LIF下游几条并行的信号通路可以调节维持胚胎干细胞的多能性

LIF下游几条并行的信号通路可以调节维持胚胎干细胞的多能性 白血病抑制因子（LIF）信号通路可以维持小鼠胚胎干细胞多能性。尽管Jak-Stat3在介导LIF信号传递中发挥重要作用，但始终不清楚这些信号是怎样与干细胞多能性相关的转录因子如Oct3\\4,Sox2,Nanog联系起来的。我们发现两条LIF相关的信号通路通过转录因子相连。在小鼠胚胎干细胞中，Klf4主要是通过JAK-STAT3信号通路被激活，再优先激活Sox2 ；然而Tbx3主要是通过PI3K-ATK和MAPK-ERK信号通路被激活，再激活Nanog .在没有LIF时，只要维持Oct3\\4表达，Klf4或者Tbx3表达就足够维持胚胎干细胞的全能性。很显著的是，没有Klf4和Tbx3活性时，Nanog过度表达就可以使小鼠胚胎干细胞仅依靠LIF通路维持自我更新。所以Klf4和Tbx3可以介导LIF信号传递到核心通路，但并不直接参与维持干细胞多能性。因为在特别情况下，没有Klf4和Tbx3表达就可以维持干细胞全能性。

传统培养条件下，小鼠胚胎干细胞自我更新依赖于LIF激活信号转导因子Gp130 ;没有LIF就会导致干细胞分化。但是若有人为激活Stat3或Nanog过表达就足以维持干细胞自我更新。Stat3通过与Gp130相关的Jak激酶被激活，但是其与Nanog间的关系还不是很清楚。生物信息学研究一些转录因子可以假定为核心转录因子的靶标。在这些转录因子中发现在没有LIF时，Klf4和Tbx3有能力维持OCRG9细胞（来源于E14tg2a的Rex1-Gfp-BSD\\Oct3\\4-Ecfg-pac胚胎干细胞），与Nanog类似。这些干细胞在有嘌呤霉素的条件下生存说明Oct3\\4

启动子有效促进转录翻译表达，但是绿色荧光蛋白的表达量要比原来的ES低。Klf4编码锌指转录因子，作为与Oct3\\4和Sox2辅助因子激活一系列靶基因，用于维持体细胞多能性，延迟胚状体培养条件下的细胞分化。通过RNA干扰介导的功能缺失研究显示Tbx3编码T-box转录因子用于维持干细胞多能性。把这些基因中的一个完整转染到MGZ5胚胎干细胞中（来源于CCE）有助于形成不依赖于LIF的克隆。然而用可以使转基因高表达的episomal Vector系统将Tbx3和Klf4转进MGZ5胚胎干细胞中，却没有获得稳定的转染细胞，说明这与基因的表达量密切相关。

没有LIF仅通过Klf4,Tbx3或者Nanog维持自我更新形成的胚胎干细胞表型与LIF存在下形成的表型相似。生长速度比LIF存在下要慢，但是可以在体外维持恒定生长速度稳定传代一个月以上。当FLOXED的Klf4基因转染到ES细胞中在没有LIF存在的条件下也可以维持生长一个月。当含有cre重组酶的载体转染到胚胎干细胞中，会将Klf4基因剪切掉。DsRed基因被激活，细胞重新依赖于LIF并恢复形成胚状体的能力。这些胚胎干细胞注射到囊胚，再移植到假孕母鼠的子宫会产生嵌合鼠。而表达DsRed的细胞会存在于整个胚胎部分。对于Tbx3观察到相同的结果。这两种情况在转入的基因去掉以前，不加LIF也能在有Jak抑制剂或显性负的Stat(StatF)稳定表达时生长。这些结果显示：和Nanog一样，Klf4或Tbx3表达足以维持胚胎干细胞在没有LIF存在的条件下生长。

为了研究这些具有相同功能活性的转录因子相互之间是怎样联

系的，我们检测了不加LIF培养4天的转基因胚胎干细胞，内源性基因表达水平。Stat3靶标基因Socs3表达下降或者是Stat3失去活性说明移除了LIF信号。在三个转基因胚胎干细胞系中Oct3\\4表达量都维持在正常水平。但是，在Nanog-和Tbx3-ES细胞中Sox2表达量与在不加LIF条件下培养4天的ES细胞相比有明显不同。这说明并转基因细胞并没有维持Sox2表达；然而Tbx3-ES细胞却可以维持Nanog表达。因为先前我们曾发现Sox2独特功能就是可以维持Oct3\\4表达，在Nanog-和Tbx3-ES细胞中做出来的结果说明除Sox2外，Nanog也可以维持Oct3\\4表达。Tbx3可以在Tbx3-ES细胞中表达，不在另外两种细胞中表达；但是三种细胞都不表达Klf4.三种细胞中Tbx3,Nanog和Klf4的表达特点通过蛋白水平上的检测得到验证。这些研究结果表明三种转录因子发挥作用有先后等级特点，即Tbx3和Klf4是上游，Nanog在Klf4的下游，使得Oct3\\4表达维持干细胞自我更新。在有些转基因胚胎干细胞中可以观测到多种全能性相关基因调节其自我更新。

