用16S rDNA方法鉴定细菌种属 - 图文

用16S rDNA方法鉴定细菌种属

一、实验目的

1. 掌握16S rDNA对细菌进行分类的原理及方法；

2. 掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等实验操作。

二、实验原理

细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中。

16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。

16S rDNA是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大（约占细菌RNA含量的80％），分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。在大多数原核生物中rDNA都具有多个拷贝，5S、16S、23S rDNA的拷贝数相同。16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。

16SrRNA的编码基因是16SrDNA，但是要直接将16SrRNA提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase降解，因而利用16S rDNA鉴定细菌，其技术路线如下： 细菌培养液 连接克隆载体 DNA提取 基因组DNA 阳性克隆鉴定 PCR扩增 16S rDNA片段 片段回收 测 序

细菌基因组的提取：

菌体破碎 PCR的基本原理 ：

PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引 物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

得到胞内可溶物质 分离出DNA 纯化DNA

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制 链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

二、操作步骤

1、细菌基因组DNA提取； 2、PCR扩增；

3、细菌基因组DNA及PCR产物的电泳检测； 4、扩增片段回收； 5、DNA片段测序。 三、结果处理与分析

在回收扩增片段时，紫外灯下条带呈现绿色荧光，将凝胶中绿色荧光部分切割分离出来，放入已称重的2ml离心管中，空的离心管为1.02g，放入回收的凝胶后为1.42g，，则凝胶为400mg，因此加入的Binding Buffer为1200μl。

我们小组选用B1 16S sequence，以下为制作进化树过程：

1、根据B1 16S 基因序列，到NCBI 上比对，确定其种属

（1）NCBI 主页（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）依次点击进入BLAST

（2）选择nucleotide BLAST

（3）将B1 序列复制到文本，框里Choose Search Set 处点复选按钮others，最后点BLAST

（4）点击BLAST后，数据进行提交。BLAST 结果如下：

图中“Evalue” 指标与其他指标不同，它的数值越小相似程度越高，其他几个（如Totle score）都是数值越高相似度越高。

我组将数据按照Query cover从100%开始从大到小排列，从不同相似度一共选出14组数据。 （5）导出数据

数据导出格式选择FASTA：

（6）选择大肠杆菌作为外属，导出大肠杆菌

（7）下载MEG并安装，我组使用的是MEGA5.02，并将B1序列导入MEG

（8）通过Edit中的Copy及Paste将B1序列和大肠杆菌序列导入我们选中的14个序列中

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/8k1t.html