010 RS1010 RS1010 RS1010 RS1010 RS1010 RS1010 RS1010 RS1010 RS1010 RS1010 RS1010 RS1010 RS1010 Allele 1 G G A G G G G G G G G G G A A Allele 2 A A A A A A A 三 SnaPshot技术平台的优点

1． 引物和探针合成周期短，国内一周之内可以合成完毕。 2． 可以做多重的SNP检测，降低了成本。

3． 样本数量要求不要，100到1000的样本量都很适合。 4． 位点成功率和准确率>95％。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/8kn.html