胚胎干细胞免疫染色实验显示Tbx3,Nanog和Klf4表达情况不同。为了分析三种基因表达特点，我们用Rex1标记系统区分两种胚胎干细胞。正如前面报道的：80%OCRG-ES细胞表达绿色荧光蛋白，可以用来检测Rex1表达。我们发现分别有75%，50%，30%的胚胎干细胞表达Klf4,Nanog和Tbx3,三种转录因子都表达的细胞占到24%。三种转录因子核定位特点的微弱联系说明胚胎干细胞全能性维持并不仅仅依赖于传统培养基中LIF信号转导通路，还有其他信号发

挥作用。然而通过检测Oct3\\4-CFP复合物表达，显示几种胚胎干细胞中Oct3\\4表达情况相同。所以尽管三种转录因子的表达有波动，到最后Oct3\\4表达是恒定的，用以维持干细胞自我更新。

能够取代LIF维持干细胞自我更新说明这些转录因子和LIF具有相同的生理学特性。为了检验这些特性，我们测定了在有LIF信号时的转录特点。ES细胞在不加LIF时培养21个小时以彻底去除LIF信号干扰，测定显示Socs3，Klf4,Nanog和Tbx3表达但是Sox2和Oct3\\4不表达。然后加入LIF,测定显示这些基因都表达。Stat3直接联系的基因Socs3在0.5h时表达量上调，2h后下降最后维持在恒定水平。Klf4经历了相同的过程，但是上升量要小。但是这段期间内Tbx3和Nanog并没有明显变化说明三个基因中Klf4是通过LIF信号调控的。

同时我们评估了可以激活这些基因表达的细胞内信号通路。LIF信号激活Jak-Stat3,PI3K-Atk和MAPK三条信号通路。它们中仅Jak-Stat3只通过LIF信号调控，其它两条都通过多种信号调控。在LIF信号刺激以前，我们用每个信号通路的特异性抑制因子培养细胞，再通过Western Blot检测产生的影响。加入Jak通路抑制因子培养的细胞，1h后Socs3表达量不再上升；其它几种抑制因子对其表达量没有影响，说明Socs3表达通过Jak-Stat3通路调节。Jak抑制因子也Klf4表达量不再上调。24h时，加有MAPKK抑制因子培养的细胞中Nanog和Tbx3表达量升高。对Jak-Stat3依赖性的微小差别通过ES细胞中Stat3活性的调整得到验证。不加LIF，含有Stat3ER基因的胚胎干细胞在有4HT或没有4HT的条件下培养4天（4HT可以激活Stat3ER

表达）。与在LIF培养条件下，基因表达水平相比较。结果显示Stat3ER基因表达可以维持Socs3和Klf4表达，不能维持Tbx3和Nanog表达。如果Stat3负向形式过度表达使Stat3基因失活，Socs3,Klf4和Nanog表达被抑制而Tbx3表达不受影响。这说明Tbx3不只是通过Stat3进行调节。

胚胎干细胞中PI3K-Atk通路部分通过LIF调节，还可以被胰岛素\\胰岛素样生长因子和Eras(ES细胞表达的Ras)被激活。为检验其对基因表达的影响，我们分析在没有LIF的条件下ES细胞内正常基因表达水平是通过活化Atk维持的。这些细胞中Nanog，Tbx3和Oct3\\4正常表达，但是Klf4和Sox2不可以。这些基因的表达特点与Tbx3-ES细胞中很相似。这结果与Nanog通过PI3K-Atk通路调节的报道是一致的，同时也说明Tbx3也部分通过PI3K-Atk进行调节。

然而为什么在有MAPKK抑制因子的条件下，后期阶段LIF会上调Tbx3和Nanog的表达量呢？ES细胞中成纤维细胞生长因子激活MAPK信号通路破坏其全能性，完全抑制MAPKK和GSK3β足以在没有LIF存在的条件下维持干细胞全能性。同时我们发现在这样的培养条件下可以维持Tbx3和Nanog表达，抑制MAPKK会使Tbx3蛋白从8h开始在细胞核内堆积等到24h达到最大值。因为Tbx3-ES细胞中可以表达内源性Tbx3,Tbx3可以自动调节。所以如果MAPK信号通路可以使Tbx3向核外输出，抑制MAPK信号通路可以使Tbx3在核内累积，通过自我调节维持Tbx3持续表达。多种信号调节Tbx3在细胞核内的定位如在饲养层上培养的胚胎干细胞核内积累Tbx3蛋

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